Summary
Här visar vi användningen av fluorescerande Alexa dye kopplad till α-bungarotoxin att mäta GABA A-receptorn yta lokaliseringen och endocytos i hippocampala neuroner. Genom att använda konstruktioner som bär en kort extracellulärt tagg som binder α-bungarotoxin, kan uppnås analys av plasmamembranprotein endocytic trafficking.
Abstract
Det är allt mer uppenbart att neurotransmittorreceptorer, inklusive jonotropa GABA A-receptorer (GABAAR), uppvisar mycket dynamisk handel och cellytan rörlighet 1-7. För att studera receptor på cellytan lokalisering och endocytos, den teknik som beskrivs här kombinerar användandet av fluorescerande α-bungarotoxin med celler som uttrycker konstruktioner som innehåller en α-bungarotoxin (Bgt) bindningsställe (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) är baserad på den α-subenheten av muskel-nikotinacetylkolinreceptorn, vilket binder Bgt med hög affinitet 8,9. Inkorporering av BBS webbplats tillåter ytan lokalisering och mätningar av receptor insättning eller borttagning med applicering av exogen fluorescerande Bgt, såsom tidigare beskrivits i spårning av GABAA och metabotropa GABAB-receptorer 2,10. Förutom den BBS sajten införas vi ett pH-känsligt GFP (pHGFP 11) mellan aminosyrorna 4 och 5 i det mogna GABAAR subenheten genom standard molecular biologi och PCR-kloningsstrategier (se figur 1) 12. BBS är 3 'av pH-känsliga GFP reporter, åtskilda av en 13-aminosyran alanin / prolin länkaren. För trafficking studier som beskrivs i denna publikation, som är baserade på fasta prover, pHGFP fungerar som en reporter av total tagged GABAAR subenhets-proteinnivåer, vilket tillåter normalisering av Bgt märkt receptor population till total receptorpopulationen. Detta minimerar cell till cell Bgt färgning signal variabilitet till följd av högre eller lägre baslinjen uttryck för de taggade GABAAR subenheter. Dessutom pHGFP taggen möjliggör enkel identifiering av konstruktion som uttrycker celler för live eller fasta avbildningsexperiment.
Introduction
Användningen av fluorescenskopplade α-bungarotoxin att studera receptorlokalisering och dynamik var uppfunnen vid studier av nikotinacetylkolinreceptorn 13-15, toxinet endogena mål. Därefter inkorporering av den minimala Bgt bindande peptid (BBS) har använts för att studera trafficking av både retande och hämmande ligandreglerade jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer 2,10,16-21. Denna BBS-baserad teknik ger fördelar till andra metoder som använts för människohandel studier liksom ytan biotinyleringen metoder, antikropps märkning av levande celler med antikroppar mot extracellulära epitoper, och fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP). Under cellytan Biotinylation fria aminer är kovalent modifierade, med potential att påverka cellaktiviteten. Antikropp baserade studier har ofta hämmats av ytantigen klustring eller tak, vilket kan förändra smugglingshändelser. På grund av att blekningssteget för FRAP studies, är en viktig angelägenhet att skada den underliggande cellstrukturen. En ytterligare fördel är att BBS taggade konstruktioner kan även användas för biokemiska metoder med biotin-kopplad bungarotoxin till åsnor receptor trafficking. Denna teknik är lätt tillämplig på cellinjer och primära celler. För användning i celler som uttrycker nikotinacetylkolin (nAChR)-receptorer, måste nAChR antagonisten tubokurarin användas i hela protokollet som anges. Utföra en enkel yta Bgt märkning (ekvivalent med T = 0 tidpunkt för endocytos protokoll) på otransfekterade celler i frånvaro av tubokurarin kommer att tillhandahålla bevis på endogen nAChR.
