Summary
Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.
Abstract
Es wird zunehmend deutlich, dass Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich ionotropen GABA A-Rezeptoren (GABAAR), Ausstellungshochdynamischen Handel und Zelloberfläche Mobilität 7.1. Rezeptorzelloberflächenlokalisierung und Endozytose zu untersuchen, die hier beschriebenen Verfahren kombiniert die Verwendung von Fluoreszenz-α-Bungarotoxin-Zellen, die mit Konstrukten, die eine α-Bungarotoxin (Bgt) Bindungsstelle (BBS). Die BBS (WRYYESSLEPYPD) an der α-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Muskeln, die mit hoher Affinität Bgt 8,9 bindet. Einbau des BBS-Website ermöglicht Fläche Lokalisierung und Messung von Rezeptor Einsetzen oder Entfernen mit Applikation exogener Fluoreszenz Bgt, wie zuvor in der Verfolgung von GABAA-und GABAB-Rezeptoren 2,10 metabo beschrieben. Neben der BBS-Website, die zwischen den Aminosäuren 4 und 5 des reifen GABAAR Untereinheit durch Standard m eingesetzt wir eine pH-sensitive GFP (pHGFP 11)olecular Biologie und PCR-Klonierung Strategien (siehe Abbildung 1) 12. Die BBS ist 3 'der pH-sensitive GFP-Reporters durch ein 13-Aminosäure Alanin / Prolin-Linker getrennt ist. Für Handel in dieser Veröffentlichung, die auf festen Proben basieren beschriebenen Studien, die pHGFP dient als ein Reporter der Gesamt getaggt GABAAR Untereinheit Protein-Ebene, so dass eine Normalisierung der Bgt markierten Rezeptor Bevölkerung insgesamt Rezeptor Bevölkerung. Dies minimiert Zelle zu Bgt Färbung Signalvariabilität von höheren oder niedrigeren Ausgangs Ausdruck der markierten Untereinheiten GABAAR resultierende Zell. Außerdem die pHGFP Tag ermöglicht eine einfache Identifizierung der Konstrukt exprimierenden Zellen für Live-oder Fest Imaging Experimenten.
Introduction
Die Verwendung von fluoreszenz gekoppelt α-Bungarotoxin Rezeptor Lokalisation und Dynamik zu studieren wurde in Studien der Nikotinacetylcholinrezeptor 13-15, endogenen Ziel des Toxins Pionierarbeit geleistet. Anschließend Einbau des minimalen Bgt bindende Peptid (BBS) wurde genutzt, um Menschenhandel beider erregenden und hemmenden Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 2,10,16-21 studieren. Das BBS-basierte Technik bietet Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für den Menschenhandel Studien wie Oberflächen Biotinylierung Methoden, Antikörpermarkierung von lebenden Zellen mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Epitope und Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) verwendet. Während Zelloberflächen Biotinylierung freien Amine kovalent modifiziert, mit dem Potential, die zelluläre Aktivität beeinflussen. Antikörper basierte Studien haben oft durch Oberflächenantigen Clustering oder Deckelung, die Menschenhandel Ereignisse verändern kann behindert. Aufgrund der Bleichstufe für FRAP sTUDIEN, ist ein wichtiges Anliegen Beschädigung der zugrunde liegenden zellulären Struktur. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass BBS-markierten Konstrukte können auch für biochemische Methoden mit Biotin-gekoppelten Rezeptor Bungarotoxin zu beurteilen Handel verwendet werden. Dieses Verfahren ist leicht auf Zelllinien und Primärzellen. Zur Verwendung in Zellen, die nikotinergen Acetylcholin (nAChR)-Rezeptoren exprimieren, muß die nAChR-Antagonisten Tubocurarin gesamten Protokoll verwendet werden, wie angegeben. Durchführen einer einfachen Oberfläche Bgt Kennzeichnung (entspricht der T = 0 Zeitpunkt für die Endozytose-Protokoll) auf nicht-transfizierten Zellen in Abwesenheit von Tubocurarin wird Nachweis von endogenen nAChR bereitzustellen.
