Summary
Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.
Abstract
Bu giderek daha belirgin olduğunu İyonotropik GABA A reseptörleri (GABAAR), sergi derece dinamik kaçakçılığı ve hücre yüzey hareketliliği 1-7 gibi nörotransmitter reseptörleri. Hücre yüzeyi reseptör lokalizasyonu ve endositoz çalışma yapmak için, burada açıklanan teknik hücreler, bir α-bungarotoksin (Bgt) bağlama bölgesi (BBS) içeren yapıları ifade eden floresan α-bungarotoksinin kullanımını birleştirmektedir. BBS (WRYYESSLEPYPD) yüksek afinite ile 8,9 Bgt bağlanan kas nikotinik asetilkolin reseptörü, bir α alt birimi dayanmaktadır. BBS site dahil edilmesi, daha önce GABAA ve GABAB metabotropik takibi 2,10 reseptörleri de tarif edildiği gibi, yüzey lokalizasyonu ve alıcı ekleme veya eksojen floresan Bgt uygulama ile çıkarılması ölçümleri sağlar. BBS sitesine ek olarak, amino asitlerden 4 ve standart m tarafından olgun GABAAR alt biriminin 5 arasında bir pH-duyarlı bir GFP (pHGFP 11) takılıolecular biyoloji ve PCR klonlama stratejileri 12 (bkz. Şekil 1). BBS, bir 13-amino asit alanin / prolin bağlayıcı tarafından ayrılan, pH duyarlı GFP raportör, 3 'dir. Toplam bir muhabiri Bgt normalleşme toplam reseptör nüfusa reseptör nüfusu etiketli izin GABAAR altbirim düzeyde protein etiketlenmiş olarak sabit örnekleri dayalı bu yayında açıklanan çalışmalar kaçakçılığı için, pHGFP hizmet vermektedir. Bu etiketli GABAAR alt birimlerinin yüksek veya daha düşük bazal ifade kaynaklanan Bgt lekeleme sinyal değişkenliği hücre hücre en aza indirir. Ayrıca pHGFP etiketi canlı veya sabit görüntüleme deneyleri için yapı sentezleyen hücrelerin kolayca tanınmasını sağlar.
Introduction
Floresan reseptör lokalizasyonu ve dinamiklerini incelemek için α-bungarotoksin birleştirilmiş kullanımı, nikotinik asetilkolin reseptörü 13-15 toksinin endojen hedef çalışmalarda öncüleridir. Daha sonra, en az Bgt bağlayıcı peptid (BBS) dahil edilmesi hem de uyarıcı ve inhibitör ligand-kapılı iyon kanalları ve G protein birleştirilmiş alıcıların 2,10,16-21 kaçakçılığı incelemek için kullanılmıştır. Bu BBS-temelli bir yöntem, yüzey biyotinilasyon yöntemler, hücre-dışı epitopuna antikor canlı hücrelerin antikor etiketleme ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi ticareti çalışmalar için kullanılan diğer yaklaşımlara avantajlar sağlamaktadır. Hücre yüzeyinde sırasında biotinilasyon serbest aminler kovalent hücresel aktiviteyi etkileme potansiyeline sahip, modifiye edilir. Antikor bazlı çalışmalar genellikle kaçakçılığı olayları değiştirebilir yüzey antijeni kümeleme veya kapatması, engel olmuştur. Nedeniyle sıkı bağlamak s beyazlatma aşamasındantudies önemli bir endişe, altta yatan hücresel yapının zarar veriyor. Diğer bir avantaj BBS konstruktları da biotin ile birleştirilmiş eşek bungarotoksin reseptör ticareti biyokimyasal yöntemleri için kullanılabilir etiketli olmasıdır. Bu teknik, hücre hatları ve primer hücre kolayca uygulanabilir. Belirtildiği gibi nikotinik asetilkolin (nAChR) reseptörlerini eksprese eden hücrelerde kullanım için, nAChR antagonist tubokurarin protokol boyunca kullanılmalıdır. Tubokurarin yokluğunda transfekte edilmemiş hücrelerde (endositoz protokolü için T = 0 zaman noktası eşdeğer) basit bir yüzey Bgt etiketleme Sahne endojen nAChR'nin kanıt sağlar.