Ett viktigt övervägande för att använda denna teknik är lämplig insättning av BBS så att det är närvarande vid en extracellulär placering när proteinet av intresse levereras till plasmamembranet. Till exempel, de N-terminala domänerna av GABAAR subenheter uppehålla sig i de vesikulära lumen under tramänniskohandel och bli extracellulärt efter receptor införande i plasmamembranet, vilket gör att särskild märkning av receptorer på cellytan och bedömning av de avlägsnas från cellytan genom endocytiska händelser. Vi har tidigare visat att tillägg av GFP, myc, eller BBS epitoper till denna domän GABAAR subenheter är funktionellt tyst. Standard kontroller bör utföras för att se till att den taggade proteinet uttrycks på liknande nivåer till en omärkt konstruktion, att det på lämpligt lokaliserad, och att det inte påverkar receptorfunktionen. Denna karakterisering av transfekterade konstruktioner kommer också stöd i felsökning överuttryck oro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som beskrivs nedan är förenliga med IACUC och IRB institutionella prövningsnämnder vid universitetet i Pittsburgh School of Medicine.
1. Beredning av hippocampus Neuronal kulturer i vävnadsodling huva
Obs! Använd steril teknik och reagenser hela protokoll 1.
- Förbered poly-D-lysin (0,1 mg / ml i H2O) belagda täckglas av glas som ett substrat för den neuronala kultur.
- Placera 4-5 runda glas täckglas inuti varje 3,5 cm vävnadsodlingsskål.
- Spot 70 pl poly-D-lysin på varje 12 mm täckglas. Anmärkning: för live-avbildning, bottnade ett glas 3,5 cm vävnadsodlingsskål kan användas (plats 200 ^ poly-D-lysin på inbyggda 14 mm täckglas).
- Låt de färdiga rätter i vävnadsodling huva O / N. För att minimera poly-D-lysin avdunstning och hålla ytor sterila i vävnadsodling huva, stänga fönsterbågen och stäng av the fläkt O / N. OBS: UV-ljus används inte under O / N inkubation.
- Nästa morgon, diska 3x med 2 ml H2O
- Efter att sista H2O tvätt, tillsätt 2 ml av media till varje 3,5 cm skål och lämna rätter i inkubatorn tills den ska tallriken nervceller i steg 1.4.
- Hippocampus nervceller framställs från embryonala dag 18-19 (E18-19) råttor (modifierad från Goslin 22).
- Transfektera nyligen dissocierade neuroner på dagen för odling med 1-4 pg av maxiprepped konstrukt-DNA.
Anm: typiskt 3 pg DNA transfekteras in 1-2000000 neuroner, med en viabilitet på 50% och en transfektionseffektiviteten av 60% (t ex börjar med 2000000 neuroner: ((2 x 10 6 neuroner x 0,5) 0,6) tillhandahåller ca 1 miljon neuroner,.. varav 600.000 är transfekterade 1 Olika mängder konstruktion DNA kan transfekteras vid felsökning eventuella frågor omöveruttryck, följt av lämplig karakterisering av konstruktet lokalisering och funktion. - Plåt de transfekterade neuroner på poly-D-lysin-belagda täckglas vid en slutlig densitet av ca 200.000 neuroner per 3,5 cm skål. Anmärkning: för ett glas botten maträtt, tallrik 40,000-50,000 nervceller på 14 mm glasområdet.
- Byt medierna 4-24 timmar efter beredning av neuronala kulturer, sedan låta nervceller att utvecklas i inkubatorn tills 14-17 dagar in vitro (DIV) eller önskad scen.
2. Endocytosis Assay
VARNING: Observera på α-bungarotoxin och tubokurarin avfall och hantering:
- Hantering av alla peptidtoxiner rekommenderas inom riktlinjerna för Biosafety Level-2 (BL-2) forskningsprotokoll. Alla ordentlig personlig skyddsutrustning måste användas. Lyofiliserade toxin pulver ska beredas i enlighet med tillverkarens anvisningar. Toxin avfall should kasseras i enlighet med den styrande institutionens Environmental Health and Safety riktlinjer.