Eine wichtige Überlegung für die Verwendung dieser Technik entsprechende Einsetzen der BBS, so dass es an einer extrazellulären Stelle, wenn das Protein von Interesse an die Plasmamembran geliefert vorliegt. Zum Beispiel können die N-terminalen Domänen von GABAAR Einheiten befinden sich in den Bläschen Lumen während TRAFHandels und werden nach Einsetzen Rezeptor in der Plasmamembran der extrazellulären, so dass spezifische Markierung von Zelloberflächenrezeptoren und die Bewertung ihrer Entfernung von der Zelloberfläche von endozytischen Veranstaltungen. Wir haben früher gezeigt, dass die Zugabe von GFP, myc oder BBS Epitope dieser Domäne GABAAR Einheiten funktionell still. Standardkontrollen durchgeführt werden sollte, um sicherzustellen, dass das markierte Protein wird in ähnlichen Mengen zu einer unbezeichnet Konstrukt exprimiert wird, dass es angemessen lokalisiert, und dass es keinen Einfluss auf die Rezeptorfunktion. Diese Charakterisierung von transfizierten Konstrukte werden auch bei der Fehlersuche die Überexpression Anliegen zu unterstützen.
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Protocol
Alle unten beschriebenen Protokolle sind in Übereinstimmung mit der IACUC und IRB Institutional Review Boards der University of Pittsburgh School of Medicine.
1. Vorbereitung der Hippocampus Neuronale Kulturen in Gewebekultur Hood
Hinweis: Verwenden steriler Technik und Reagenzien während Protokoll 1.
- Vorbereitung Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml in H 2 O) beschichteten Deckgläsern als Substrat für die neuronale Kultur.
- Zeigen 4-5 runden Glasdeckgläschen in jedem 3,5 cm Gewebekulturschale.
- Punkt 70 ul Poly-D-Lysin auf jede 12 mm Deckglas. Hinweis: Für die Live-Aufnahmen, ein Glasboden 3,5-cm-Gewebekulturschale verwendet werden können (vor Ort 200 ul Poly-D-Lysin auf eingebettete 14 mm Deckglas).
- Lassen Sie die zubereiteten Speisen in der Gewebekultur Haube O / N. Um Poly-D-Lysin-Verdampfung zu minimieren und halten sterile Oberflächen in der Gewebekultur Haube, und schließen Sie den Fensterflügel und schalten Sie the Gebläse O / N. Hinweis: UV-Lampen werden während der O / N Inkubation verwendet.
- Am nächsten Morgen, waschen das Geschirr 3x mit 2 ml H 2 O.
- Nach dem Entfernen der letzten H 2 O waschen, 2 ml von Medien, um je 3,5 cm Schale und lassen Gerichte in Inkubator, bis bereit, die Neuronen in Schritt 1.4 plattieren.
- Hippocampus-Neuronen aus embryonalen Tag 18-19 (E18-19) Ratten (von 22 Goslin modifiziert) vorbereitet.
- Transfektion von frisch gewonnenen Neuronen am Tag der Kultivierung mit 1-4 ug maxiprepped DNA-Konstrukt.
Hinweis: typischerweise 3 ug DNA in 1-2 Millionen Neuronen transfiziert mit einer Lebensfähigkeit von 50% und eine Transfektionseffizienz von 60% (z. B. beginnend mit 2 Millionen Neuronen ((2 x 10 6 Neuronen x 0.5) 0.6) sieht ca. 1 Million Neuronen;.. davon 600.000 transfiziert 1 Unterschiedliche Mengen an DNA-Konstrukt kann bei der Fehlersuche potenzielle Probleme von transfiziert werdenÜberexpression, gefolgt von entsprechenden Charakterisierung Konstrukt Lokalisation und Funktion. - Platte der transfizierten Neuronen auf Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser mit einer endgültigen Dichte von etwa 200.000 Neuronen pro 3,5 cm Schale. Hinweis: Für eine Glasbodenschale, Teller 40.000-50.000 Neuronen auf der 14 mm Glasfläche.
- Ersetzen Sie die Medien 4-24 Stunden nach der Herstellung der neuronalen Kulturen, dann lassen Neuronen im Inkubator entwickeln, bis 14-17 Tage in vitro (DIV) oder gewünscht Bühne.
2. Endozytose Assay
ACHTUNG: Hinweis auf α-Bungarotoxin Tubocurarin und Abfallkosten:
- Handhabung aller Peptid Neurotoxine wird innerhalb der Richtlinien der biologischen Sicherheitsstufe-2 (BL-2) Forschungsprotokolle empfohlen. Alle geeignete Schutzkleidung getragen werden. Lyophilisiert Toxin Pulver sollte nach den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert. Toxin Abfall should unter Beachtung der Umweltschutz und Sicherheit Richtlinien der Regierungsinstitution entsorgt werden.
- Um potenzielle Peptidaggregate, die während der Lagerung gebildet haben können, sollten α-Bungarotoxin Aliquots kurz vor Gebrauch zentrifugiert, und der Überstand sollte für den Versuch verwendet werden.