Bu ilgilenilen protein plazma zarının teslim edilir hücre dışı bir konumda mevcut olduğu için bu tekniği kullanarak için önemli bir faktör, BBS uygun yerleştirilmesini içerir. Örneğin, GABAAR alt birimlerin N-terminal etki alanları prose sırasında veziküler lümen ikametticaretine ve hücre yüzeyi reseptörlerine ve endositik olayların hücre yüzeyinden kendi kaldırma değerlendirmesi belli etiketleme sağlayan, plazma zarında reseptör yerleştirilmesi sonra hücre-dışı hale gelir. Daha önce GFP, myc veya BBS eklenmesinin GABAAR alt birimlerin bu etki için epitoplarını göstermiştir ki, işlevsel olarak sessizdir. Standart kontrol uygun şekilde lokalize olduğunu ve etiketli protein, bir etiketlenmemiş yapısına benzer seviyelerde ifade olduğundan emin olmak için gerçekleştirilmiştir ve bu reseptör fonksiyonunu etkilemez edilmelidir. Transfekte yapıları Bu karakterizasyonu da sorun overekspresyonu kaygıları yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm protokoller IACUC ve Tıp Pittsburgh Üniversitesi Fakültesi KİK kurumsal inceleme kurulları ile uyumludur.
1.. Doku Kültürü Hood Hipokampal Nöronal Kültürler hazırlanması
Not: Protokol 1 genelinde Kullanım steril tekniği ve reaktifler.
- Nöronal kültürü için bir alt-tabaka olarak poli-D-lisin (0.1 mg / ml olarak H 2 O) kaplı cam lameller hazırlayın.
- Her 3,5 cm doku kültürü çanak içinde 4-5 yuvarlak cam lamelleri yerleştirin.
- Her biri 12 mm örtücü kısım üzerine Noktası 70 ul poli-D-lizin. Not: canlı görüntüleme için, bir cam 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabı (14 mm gömülü cam lamel üzerine 200 ul poli-D-lisin nokta) kullanılabilir dipli.
- Doku kültürü kaputu O / N. hazırlanan yemekleri bırakın Poli-D-lizin buharlaşmasını en aza indirmek ve doku kültürü kaputu steril yüzeyleri tutmak, pencere kanat kapatılması ve inci kapatmak içine blower O / N Not: UV lambaları O / N inkübasyon sırasında kullanılmazlar.
- Ertesi sabah, yıkama yemekler H2O 2 ml ile 3 kez
- 2 O yıkama son H çıkardıktan sonra, her 3.5 cm çanak medya 2 ml ekleyin ve adım 1.4 nöronlar plaka hazır olana kadar inkübatör yemekleri bırakın.
- Hipokampal nöron embriyonik gün 18-19 (Goslin 22 değiştirilmiş) (E18-19) sıçanları hazırlanır.
- Maxiprepped yapısı, 1-4 ug DNA ile kültür gününde taze ayrışmış nöronlar transfekte.
Not: Genellikle DNA 3 ug 50% bir canlılığı ve 2.000.000 nöronlar başlayarak% 60 bir transfeksiyon verimliliği (örn, 1-2.000.000 nöron transfekte edilir: ((2 x 10 x 6 nöronlar 0.5) 0.6) içerir Yaklaşık 1 milyon dolar nöronlar.. potansiyel sorunlarını giderirken 1 transfekte olan 600,000 olan yapı DNA'nın Farklı miktarlarda transfekte edilebiliryapı, lokalizasyonu ve fonksiyon uygun karakterizasyonu, ardından aşırı ifade,. - 3.5 cm tabak başına yaklaşık 200,000 nöronların nihai yoğunlukta poli-D-lisin kaplı lamelleri transfekte nöronlar Plate. Not: Bir cam dipli çanak için, 14 mm cam alanı üzerinde 40,000-50,000 nöronlar plaka.
- Medya nöronal kültürlerin hazırlanmasından sonra 4-24 saat değiştirin, sonra nöronlar in vitro (DIV) veya istenilen aşamada 14-17 gün kadar inkübatör içinde geliştirmesine olanak sağlar.
2. Endositoz Deneyi
DİKKAT: α-bungarotoksinin ve tubokurarin atık ve kullanım ile ilgili Not:
- Tüm peptid Nörotoksinlerin taşınması Biyogüvenlik Düzeyi-2 (BL-2) araştırma protokollerine kurallar içinde tavsiye edilir. Tüm uygun kişisel koruyucu donanım giyilmelidir. Liyofilize tozlar toksin üretici firmanın talimatlarına uygun olarak yeniden olmalıdır. Toksin atık should düzenleyen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği kurallarına uygun olarak imha edilmelidir.
- Depolama sırasında oluşabilen olası peptid agrega kaldırmak için, α-bungarotoksin tam bölünen miktarları, kullanımdan önce kısa bir süre için santrifüj edilmelidir, ve süpernatant deney için kullanılmalıdır.