- För att ta bort eventuella peptidaggregat som kan ha bildats under lagring, bör α-bungarotoxin alikvoter centrifugeras kort före användning, och den överstående bör användas för experimentet.
- α-bungarotoxin (Bgt) lager återsuspenderas till en koncentration av 1 mg / ml i sterilt H2O och lagrades i 10 | il alikvoter vid -20 ° C. Fluorescerande kopplade BGT lagren tömts på 3 mikrogram / ml. Tubokurarin användes vid en slutlig koncentration av 150 pM.
- Ställ bänk uppvärmningsblocket till 16 ° C i kallt rum med tunn aluminium eller plåt av rostfritt stål ovanpå. Alternativt, om möjligt, en bänk kyla / värme-enhet kan användas för varje steg som kräver 16 ° C.
- Cool extracellulär Hepes-buffrad saltlösning (HBS innehållande i mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 glukos, 1,2 MgCl2 och 2,5CaCl2, pH 7,4) till 16 ° C i ett vattenbad.
- Överföring neuron rätter att aluminiumplåt vid 16 ° C och svalna i 5 minuter.
- Ta bort media (håll rade media och reserv i kuvös för steg 2.8, endocytosis analys tidpunkter) och ersätt med 1 ml 16 ° C HBS + tubokurarin (150 M) i 2 min.
- Ta HBS + tubokurarin till etiketterad avfallsbehållare och ersätta med 1 ml 16 ° C HBS + tubokurarin (150 M) + α-bungarotoxin Alexa 594 [3 ng / ml], inkubera vid 16 ° C i 15 min.
- Ta HBS + tubokurarin + α-bungarotoxin Alexa 594 till etiketterad avfallsbehållare och diska 3x med 2 ml 16 ° C HBS (de tvättar kan samlas in genom aspiration i en termos som innehåller 50 ml av 50% blekmedel).
- För levande avbildning tidsserieexperiment efter receptor endocytos med en glasbottnad 3,5 cm odlingsskål, utför steg från 2,1 till 2,6, sedan överföra skålen till uppvärmd stadium(Peltier-enhet) på mikroskop, och börja avbildning med en konfokala eller TIRF mikroskop setup.
- Transfer T = 0 tidpunkt täckglas i en skål av RT 4% paraformaldehyd / 4% sackaros i 20 minuter, fortsätter med andra täckglas till steg 2.9.
- För andra tidpunkter, byt HBS med rade till jämvikt 37 ° C media (reserverad i steg 2.4) och återgå till inkubatorn för endocytos vid 37 ° C. OBS: föreslog ytterligare punkter tid för T = 15, 30 och 60.
- Vid tidpunkter behövs, ta rätter från inkubatorn, tvätta snabbt två gånger med 2 ml RT DPBS (DPBS ingen kalcium, magnesium) sedan fixa i 4% paraformaldehyd / 4% sackaros i 20 min.
- Efter 20 min fixering, ta bort 4% paraformaldehyd / 4% sackaros slösa behållaren och diska två gånger med 2 ml RT DPBS.
- Inkubera täckglas vid RT under 10 min i immunofluorescens blocket lösning (block lösning = 5% hästserum, 0,5% BSA i DPBS) innehållande 0,2% Triton X-100 till permeabilize nervceller och aktivera anti-GFP-immunfärgning av intracellulär receptor pool och / eller märkning av andra proteiner av intresse.
- Avlägsna block + 0,2% Triton X-100 och inkubera täckglas i immunofluorescens blocket lösning utan Triton X-100 för 20 till 30 min.
- Utför primära inkubationer av täckglas i blocket antikropps i flera timmar vid RT eller O / N vid 4 ° C. OBS: inkubation av täckglas med primärval vid 4 ° CO / N rutinmässigt ger förbättrade immunofluorescens resultat.
- Tvätta täck 3x med DPBS (5 min för varje tvättsteg).
