Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

Published: March 28, 2014 doi: 10.3791/51365
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pharmacology & Chemical Biology Department, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

نحن هنا شرح استخدام الفلورسنت اليكسا صبغ جانب لα-بنغاروتوكسين لقياس GABA A مستقبلات سطح توطين والإلتقام في الخلايا العصبية قرن آمون. من خلال استخدام التركيبات التي تحمل علامة خارج الخلية القصير الذي يربط α-بنغاروتوكسين، لا يمكن أن يتحقق تحليل البلازما غشاء البروتين الاتجار التقامي.

Abstract

فمن الواضح بشكل متزايد أن مستقبلات الناقل العصبي، بما في ذلك ionotropic GABA A مستقبلات (GABAAR)، المعرض الاتجار ديناميكية للغاية والتنقل سطح الخلية 1-7. لدراسة مستقبلات الخلايا السطحية وتوطين الإلتقام، والتقنية الموصوفة هنا يجمع بين استخدام الفلورسنت α-بنغاروتوكسين مع الخلايا معربا عن بنيات تحتوي على بنغاروتوكسين-α (بغت) موقع ملزم (BBS). يستند BBS (WRYYESSLEPYPD) على الوحيدات α عضلة مستقبلات النيكوتين أستيل كولين، الذي يربط بغت مع تقارب عالية 8،9. إدراج موقع BBS يسمح توطين السطحية وقياسات الإدراج مستقبلات أو إزالة مع تطبيق الفلورسنت الخارجية بغت، كما هو موضح سابقا في تتبع GABAA وmetabotropic GABAB مستقبلات 2،10. بالإضافة إلى موقع BBS، ونحن إدراج حساسة للدرجة الحموضة GFP (pHGFP 11) بين الأحماض الأمينية 4 و 5 من الوحيدات GABAAR ناضجة من قبل معيار ماستراتيجيات البيولوجيا والاستنساخ olecular PCR (انظر الشكل 1) 12. وBBS هو 3 'لمراسل GFP حساسة للدرجة الحموضة، مفصولة 13-ألانين حمض أميني / البرولين رابط. لتهريبهم الدراسات وصفها في هذا المنشور التي تستند على عينات ثابتة، يخدم pHGFP كمراسلة من إجمالي الموسومة GABAAR مستويات البروتين الوحيدات، مما يتيح تطبيع بغت المسمى مستقبلات السكان لمجموع السكان مستقبلات. هذا يقلل من خلية إلى أخرى بغت تلطيخ تقلب إشارة الناتجة عن التعبير الأساس أعلى أو أقل من مفارز GABAAR الموسومة. وعلاوة على ذلك العلامة pHGFP يتيح سهولة تحديد الخلايا بناء إعراب عن تجارب التصوير الحي أو ثابتة.

Introduction

كان رائدا في استخدام جانب fluorescently α-بنغاروتوكسين لدراسة توطين مستقبلات وديناميكية في الدراسات من مستقبلات النيكوتين أستيل 13-15، الهدف الذاتية السم ل. في وقت لاحق، وقد استخدم إدماج الحد الأدنى من الببتيد ملزمة بغت (BBS) لدراسة الاتجار في كل من القنوات الأيونية يجند بوابات مثير والمثبطة والبروتين G مستقبلات جانب 2،10،16-21. يوفر هذا الأسلوب يستند BBS-المزايا لمناهج أخرى تستخدم للدراسات الاتجار مثل أساليب biotinylation السطح، ووضع العلامات الأجسام المضادة الخلايا الحية مع الأجسام المضادة لالحواتم خارج الخلية، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP). خلال سطح الخلية يتم تعديل تساهميا biotinylation الأمينات الحرة، مع القدرة على التأثير في النشاط الخلوي. وكثيرا ما تعرقلت الدراسات القائمة على الضد من قبل المجموعات المستضد السطحي أو السد، والتي يمكن أن تغير الأحداث الاتجار. ويرجع ذلك إلى الخطوة تبيض لFRAP قtudies، مصدر قلق كبير وإتلاف بنية الخلية الأساسية. ميزة إضافية هي أن BBS الموسومة يمكن أيضا أن تستخدم ليبني منهجيات البيوكيميائية مع الاتجار بنغاروتوكسين لتقويم يقترن مستقبلات البيوتين. هذه التقنية قابلة للتطبيق بسهولة لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. للاستخدام في الخلايا التي تعبر عن أستيل النيكوتينيك (nAChR) المستقبلات، يجب استخدام مضاد توبوكورارين nAChR في جميع أنحاء البروتوكول كما هو مبين. سوف يؤدون وضع العلامات بغت سطح البسيطة (أي ما يعادل نقطة T = 0 وقت لبروتوكول الإلتقام) على خلايا untransfected في غياب توبوكورارين تقديم أدلة على nAChR الذاتية.