- α-bungarotoksin (Bgt) stokları, -20 ° C'de steril H2O içinde 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspansiyona alınmış ve 10 ul alikolar içinde saklanır Floresan bağlanmış Bgt stokları 3 ug / ml 'de kullanılmıştır. Tubokurarin, 150 uM değerinde bir nihai konsantrasyonda kullanılmıştır.
- Üstüne ince alüminyum veya paslanmaz çelik levha ile soğuk bir odada 16 ° C'ye ayarlayınız tezgah üst ısıtıcı blok. Mevcut Alternatif olarak, bir tezgah üstü soğutma / ısıtma cihazı 16 ° C gerektiren her adım için kullanılabilir
- MM olarak ihtiva eden hücre dışı serin Hepes-tamponlu tuz çözeltisi (HBS: 135 NaCl, 4.7 KCl, 10 HEPES, 11 glukoz, 1,2 MgCl2, ve 2.5CaCl2, bir su banyosu içerisinde 16 ° C'ye pH 7.4) eklenmiştir.
- 16 ° C 'de alüminyum levha transfer nöron yemekleri ve 5 dakika boyunca soğuk.
- Ortamı çıkarın (adım 2.8, endositoz deney zaman noktaları için kuluçka makinesi içinde koşullu ortam ve rezerv tutmak) ve 2 dakika boyunca 16 ° C HBS + tubokurarin (150 uM), 1 ml ile değiştirin.
- Etiketli bir atık kabına HBS + tubokurarin çıkarın ve Alexa 594 [3 ug / ml], 15 dakika boyunca 16 ° C'de inkübe 1 ml 16 ° C HBS + tubokurarin (150 uM) + α-bungarotoksinin ile değiştirin.
- Kaldır HBS + tubokurarin + α-bungarotoksin Alexa 594 (yıkar% 50 çamaşır suyu 50 ml içeren bir vakum şişesine aspirasyon yoluyla tahsil edilebilir), atık konteyneri, etiketlenmiş ve yemekler 16 ° C HBS 2 ml 3x yıkayın.
- Bir bardak kullanarak reseptör endositozu aşağıdaki canlı görüntüleme zaman serisi deneyleri 3,5 cm kültür dipli çanak için, adımları 2.1-2.6 gerçekleştirin, daha sonra ısıtılmış sahneye çanak transferi(Peltier cihaz) mikroskop ve konfokal veya TIRF mikroskop kurulumu ile görüntüleme başlar.
- 2.9 adım diğer lamelleri ile devam eden, 20 dakika boyunca RT% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz bir çanak içine T = 0 zaman noktası lamelleri aktarın.
- Diğer zaman noktaları için, ile HBS yerine 37 ° C ortam (adım 2.4 aittir) ve 37 ° C Not endositoz için inkübatör dönmek dengelenmiş klimalı: ek süre T = 15 puan, 30, ve 60 önerdi.
- Zaman noktalarında gerekli, inkübatörden yemekler almak RT DPBS 2 ml hızla iki kez yıkayın (herhangi bir kalsiyum, magnezyum, DPBS), daha sonra 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz içinde çözmek.
- 20 dk Fiksasyon sonra, kabı atık ve 2 ml RT DPBS ile iki kez bulaşıkları yıkamak için% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz kaldırın.
- Immünofloresan blok çözeltisi içinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe lamelleri (blok çözeltisi = DPBS içinde% 5 at serumu,% 0.5 BSA) geçirgenliğini için% 0.2 Triton X-100 ihtiva edennöronlar ize ve hücre içi reseptör havuz ve / veya ilgi duyulan diğer proteinlerin etiketlenmesine anti-GFP immün sağlar.
- Blok +% 0.2 Triton X-100 çıkarın ve 20-30 dakika boyunca Triton X-100 olmadan imüno blok çözeltisi içinde lamelleri inkübe edin.
- 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N birkaç saat boyunca blok lamelleri birincil antikor inkübasyonlar yapın Not: 4 ° CO / N de Primer ile lamelleri kuluçka rutin geliştirilmiş immunofloresans sonuçlar üretir.
- Yıkama DPBS (her bir yıkama adımı boyunca 5 dakika) ile 3 kez lamelleri.
- Oda sıcaklığında 1 saat blok çözeltisi içinde sekonder antikor ile inkübe lamelleri.
- Yıkama DPBS (her bir yıkama adımı boyunca 5 dakika) ile 3 kez lamelleri.
- Tek tek her lamel taşıma Dağı lamelleri: laboratuvar doku ile lamel arkasından aşırı sıvı kaldırmak sonra bir cam slayt orta montaj 4 ul üzerine lamel ters.