- α-Bungarotoxin (Bgt) Bestände zu einer Konzentration von 1 mg / ml in sterilem H 2 O bei -20 ° C resuspendiert und in 10 &mgr; l Aliquots gelagert Fluoreszenz gekoppelt Bgt Bestände bei 3 pg / ml verwendet. Tubocurarin wird in einer Endkonzentration von 150 &mgr; M verwendet.
- Stellen Sie Tisch Heizblock auf 16 ° C im Kühlraum mit dünnen Aluminium-oder Edelstahlplatte an der Spitze. Alternativ, falls vorhanden, eine Tisch Kühl / Heizvorrichtung kann für jeden Schritt benötigt 16 ° C eingesetzt werden
- Kühlen extrazellulären Hepes-gepufferter Salzlösung (HBS, enthaltend in mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 Glucose, 1,2 MgCl 2, 2,5CaCl 2, pH 7,4) auf 16 ° C in einem Wasserbad.
- Über Neuron Gerichte Aluminiumplatte bei 16 ° C und cool für 5 min.
- Medien entfernen (halten konditionierten Medien-und Reserve in Inkubator für Schritt 2.8, Endozytose Testzeit Punkte) und ersetzen mit 1 ml 16 ° C HBS + Tubocurarin (150 uM) für 2 min.
- Entfernen HBS + Tubocurarin zu beschrifteten Abfallbehälter und ersetzen mit 1 ml 16 ° C HBS + Tubocurarin (150 uM) + α-Bungarotoxin Alexa 594 [3 pg / ml], Inkubation bei 16 ° C für 15 min.
- Entfernen HBS + + Tubocurarin α-Bungarotoxin Alexa 594 Abfallbehälter beschriftet und Geschirr spülen 3x mit 2 ml 16 ° C HBS (die Waschungen kann durch Absaugen im Vakuum-Kolben, der 50 ml 50% Bleichmittel gesammelt werden).
- Für Live-Bildgebung Zeitreihen-Experimenten nach Rezeptor Endozytose mit einem Glasboden-3.5 cm Kulturschale, die Schritte 2.1-2.6, dann Transfer Gericht erhitzt Bühne(Peltier-Vorrichtung) am Mikroskop, und beginnen Sie mit einem konfokalen Imaging-oder TIRF-Mikroskop-Setup.
- Übertragen T = 0 Zeitpunkt Deckgläser in eine Schale von RT 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose für 20 min, weiter mit anderen Deckgläser zu Schritt 2.9.
- Für andere Zeitpunkte, zu ersetzen HBS Anlage mit 37 ° C ins Gleichgewicht Medien (in Schritt 2.4 reserviert) und zum Brutkasten für Endozytose bei 37 ° C. Hinweis: vorgeschlagen, zusätzliche Zeitpunkten T = 15, 30 und 60 auf.
- Zu den Zeitpunkten benötigt, nehmen Sie Gerichte aus Inkubator, schnell waschen zweimal mit 2 ml DPBS RT (DPBS kein Kalzium, Magnesium), dann in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose für 20 Minuten zu beheben.
- Nach 20 min Fixierung, entfernen Sie 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose in Abfallgebinde und Geschirr spülen zweimal mit 2 ml DPBS RT.
- Deck Inkubation bei RT für 10 min in der Immunfluoreszenz Blocklösung (Blocklösung = 5% Pferdeserum, 0,5% BSA in DPBS), enthaltend 0,2% Triton X-100 zu Durchläsize die Neuronen und ermöglichen anti-GFP-Immunfärbung von intrazellulären Rezeptor-Pool und / oder Kennzeichnung von anderen Proteinen von Interesse.
- Entfernen Block + 0,2% Triton X-100 und Inkubation Deckgläser in Immunblock Lösung ohne Triton X-100 für 20-30 min.
- Führen primären Antikörper-Inkubationen von Deckgläsern in Block mehrere Stunden bei RT oder O / N bei 4 ° C. Hinweis: Inkubation von Deckgläsern mit Vorwahlen bei 4 ° CO / N routinemäßig produziert verbesserte Immunfluoreszenz Ergebnisse.
- Wash Deckgläser 3x mit DPBS (5 min für jeden Waschschritt).
- Deck inkubieren mit sekundären Antikörpern in Blocklösung für 1 h bei RT.
- Wash Deckgläser 3x mit DPBS (5 min für jeden Waschschritt).
- Deckmontage, Handhabung jedes Deckglas individuell: Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der Rückseite des Deckglases mit Laborgewebe, dann invertieren Deckglas auf 4 ul Eindeckmedium auf einem Glasträger.