أحد الاعتبارات الهامة لاستخدام هذا الأسلوب هو الإدراج المناسبة من BBS بحيث كان موجودا في مكان خارج الخلية عندما يتم تسليم البروتين من الفائدة لغشاء البلازما. على سبيل المثال، المجالات N-محطة مفارز GABAAR يقيمون في التجويف الحويصلي خلال الجتارficking وتصبح خارج الخلية بعد الإدراج مستقبلات في غشاء البلازما، مما يتيح وضع العلامات المحددة لمستقبلات سطح الخلية وتقييم إزالتها من سطح الخلية الأحداث التقامي. لقد أظهرنا سابقا أن إضافة GFP، MYC، أو BBS الحواتم إلى هذا المجال من مفارز GABAAR صامت وظيفيا. يجب أن يتم تنفيذ الضوابط القياسية لضمان أن يتم التعبير عن بروتين الموسومة عند مستويات مماثلة لبناء معلم، وأنه المترجمة بشكل مناسب، وأنه لا يؤثر على وظيفة مستقبلات. وهذا توصيف البنى transfected مساعدة أيضا في المخاوف من overexpression استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع البروتوكولات هو موضح أدناه هي وفقا للIACUC ومجالس المراجعة المؤسسية IRB من جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب.

1. إعداد الثقافات الحصين العصبية في الأنسجة الثقافة هود

ملاحظة: استخدام تقنية معقمة والكواشف في جميع أنحاء بروتوكول 1.

  1. إعداد بولي-D-يسين (0.1 ملغ / مل في H 2 O) coverslips الزجاج المطلي باعتبارها الركيزة للثقافة العصبية.
    1. وضع 4-5 coverslips الزجاج جولة داخل كل 3.5 سم الأنسجة طبق الثقافة.
    2. بقعة 70 ميكرولتر بولي-D-يسين على كل ساترة 12 ملم. ملاحظة: للتصوير الحية، قاع كوب يمكن استخدام 3.5 سم، والأنسجة صحن الثقافة (بقعة 200 ميكرولتر بولي-D-يسين على جزءا لا يتجزأ من 14 ملم الزجاج ساترة).
    3. ترك الأطباق التي أعدت في الأنسجة الثقافة هود O / N. للحد من بولي-D يسين التبخر والحفاظ على الأسطح معقمة في نسيج الثقافة هود، وإغلاق النافذة وشاح وإيقاف اله منفاخ O / N. ملاحظة: لا تستخدم أضواء الأشعة فوق البنفسجية أثناء O / N الحضانة.
    4. في صباح اليوم التالي، وغسل الأطباق 3x أخرى مع 2 مل من H 2 O.
    5. بعد إزالة مشاركة H 2 O غسل، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام إلى كل طبق 3.5 سم وترك الأطباق في الحاضنة حتى على استعداد لوحة الخلايا العصبية في الخطوة 1.4.
  2. وتعد الخلايا العصبية قرن آمون من يوم الجنينية 18-19 (E18-19) الفئران (معدلة من Goslin 22).
  3. بالنقل الخلايا العصبية فصلها حديثا يوم مع زراعة 1-4 ميكروغرام من الحمض النووي بناء maxiprepped.
    ملاحظة: عادة 3 ميكروغرام من الحمض النووي يتم transfected في 1-2000000 الخلايا العصبية، مع بقاء 50٪ وكفاءة ترنسفكأيشن من 60٪ (على سبيل المثال بدءا من 2 مليون خلية عصبية: ((2 × 10 6 الخلايا العصبية × 0.5) 0.6) ويوفر تقريبا 1000000 الخلايا العصبية؛. 600،000 منها و transfected 1 كميات مختلفة من الحمض النووي يمكن بناء transfected عند استكشاف مشكلات المحتملة للالإفراط في التعبير، تليها توصيف المناسب لتوطين بناء وظيفة.
  4. لوحة الخلايا العصبية transfected على بولي-D-يسين coverslips المغلفة في مناطق ذات كثافة النهائي من حوالي 200،000 الخلايا العصبية في 3.5 سم الطبق. ملاحظة: لزجاج قاع الطبق، لوحة 40،000-50،000 الخلايا العصبية في منطقة الزجاج 14 ملم.
  5. استبدال وسائل الإعلام 4-24 ساعة بعد إعداد الثقافات العصبية، ثم السماح لتطوير الخلايا العصبية في الحاضنة حتى 14-17 يوما في المختبر (DIV) أو المرحلة المطلوبة.