- Oda sıcaklığında kurumaya slaytlar st daha sonra 30 dakika boyunca kapalı izin ver4 ° C'de cevher mikroskobu gerçekleştirmek için hazır olana kadar.
- Görüntü edinimi ve konfokal mikroskopi (deneysel durumuna kör) ile deney analizi. 60X petrol NA aşağıdaki lazerler ile 1.49 daldırma hedefi: Argon gazı 488 nm, 561 diyot, 640 diyot.
- Aynı görüntü elde etme ayarlarını kullanarak, nöronal hücre gövdesi ve odak çeşitli dendritik süreçleri ile tek Z bölümünde görüntü kazanır.
- Tüm endositoz verilerin analizi için aynı eşik kullanarak, nöron başına 3-4 proksimal dendritlerin 20 mikron birlikte α-bungarotoksin Alexa floresan sinyali ve GFP bağışıklık boyamasım ölçmek.
- Birkaç bağımsız nöronal kültürler ile deney tekrar, her bir zaman noktası için 10-12 nöronlardan verileri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BBS etiketli yapı karakterizasyonu gibi ifade edilen protein (özellikle birden fazla alt-birimden oluşan alıcıları ile) uygun bir şekilde bir araya saptanması önemlidir kontrolleri içeren, hücre yüzeyine trafikleri ve uygun şekilde lokalize eder. İnhibitör sinaps önleyici iskele protein gephyrin ile colocalize ve sinaptik vesiküller (VIAAT / VGAT) içine ve GABA glisin yükler veziküler önleyici amino asit taşıyıcı ile tanımlanır presinaptik inhibitör terminalleri, apposed olan bir reseptör yüzeyi kümeleri GABA oluşmaktadır. Α2pHGFP + BBS anti-GFP antikor ve postsinaptik önleyici protein gephyrin skafold (Şekil 2A) ya da VIAAT (Şekil 2B) ya da reseptörü ile birlikte, toplam nüfus için immün ardından Bgt ile etiketlenmiş yüzey GABAAR, nöronları ifade ile, Şekil 2'de gösterilmiştir.
Şekil 3, α ve endositoz göstermektedir2 15 DIV hippokampal nöronlardaki de GABAAR ihtiva etmektedir. Panellerin (Şekil 3A) 'de gösterildiği gibi tek tek dendritik süreçlerin Bgt floresans ölçümleri GFP antikor lekelemesi yoluyla yapısı, ekspresyon seviyesine normalleştirilir. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, zaman noktalarında nihai karşılaştırılması, T = 0 ölçümü için normalleştirme tarafından yapılır. Zamanla floresan sinyal değişiklikleri bir 60 dakika süre (Şekil 3B) üzerinde reseptörlerinin içselleştirilmesi Kantitasyonu (SEM Ortalama ±: T0 = 100 ± 7.2, T15 = 74.7 ± 12.9, T30 = 44.7 ± 5.6 ve T60 = 19.1 ± 3.4 dakika t 1/2 = 26 ± 4.8 dk):) en iyi 37 º C'de (tek üstel tarafından tarif edilmiştir.
Şekil 4'te gösterilen alternatif bir yaklaşım, canlı görüntüleme zaman atlamalı konfokal mikroskobu ile tek nöron reseptör endositoz takip etmektir. Yüzey pHGFP ve noktasal ve örtüşen floresan GABAAR ve Bgt l etiketlendi abeled reseptörleri Deneyin (T0) başlangıcında görülebilir. Süresi boyunca, Bgt reseptörleri endositoz olarak pHGFP sinyal nedeniyle yeni alıcı ekleme yüksek kalırken GABA AR sinyal, azalır etiketli. PhGFP sinyalinde minimal bir azalma hücre yüzey reseptörü dağıtım değişim ve ışıkla ağartma kaynaklanmaktadır.
Şekil 1,. BBS ve pHGFP diyagramı GABAAR alt birimini ve endositoz tahlili etiketli. Endositoz birinci, bağlanmamış toksini çıkarmak için kısa bir yıkamadan ve ardından nöronların veya hücrelere bir floresan işaretli bungarotoksin, tatbik edilmesi ile ölçülmektedir, daha sonra floresan zarar reseptörleri olarak izlenir içselleştirilmiş.
jpg "width =" 500 "/>
BBS ve pHGFP Şekil 2.. Konfokal görüntüleme inhibitör sinaps bileşenleri ile ilgili lokalizasyon gösteren GABAAR etiketledi. Nöronlar α-bungarotoksin Alexa 594 immünoboyamayla ardından (kırmızı) ile etiketli ifade α2pHGFP + BBS GABAAR Yüzey, dendritlerin genişlemeler gösterilir Her nöronun hakkı. Birleştirilmiş paneli (mavi α-bungarotoksin kırmızı Alexa 594, GFP yeşil, gephyrin veya VIAAT). Yüzey Bgt presinaptik işaretleyici VIAAT için) A ile postsinaptik inhibitör iskele protein gephyrin ve B) appozisyon GABAAR gösterisi ko etiketli. (Ölçek bar, 10 mikron.)