- Inkubera täckglas med sekundära antikroppar i blocket lösning under 1 h vid RT.
- Tvätta täck 3x med DPBS (5 min för varje tvättsteg).
- Montera täckglas, hantering varje täckglas för sig: ta bort överflödig vätska från baksidan av täckglas med labb vävnad, sedan invertera täckglas på 4 l av monteringsmedium på en glasplatta.
- Låt objektglasen torka vid RT täckt för 30 minuter sedan stmalm vid 4 ° C tills de ska utföra mikroskopi.
- Bild förvärv och analys av experiment med konfokalmikroskopi (blind för experimentell skick). 60X olja NA 1,49 immersionsobjektiv med följande lasrar: Argon gas 488 nm, 561 diod, 640 diod.
- Med samma bildförvärvs inställningar, förvärva enstaka Z sektions bilder med den neuronala cellkroppen och flera dendritiska processer i fokus.
- Kvantifiera α-bungarotoxin Alexa fluorescenssignal och GFP immunofärgning längs 20 um av 3-4 proximala dendriter per neuron, med användning av samma gränsvärde för analys av alla endocytosis data.
- Analysera data 10-12 neuroner för varje tidpunkt, att upprepa experimentet med flera oberoende neuronala kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av en BBS taggad konstruktion innehåller viktiga kontroller såsom avgöra om det uttryckta proteinet monterar korrekt (särskilt med receptorer som består av flera subenheter), trafikerar till cellytan och lokaliserar lämpligt. Hämmande synapser består av GABA A-receptor yta kluster som colocalize med den hämmande schavotten protein gephyrin och apposed till presynaptiska hämmande terminaler, som identifierats av vesikulär hämmande aminosyratransportör som laddar GABA-och glycin i synaptiska vesikler (VIAAT / VGAT). I fig 2 är α2pHGFP + BBS uttrycker neuroner med ytan GABAAR märkt med Bgt, följt av immunfärgning för total receptorpopulationen med anti-GFP-antikropp och antingen den postsynaptiska inhiberande scaffold protein gephyrin (figur 2A) eller VIAAT (Figur 2B).
Figur 3 visar endocytos av α2 innehåller GABAAR i hippocampus nervceller vid 15 DIV. BGT fluorescensmätningar på enskilda dendritiska processerna som visas i de paneler (figur 3A) är normaliserade till nivån av konstruktet uttryck via färgning GFP-antikropp. Slutlig jämförelse av tidpunkter görs genom normalisering till T = 0 mätning, såsom visas i fig. 3B. Kvantifiering av internalisering av receptorer över en 60 min period (Figur 3B) från fluorescenssignalen förändringar över tid (Medelvärde ± SEM: T0 = 100 ± 7,2, T15 = 74,7 ± 12,9, T30 = 44,7 ± 5,6, och T60 = 19,1 ± 3,4 min ) var bäst beskrivas med ett enda exponentiell (vid 37 º C: t 1/2 = 26 ± 4,8 minuter).
Ett alternativ, som visas i figur 4, är att följa receptor endocytos i en enda neuron från levande avbildning tidsförlopp konfokalmikroskopi. Den punktat och överlappande fluorescens av ytan pHGFP taggade GABAAR och Bgt l abeled receptorer är synlig vid början av experimentet (T0). Under tiden kursen, Bgt märkt GABA AR-signalen minskar, eftersom receptorer endocytose, medan pHGFP signalen är fortsatt hög på grund av ny receptor insättning. Den minimala minskningen i phGFP signalen beror på cellytan förändringar receptor distributions och fotoblekning.