2. الإلتقام الفحص

تنبيه: ملاحظة على α-بنغاروتوكسين والنفايات توبوكورارين والمناولة:

  1. ينصح التعامل مع جميع أعصاب الببتيد في إطار المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية المستوى 2 (BL-2) بروتوكولات البحوث. يجب أن ترتديه كل العتاد الوقاية الشخصية المناسبة. ولابد من إعادة مساحيق السم مجفف بالتجميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. السم شو النفاياتيتم التخلص من دينار في الامتثال للمبادئ التوجيهية الصحة البيئية والسلامة في مؤسسة الحاكم.
  2. لإزالة الركام الببتيد المحتملة التي قد شكلت أثناء التخزين، ينبغي طرد مأخوذة α-بنغاروتوكسين لفترة وجيزة قبل الاستخدام، وينبغي أن تستخدم طاف للتجربة.
  3. ومعلق α-بنغاروتوكسين (بغت) الأسهم إلى تركيز 1 ملغ / مل في H 2 O العقيمة وتخزينها في 10 ميكرولتر مأخوذة في -20 درجة مئوية. وتستخدم الأسهم بغت جانب Fluorescently في 3 ميكروغرام / مل. يستخدم توبوكورارين في تركيز النهائي من 150 ميكرومتر.
  1. ضبط مقاعد البدلاء أعلى كتلة سخان إلى 16 درجة مئوية في غرفة باردة مع رقيقة من الألومنيوم أو لوحة الفولاذ المقاوم للصدأ على القمة. بدلا من ذلك، إذا كان متوفرا، وهو أعلى جهاز التبريد / التدفئة مقاعد البدلاء يمكن استخدامها لكل خطوة تتطلب 16 درجة مئوية.
  2. بارد خارج الخلية المالحة HEPES مخزنة (HBS تحتوي في ملي: 135 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، 10 HEPES، 11 الجلوكوز، 1.2 MgCl 2، و 2.5و CaCl 2، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 16 درجة مئوية في حمام مائي.
  3. نقل الأطباق الخلايا العصبية لوحة الألومنيوم عند 16 درجة مئوية وباردة لمدة 5 دقائق.
  4. إزالة وسائل الاعلام (الحفاظ على وسائل الإعلام ومكيفة الاحتياطي في الحاضنة لمدة الخطوة 2.8، الإلتقام نقاط زمنية مقايسة) واستبدالها مع 1 مل من 16 درجة مئوية HBS + توبوكورارين (150 ميكرومتر) لمدة 2 دقيقة.
  5. إزالة HBS + توبوكورارين إلى حاوية النفايات وصفت واستبدالها مع 1 مل من 16 درجة مئوية HBS + توبوكورارين (150 ميكرومتر) + α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 [3 ميكروغرام / مل]، يحتضنها في 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. إزالة HBS + + توبوكورارين α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 المسمى إلى حاوية النفايات وغسل الأطباق 3x أخرى مع 2 مل من 16 درجة مئوية HBS (يغسل يمكن جمعها عبر التطلع في قارورة فراغ يحتوي على 50 مل من 50٪ التبييض).
  7. لتصوير حي السلاسل الزمنية التجارب التالية مستقبلات الإلتقام باستخدام الزجاج القاع 3.5 سم صحن الثقافة، تنفيذ الخطوات 2،1-2،6، ثم نقل إلى طبق مرحلة ساخنة(الجهاز بلتيير) على المجهر، وتبدأ التصوير مع متحد البؤر المجهر TIRF أو الإعداد.
  8. نقل T = coverslips 0 نقطة زمنية في طبق من RT بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة، مع استمرار coverslips أخرى إلى الخطوة 2.9.
  9. الوقت للحصول على نقاط أخرى، استبدل HBS مع تكييف معايرتها 37 ° C وسائل الإعلام (محفوظة في الخطوة 2.4) والعودة إلى الحاضنة لالإلتقام عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: اقترح نقاط إضافية من الوقت T = 15، 30، و 60.