Şekil 3. 15. DIV hipokampal nöronlarda GABAAR endositozun Konfokal görüntüleme. A) B) Grafik Alexa analiz 4 süreçleri, zaman noktası başına 10-12 nöronlar () T = 0 (normalize endositozla zamanla 594 floresan kaybı yüzey GABAAR α-bungarotoksin temsil eder nöron başına; hata çubukları), ± SEM.
Şekil 4. 15. DIV hipokampal nöronlarda GABAAR endositozun konfokal görüntüleme Canlı. A) B3pHNöronlarda yüzey GABAAR içeren GFP + BBS canlı etiketli α-bungarotoksin Alexa 594 yıkanarak bağlanmamış α-bungarotoksin Alexa 594 kısa bunu takiben (kırmızı) ile idi. Nöronlar, 1 dakika süre aralığı (Ölçek çubukları, 10 um) kullanılarak 20 dakika boyunca HBS'de 37 ° C'de eş odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir. T0 pHGFP sinyal ile yardımcı sınırlama tarafından görüldüğü gibi Bgt Etiketli GABAARs, T0 hücre yüzeyine lokalize edilmiştir. Zaman süresi boyunca, Bgt GABA AR sinyal alıcıları endositoz olarak reseptörleri ifade eden yeni pHGFP sürekli olarak dahil edilmektedir, etiketli azalır, bu nedenle pHGFP sinyalinin hemen hemen sabit kalır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan BBS göre sabit ve canlı teknikleri reseptörü veya hücre hatları, nöronlar ve diğer primer hücrelerde diğer plazma zar proteini kaçakçılığı izlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, başarılı bir zar yerleştirilmesi ve ligand-kapılı iyon kanalları ve GPCR çıkarılmasını çalışma nedeniyle reseptör agonistleri ve modülatörlerinin varlığında sirkülasyondan değişiklikleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Anahtar açıdan uygun bir hücre dışı bir konuma etiketin lokalizasyonu ve BBS bu ek performans sağlamak için kontroller (örneğin GFP gibi muhabir için, standart olarak) fonksiyonel olarak sessizdir içerir. Belirtildiği gibi nikotinik asetilkolin (nAChR) reseptörlerini eksprese eden hücrelerde kullanım için, nAChR antagonist tubokurarin protokol boyunca kullanılmalıdır. Ek GFP etiket kullanılmaz durumda, BBS total protein seviyesi tespit permeabiliz ve sonra başka bir florofor bağlanmış ek bir α-bungarotoksinin ile boyanması ile tespit edilebilir etiketlitirme. Ilgi reseptör / protein endositoz oranlarını ölçmek için zaman noktalarının seçimi, daha fazla zaman noktaları başlangıç kullanımı ile birlikte, reseptör / protein, ticareti için mevcut bilgiyi değerlendirmek gerektirir. Bu teknik aynı zamanda hali hazırda geleneksel immüno-lekeleme ile kullanılabilecektir. Biz de canlı konfokal görüntüleme deneyleri izleme ile reseptör endositosis için alternatif bir yaklaşım açıklar. Ekipman durumu, canlı deneyleri, deneysel ve diğer kısıtlamaları için zaman gereksinimleri yöntemi, her ikisi de uygulanabilir ve yayınlanan tekniklerinin seçimi rehberlik edecektir. BBS tekniklerin gelecekteki uygulamalar yani lizozomlardan yoluyla plazma zarı veya bozulma endozomları ve redelivery geri dönüşüm hedefleyen, reseptör akıbetini takip etmek endozomal ve lizozomal işaretleri ile kombine canlı veya sabit görüntüleme içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Destek Tıp Pittsburgh Üniversitesi Okulu'nda Farmakoloji ve Kimya Biyoloji Bölümü'nden başlangıç fonlar tarafından sağlanmıştır. Nicholas Graff: video gönderme katkıda Jacob laboratuvar üyeleri tanınması.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
- Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
- Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
- Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
- Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
- Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
- Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
- Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
- Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
- Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
- Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
- Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
- Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
- Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
- Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
- Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).