Figur 1. Diagram över en BBS och pHGFP tagged GABAAR subenheten och endocytos assay. Endocytosis mäts genom att först applicera en fluorescensmärkt bungarotoxin till nervceller eller celler, följt av en kort tvätt för att avlägsna obundet toxin, då fluorescens förlust övervakas som receptorer är internaliserade.
jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Confocal avbildning av BBS och pHGFP tagged GABAAR visande lämplig lokalisering med inhibitoriska synaps komponenter. Surface GABAAR i α2pHGFP + BBS uttryckande neuroner var märkta med α-bungarotoxin Alexa 594 (röd), följt av immunfärgning är förstoringar av dendriter som visas till höger om varje neuron. Sammanslagen panel (α-bungarotoxin Alexa 594 i rött, GFP i grönt, gephyrin eller VIAAT i blått). Surface Bgt märkt GABAAR show colocalization med A) den postsynaptiska hämmande schavotten protein gephyrin och B) apposition till den presynaptiska markör VIAAT. (Skala barer, 10 | im.)
Figur 3. Confocal avbildning av GABAAR endocytos i 15 DIV hippocampus nervceller. A) B) diagrammet representerar ytan GABAAR α-bungarotoxin Alexa 594 fluorescensförlust med tiden med endocytos (normaliserad till T = 0) (10 till 12 neuroner per tidpunkt, fyra processer analyserade per neuron; felstaplar representerar medelvärde ± SEM).
Figur 4. Live konfokal avbildning av GABAAR endocytos i 15 DIV hippocampus nervceller. A) B3pHGFP + BBS innehållande yta GABAAR i neuroner var levande märktes med α-bungarotoxin Alexa 594 (röd), följt av en kort avlägsnande av obundet α-bungarotoxin Alexa 594 genom tvättning. Neuroner avbildades genom konfokal mikroskopi vid 37 ° C i HBS i 20 min vid en 1 minuters intervall (Skala barer, 10 mikrometer). Bgt Märkta GABAARs lokaliserades till cellytan vid T0, sedda av colocalization med pHGFP signalen vid T0. Under tiden kursen, Bgt märkt GABA AR-signalen minskar, eftersom receptorer endocytose, är ny pHGFP uttrycker receptorer ständigt insatt, så det pHGFP signalen förblir nästan konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De BBS baserade fasta och levande metoder som beskrivs här kan användas för att spåra receptor eller annan plasmamembranprotein handel med cellinjer, nervceller och andra primära celler. Denna metod har framgångsrikt använts för att studera membran insättning och borttagning av ligandstyrda jonkanaler och GPCR och bedöma förändringar i handel på grund av närvaron av receptor-agonister och modulatorer. Viktiga aspekter innefattar lämplig lokalisering av taggen till ett extracellulärt plats och utföra kontroller för att säkerställa att tillsättningen av BBS (som standard för andra reportrar, såsom GFP) är funktionellt tyst. För användning i celler som uttrycker nikotinacetylkolin (nAChR)-receptorer, måste nAChR antagonisten tubokurarin användas i hela protokollet som anges. I det fall då den ytterligare GFP taggen inte används tagged totala BBS proteinnivån kan fastställas genom färgning med en ytterligare α-bungarotoxin är kopplad till en annan fluorofor efter fixering och permeabilization. Val av tidpunkter för mätning endocytosis klassar av receptorn / proteinet av intresse kräver en bedömning av nuvarande kunskap om människohandel för receptorn / protein i kombination med första användningen av flera tidpunkter. Denna teknik kan också lätt användas med konventionell immunfärgning. Vi beskriver också en alternativ metod för att spåra receptorn endocytos via levande konfokala imaging experiment. Utrustning tillgänglighet, kommer krav på tid för levande experiment och andra experimentella begränsningar styra val av metod, båda är livskraftiga och publicerade tekniker. Framtida tillämpningar av BBS tekniker är levande eller fast avbildning i kombination med endosomala och lysosomala markörer för att följa receptor öde, dvs inriktning på återvinning endosomes och omleverans till plasmamembranet eller nedbrytning via lysosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Stöd gavs av startup-medel från farmakologi och kemisk biologi Institutionen vid University of Pittsburgh School of Medicine. Bekräftelse av Jacob lab medlemmar som bidragit till video inlämnande: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).