  10. في نقاط الوقت اللازم، واتخاذ الأطباق من الحاضنة، وغسل بسرعة مرتين مع 2 مل من DPBS RT (DPBS لا الكالسيوم والمغنيسيوم) ثم إصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة.
  11. بعد 20 دقيقة التثبيت، وإزالة بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز إلى حاوية النفايات وغسل الأطباق مرتين مع 2 مل RT DPBS.
  12. احتضان coverslips في RT لمدة 10 دقيقة في حل المناعي كتلة (حل كتلة = 5٪ مصل الحصان، 0.5٪ BSA في DPBS) تحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 لpermeabilإيزي الخلايا العصبية والمناعية المضادة للتمكين GFP تجمع مستقبلات الخلايا و / أو وضع العلامات من البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.
  13. إزالة كتلة + 0.2٪ تريتون X-100 واحتضان coverslips في حل المناعي كتلة دون تريتون X-100 لمدة 20-30 دقيقة.
  14. أداء حضانات الأجسام المضادة الأولية من coverslips في كتلة لعدة ساعات في RT أو O / N عند 4 درجة مئوية. ملاحظة: حضانة coverslips مع الانتخابات التمهيدية في 4 درجات ثاني / N تنتج بشكل روتيني تحسين نتائج المناعي.
  15. غسل coverslips 3X مع DPBS (5 دقائق لكل خطوة الغسيل).
  16. احتضان coverslips مع الأجسام المضادة الثانوية في حل كتلة لمدة 1 ساعة على RT.
  17. غسل coverslips 3X مع DPBS (5 دقائق لكل خطوة الغسيل).
  18. جبل coverslips، والتعامل مع كل ساترة فردي: إزالة السائل الزائد من مؤخرة ساترة مع الأنسجة المختبر، ثم قلب ساترة 4 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية.
  19. تسمح تغطية الشرائح لتجف في RT لمدة 30 دقيقة ثم شارعخام في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لأداء المجهري.
  20. الحصول على الصور وتحليل التجربة مع المجهري متحد البؤر (الأعمى إلى حالة تجريبية). 60X النفط NA 1.49 هدف الغمر مع الليزر التالية: غاز الأرجون 488 نانومتر، 561 الصمام الثنائي، الصمام الثنائي 640.
    1. باستخدام نفس الإعدادات الحصول على الصور، والحصول على واحدة Z قسم الصور مع جسم الخلية العصبية وعدة عمليات شجيري في التركيز.
    2. تحديد α-بنغاروتوكسين اليكسا إشارة مضان GFP والمناعية على طول 20 ميكرومتر من 3-4 التشعبات الداني في الخلايا العصبية، وذلك باستخدام نفس عتبة لتحليل جميع البيانات الإلتقام.
    3. تحليل البيانات 10-12 الخلايا العصبية لكل نقطة زمنية، وتكرار التجربة مع العديد من الثقافات العصبية المستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توصيف لبناء BBS الموسومة يتضمن الضوابط المهمة مثل تحديد ما إذا كان البروتين أعرب تجمع بشكل صحيح (ولا سيما مع مستقبلات تتألف من وحدات فرعية متعددة)، ويتاجر إلى سطح الخلية ويموضع بشكل مناسب. وتتكون نقاط الاشتباك العصبي GABA A المثبطة للمستقبلات سطح الكتل التي colocalize مع البروتين المثبطة سقالة gephyrin والرئيسي يعارضها لمحطات قبل المشبكي المثبط، التي حددها نقل الأمينية حمض المثبطة الحويصلي الذي يقوم بتحميل GABA والجلايسين في الحويصلات متشابك (VIAAT / VGAT). هو مبين في الشكل 2 هي α2pHGFP + BBS معربا عن الخلايا العصبية مع GABAAR سطح المسمى مع بغت، تليها المناعية لمجموع السكان مستقبلات مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP وإما بعد المشبكي المثبط gephyrin البروتين سقالة (الشكل 2A) أو VIAAT (الشكل 2B).