- Veröffentlichung Folien bei RT trocknen abgedeckt 30 min dann stErz bei 4 ° C bis bereit zu Mikroskopie durchzuführen.
- Bildaufnahme und Auswertung des Experiments mit konfokaler Mikroskopie (blind Versuchsbedingung). 60X NA 1.49 Öl-Immersionsobjektiv mit folgenden Lasern: Argongas 488 nm, 561-Diode, 640 Diode.
- Mit den gleichen Einstellungen Bildaufnahme, erwerben einzigen Z Schnittbilder mit der neuronalen Zellkörper und mehrere dendritischen Prozesse im Fokus.
- Quantifizierung von α-Bungarotoxin Alexa Fluoreszenzsignal und GFP-Immunfärbung auf 20 &mgr; m von 3-4 proximalen Dendriten pro Neuron unter Verwendung derselben Schwelle für die Analyse aller Daten Endozytose.
- Analysieren von Daten 10-12 Neuronen für jeden Zeitpunkt, Wiederholung des Experiments mit mehreren unabhängigen neuronalen Kulturen.
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Representative Results
Charakterisierung eines BBS tagged Konstrukt wichtigen Elemente wie die Bestimmung, ob das exprimierte Protein korrekt assembliert (insbesondere Rezeptoren von mehreren Untereinheiten zusammengesetzt), Verkehre auf der Zelloberfläche lokalisiert und geeignet. Hemmende Synapsen von GABA A-Rezeptor-Cluster, die Oberfläche mit der inhibitorischen Gerüstprotein Gephyrin colokalisieren und an präsynaptischen inhibitorischen Terminals, durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter, die GABA und Glycin in synaptischen Vesikeln (VIAAT / VGAT) lädt identifiziert apposed zusammen. In Fig. 2 sind α2pHGFP + BBS exprimierenden Neuronen, die mit Oberflächen GABAAR mit Bgt markiert, gefolgt von Immunfärbung für insgesamt Rezeptorpopulation mit Anti-GFP-Antikörper und entweder der postsynaptischen inhibitorische Gerüstprotein Gephyrin (2A) oder VIAAT (2B).
Figur 3 zeigt die Endocytose von α2, die GABAAR in Neuronen im Hippocampus bei 15 DIV. BGT Fluoreszenzmessungen der einzelnen dendritischen Prozesse wie in den Platten (Fig. 3A) dargestellt werden auf das Niveau der Expressionskonstrukt über die GFP-Antikörper-Färbung. Abschließenden Vergleich der Zeitpunkte durch Normierung auf die T = 0 Messung vorgenommen, wie in Fig. 3B gezeigt. Quantifizierung der Internalisierung der Rezeptoren über einen Zeitraum 60 min (3B) von Fluoreszenzsignal Veränderungen über die Zeit (Mittelwert ± SEM: T0 = 100 ± 7.2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6 und T60 = 19,1 ± 3,4 min t 1/2 = 26 ± 4,8 min)) wurde am besten durch eine einzelne Exponentialfunktion (bei 37 º C beschrieben.
Ein alternativer Ansatz, die in Abbildung 4 dargestellt ist, ist die Endozytose in einem einzigen Neuron folgen die Live-Darstellung von Zeitraffer-konfokale Mikroskopie. Die punktförmige und überlappenden Fluoreszenz der Oberfläche pHGFP getaggt GABAAR und Bgt l abeled Rezeptoren zu Beginn des Experiments (T0) angezeigt. Im Laufe der Zeit natürlich Bgt beschriftet GABA AR-Signal ab, als Rezeptoren Endozytose, während der pHGFP Signal bleibt hoch, da neue Rezeptor-Insertion. Der minimale Rückgang der phGFP Signal ist auf Zelloberflächenrezeptor Verteilung ändert und Ausbleichen.
Abbildung 1. Schema einer BBS und pHGFP getaggt GABAAR-Untereinheit und die Endozytose-Assay. Endozytose folgt zunächst eine fluoreszenzmarkierte Bungarotoxin Neuronen oder Zellen, gefolgt von einer kurzen Wasch um ungebundene Toxin entfernen gemessen, so Fluoreszenzverlust überwacht als Rezeptoren sind verinnerlicht.
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Abbildung 2. Konfokale Bildgebung von BBS und pHGFP getaggt GABAAR zeigt entsprechende Lokalisierung mit hemmenden Synapsen-Komponenten. Oberflächen GABAAR in α2pHGFP + BBS exprimierenden Neuronen wurden mit α-Bungarotoxin Alexa 594 (rot), gefolgt von Immunfärbung gekennzeichnet sind, sind Erweiterungen der Dendriten auf die gezeigten Recht eines jeden Neurons. Zusammengeführt Platte (α-Bungarotoxin Alexa 594 in rot, GFP in grün, Gephyrin oder VIAAT in blau). Oberflächen Bgt beschriftet GABAAR Show Kolokalisation mit A) die hemmenden postsynaptischen Gerüstprotein Gephyrin und B) Anlagerung an der präsynaptischen Marker VIAAT. (Maßstabsbalken, 10 um.)
Abbildung 3. Konfokale Bildgebung von GABAAR Endozytose in 15 DIV Hippocampus-Neuronen. A) B) Grafik stellt die Oberfläche GABAAR α-Bungarotoxin Alexa 594 Fluoreszenzverlust im Laufe der Zeit mit der Endozytose (normiert auf T = 0) (10-12 Neuronen pro Zeitpunkt, 4 Prozesse analysiert pro Neuron, Fehlerbalken zeigen Mittelwert ± SEM).
Abbildung 4. Live-konfokale Bildgebung von GABAAR Endozytose in 15 DIV Hippocampus-Neuronen. A) B3pHGFP + BBS enthaltenden Oberfläche GABAAR in Neuronen waren Live-markiertem α-Bungarotoxin mit Alexa 594 (rot), gefolgt von einer kurzen Entfernung von ungebundenem α-Bungarotoxin Alexa 594 durch Waschen. Neuronen wurden durch konfokale Mikroskopie bei 37 ° C in HBS für 20 min bei 1 min Intervall (Maßstabsbalken 10 &mgr; m) abgebildet. BGT Labeled GABAARs wurden auf die Zelloberfläche zu T0 lokalisiert, wie durch Co-Lokalisierung mit dem pHGFP Signal T0 gesehen. Im Laufe der Zeit natürlich Bgt beschriftet GABA AR-Signal ab, als Rezeptoren Endozytose, werden neue pHGFP Rezeptoren exprimieren, ständig eingesetzt, so dass die pHGFP Signal nahezu konstant bleibt.
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Discussion
Die hier beschriebenen BBS Basis fest und Live-Techniken können verwendet werden, um Rezeptor oder anderen Plasmamembranprotein Handel in Zelllinien, Neuronen und anderen primären Zellen zu verfolgen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Membran Einsetzen und Entfernen der Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und GPCR untersuchen und Veränderungen in den Handel zu beurteilen aufgrund der Gegenwart der Rezeptor-Agonisten und Modulatoren. Schwerpunkte sind entsprechende Lokalisierung der Tag, um eine extrazelluläre Lage und der Durchführung von Kontrollen, dass die Zugabe der BBS zu gewährleisten (als Standard für andere Reporter, wie GFP) funktionell still. Zur Verwendung in Zellen, die nikotinergen Acetylcholin (nAChR)-Rezeptoren exprimieren, muß die nAChR-Antagonisten Tubocurarin gesamten Protokoll verwendet werden, wie angegeben. In dem Fall, wo der zusätzliche GFP-Tag nicht verwendet wird, markiert BBS Gesamtproteinebene kann über eine zusätzliche Färbung mit α-Bungarotoxin zu einem anderen Fluorophor nach Fixierung und permeabiliz gekoppelt bestimmt werdenation. Wahl der Zeitpunkte für die Messung der Endozytose Raten der Rezeptor / Protein von Interesse erfordert die Beurteilung der aktuellen Kenntnisse über Menschenhandel für den Rezeptor / Protein, kombiniert mit der ersten Verwendung von mehreren Zeitpunkten. Diese Technik kann auch leicht mit herkömmlichen Immunfärbung verwendet werden. Wir beschreiben auch einen alternativen Ansatz für die Verfolgung Rezeptor Endozytose via Live-konfokale Bildgebung Experimenten. Ausstattung Verfügbarkeit, werden Zeitbedarf für die Live-Experimente, und andere experimentelle Einschränkungen führen Wahl der Methode, die beide lebensfähig und Techniken veröffentlicht. Zukünftige Anwendungen von BBS-Techniken gehören Live-oder Fest Bildgebung kombiniert mit endosomalen und lysosomalen Marker-Rezeptor-Schicksal zu folgen, dh Ausrichtung auf Recycling Endosomen und Rücklieferung an die Plasmamembran oder Abbau über Lysosomen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Unterstützung wurde von startup-Mittel aus der Pharmakologie und Chemische Biologie-Abteilung an der Universität von Pittsburgh School of Medicine. Bestätigung der Jacob Labor-Mitglieder, die an der Video-Vorlage beigetragen: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
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