ويبين الشكل 3 الإلتقام من α2 تحتوي على GABAAR في الخلايا العصبية قرن آمون في 15 DIV. قياسات مضان بغت العمليات شجيري الفردية كما هو موضح في لوحات (الشكل 3A) هي تطبيع إلى مستوى بناء التعبير عبر تلطيخ GFP الأضداد. يتم مقارنة النهائي من النقاط الزمنية عن طريق التطبيع لقياس T = 0، كما هو مبين في الشكل 3B. الكمي لاستيعاب مستقبلات أكثر من دقيقة الفترة 60 (الشكل 3B) من التغييرات إشارة مضان بمرور الوقت (يعني ± SEM: T0 = 100 ± 7.2، 74.7 ± T15 = 12.9، 44.7 ± T30 = 5.6، وT60 = 19.1 ± 3.4 دقيقة ) كان أفضل وصف من قبل الأسي واحد (في 37 º C: ر 1/2 = 26 ± 4.8 دقيقة).

نهج بديل، كما هو موضح في الشكل (4)، هو اتباع مستقبلات الإلتقام في الخلايا العصبية واحد عن طريق التصوير الحي الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر. ومنقط ومضان تداخل pHGFP سطح الموسومة GABAAR وبغت ل مستقبلات abeled مرئيا في بداية التجربة (T0). على مدار الساعة، وصفت بغت يقلل GABA إشارة AR، كما endocytose المستقبلات، في حين لا تزال إشارة pHGFP عالية نظرا لمستقبلات جديدة الإدراج. ويرجع ذلك إلى التغيرات توزيع مستقبلات سطح الخلية وphotobleaching من انخفاض الحد الأدنى في إشارة phGFP.

الشكل 1
الشكل 1. رسم توضيحي لBBS وpHGFP الموسومة GABAAR الوحيدات والفحص الإلتقام. يقاس الإلتقام من خلال تطبيق أول بنغاروتوكسين fluorescently المسمى إلى الخلايا العصبية أو خلايا، تليها غسل موجزة لإزالة السم غير منضم، ثم يتم رصد فقدان مضان المستقبلات كما هي المنضوية.

jpg و"العرض =" 500 "/>
الشكل 2. التصوير متحد البؤر من BBS وpHGFP الموسومة GABAAR تظهر التعريب المناسب مع مكونات المشبك المثبطة. سطح GABAAR في α2pHGFP + BBS معربا عن الخلايا العصبية وصفت مع α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 (الحمراء)، تليها المناعية، وتظهر التوسعات من التشعبات ل حق كل الخلايا العصبية. لوحة اندمجت (α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 في الحمراء، GFP باللون الأخضر، أو gephyrin VIAAT باللون الأزرق). سطح بغت المسمى GABAAR تظهر colocalization مع أ) بعد المشبكي المثبط سقالة البروتين gephyrin وباء) بدل لعلامة VIAAT قبل المشبكي. (أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر).

الرقم 3
الشكل 3. التصوير متحد البؤر من GABAAR الإلتقام في 15 DIV الخلايا العصبية قرن آمون. A) B) رسم بياني يمثل GABAAR سطح α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 فقدان مضان بمرور الوقت مع الإلتقام (تطبيع T = 0) (10-12 الخلايا العصبية في نقطة زمنية، 4 عمليات تحليل في الخلايا العصبية؛ أشرطة الخطأ تمثل يعني ± SEM).

الرقم 4
الشكل 4. ايف التصوير متحد البؤر من GABAAR الإلتقام في 15 DIV الخلايا العصبية قرن آمون. A) B3pHكانت GFP + BBS تحتوي على GABAAR السطح في الخلايا العصبية الحية المسمى مع α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 (الحمراء)، يليه إزالة وجيزة من غير منضم α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 عن طريق الغسيل. تم تصوير الخلايا العصبية بواسطة المجهر متحد البؤر عند 37 درجة مئوية في HBS لمدة 20 دقيقة في فاصل 1 دقيقة (أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر). تم ترجمة GABAARs بغت إعتبر إلى سطح الخلية في T0، كما يراها colocalization مع إشارة pHGFP في T0. على مدار الساعة، وصفت بغت يقلل GABA إشارة AR، كما endocytose المستقبلات، pHGFP جديدة معربا عن مستقبلات يجري باستمرار إدراج، لذلك تبقى الإشارة pHGFP ثابتة تقريبا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التقنيات الثابتة والحية BBS مقرها الموصوفة هنا يمكن استخدامها لتعقب مستقبلات غشاء البلازما أو غيرها الاتجار البروتين في خطوط الخلايا، الخلايا العصبية، والخلايا الأولية الأخرى. وقد استخدمت بنجاح هذه الطريقة لدراسة الإدراج غشاء وإزالة القنوات الأيونية يجند بوابات والنوع من الاختزال وتقييم التغيرات في الاتجار بسبب وجود منبهات مستقبلات وجهري. وتشمل الجوانب الرئيسية توطين ملائمة للعلامة إلى مكان خارج الخلية وأداء الضوابط لضمان اضافة BBS (وفقا لمعايير صحفيين الأخرى، مثل GFP) هي صامتة وظيفيا. للاستخدام في الخلايا التي تعبر عن أستيل النيكوتينيك (nAChR) المستقبلات، يجب استخدام مضاد توبوكورارين nAChR في جميع أنحاء البروتوكول كما هو مبين. وفي حالة ما إذا لم يتم استخدام العلامة GFP إضافية، الموسومة مجموع BBS يمكن تحديد مستوى البروتين عن طريق تلطيخ مع مبلغ إضافي α-بنغاروتوكسين جانب إلى آخر بعد تثبيت fluorophore وpermeabilizأوجه. اختيار نقاط زمنية لقياس معدلات الإلتقام من مستقبلات / البروتين من الفائدة يتطلب تقييم المعرفة الحالية من الاتجار لمستقبلات / البروتين، جنبا إلى جنب مع الاستخدام الأولي من الوقت المزيد من النقاط. هذه التقنية أيضا يمكن استخدامه بسهولة مع المناعية التقليدية. نحن أيضا يصف نهجا بديلا لمستقبلات تتبع الإلتقام عبر تجارب التصوير متحد البؤر الحية. توافر المعدات، وسوف متطلبات الوقت لإجراء التجارب الحية، والقيود تجريبية أخرى توجيه اختيار طريقة، سواء كونها قابلة للتطبيق التقنيات ونشرها. وتشمل التطبيقات المستقبلية لتقنيات BBS التصوير الحي أو ثابتة جنبا إلى جنب مع endosomal والليزوزومية علامات لمتابعة مصير مستقبل، أي استهداف لإعادة تدوير واعادة تسليم الإندوسومات إلى غشاء البلازما أو التدهور عن طريق الجسيمات الحالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

تم تقديم الدعم من خلال صناديق بدء التشغيل من قسم البيولوجيا الكيميائية والصيدلة في جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب. شكر وتقدير من أعضاء المختبر يعقوب الذين ساهموا في تقديم الفيديو: نيكولاس غراف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
P3 Primary Cell 4D kit  Lonza V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate Molecular Probes B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate Molecular Probes B13423
(+)-Tubocurarine chloride Tocris 2820
Mounting medium  DAKO cS703
DPBS no calcium, magnesium Invitrogen 14190-136
Poly-D-lysine  Sigma P6407
Gephyrin antibody Synaptic Systems 147 011 1:300
VIAAT/VGAT antibody Synaptic Systems 131 002 1:1,000
anti GFP Life Technologies A6455 1:2,000
Glass bottom tissue culture dish MatTek Corporation P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm Warner Instruments 640-0702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  2. Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
  3. Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
  4. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  5. Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
  6. Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
  7. Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
  8. Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
  9. Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
  10. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  11. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  12. Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
  13. Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
  14. Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
  15. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
  16. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
  17. Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
  18. Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
  19. Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
  20. Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
  21. Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
  22. Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).

Tags

علم الأعصاب، العدد 85، α-بنغاروتوكسين، موقع ملزم، الإلتقام، المناعية، القوارض الخلايا العصبية قرن آمون، مستقبلات، والاتجار، غشاء البلازما
باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brady, M. L., Moon, C. E., Jacob, T. … More

Brady, M. L., Moon, C. E., Jacob, T. C. Using an α-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking. J. Vis. Exp. (85), e51365, doi:10.3791/51365 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter