Summary
Den extracellulära matrisen undergår väsentlig ombyggnad under sårläkning, inflammation och tumörgenes. Vi presenterar en ny intravital immunofluorescensmikroskopi metod för att visualisera dynamiken i fibrillar samt maskliknande matriskomponenter med hög rumslig och tidsmässig upplösning med hjälp epifluorescence eller två foton mikroskopi.
Abstract
Förutom att vara en fysisk byggnadsställning för att hålla vävnader morfologi, är den extracellulära matrix (ECM) aktivt involverade i regleringen av cell-och vävnadsfunktion under utveckling och organ homeostas. Det gör man genom att agera via biokemiska, biomekaniska och biofysikaliska signalvägar, exempelvis genom frisättning av bioaktiva ECM proteinfragment, som reglerar vävnad spänning, och ger vägar för cellmigration. Den extracellulära matrisen hos tumormicroenvironmenten undergår väsentlig ombyggnad, som kännetecknas av nedbrytning, avsättning och organisationen av fibrillära och icke-fibrillära matrisproteiner. Stromal förstyvning av tumormicroenvironmenten kan främja tumörtillväxt och invasion, och orsaka ombyggnad av blod-och lymfkärl. Live avbildning av matrixproteiner, är emellertid att denna punkt begränsas till fibrillära kollagener som kan upptäckas av andra harmoniska generationen med hjälp av multi-foton mikroskopi, vilket majoriteten av matriskomponenter largely osynlig. Här beskriver vi rutiner för tumörympning i tunna rygg örat hud, immunmärkning av extracellulära matrixproteiner och intravital avbildning av den exponerade vävnaden i levande möss med hjälp epifluorescence och två foton mikroskopi. Vår intravital avbildningsmetod möjliggör direkt detektion av både fibrillär och icke-fibrillära matrixproteiner inom ramen för en växande dermal tumör. Vi visar exempel på fartygets ombyggnad orsakade av lokal matris kontraktion. Vi fann också att fibrillär matris av tumören upptäcks med den andra harmoniska generationen är rumsligt skild från nyligen deponerade matriskomponenter såsom tenascin C. Vi visade även på lång sikt (12 timmar) avbildning av interaktion T-celler med tumörceller och tumörceller migration längs kollagen IV i basalmembran. Sammantaget visar denna metod medger unikt för samtidig detektion av tumörceller, deras fysiska mikromiljön och den endogena vävnaden immunsvar över tid, vilket kan PROVide viktiga insikter i de mekanismer som ligger bakom tumörprogression och slutliga framgång eller resistens mot behandlingen.
Introduction
Intravital avbildning av inflammatoriska, metastaserande och matris remodeling processer har varit ett viktigt område för forskning och har motiverat att skapa ett stort antal transgena musmodeller reporter som uttrycker fluorescerande proteiner 1,2. På grund av out-of-fokus fluorescerande signaler, vilket minskar bildkvaliteten och begränsar ljuspenetrering genom vävnaden, är det möjligt att avbilda tjock vävnad endast med konfokala eller flera foton scanning mikroskopi 3. Använda snabbare, är möjlig mindre dyr och komplex epifluorescensmikroskopi endast med nästan två-dimensionella vävnader såsom kyckling chorio-allantois membran 4 eller mus öronhuden 5. De flesta bildsystem utnyttjar transgena möss som uttrycker olika fluorescerande proteiner i en celltyp-specifikt sätt. Även om dessa proteiner har svaga fototoxicitet, de inducera immunsvar 6. Dessutom är det svårt att växla mellan specifika cell subtyper eller markerair basala eller aktiverade stater som sådan förändring kräver utarbetandet av en ny genetisk modell. Dessutom, som fluorescerande protein uttryck är i allmänhet begränsad till intracellulärt, är det oftast inte möjligt att bildcellulära strukturer som basalmembranproteiner eller vävnad kemokina insättningar 7. Istället indirekt märkning med antikroppar mot extracellulära antigener erbjuder flexibilitet för praktiskt taget alla celltyp eller matris specifik komponent 8,9. Emellertid är den största nackdelen med denna märkning tillvägagångssätt associeras med immuntoxicitet medierad av antigen-antikroppsimmunkomplex som kan utlösa komplementsystemet beroende celltoxicitet och fagocytos av celler och extracellulära strukturer 10.
Den extracellulära matrix av tumören mikromiljö, men även av normal vävnad vid inflammation eller sårläkning, genomgår omfattande ombyggnad. Stromal förstyvning av tumormicroenvironmenten kan promote tumörtillväxt och invasion på grund av stress-inducerad signaleringsmekanismer och orsaka ombyggnad av blod-och lymfkärl 11. Dock är levande avbildning av matrixproteiner begränsat till fibrillära kollagener som kan upptäckas av andra harmoniska generationen med hjälp av multi-foton mikroskopi. Nyligen har vi publicerat en roman intravital avbildningsmetod som minimerar risken för foto-och immun-toxisk skada på avbildade celler och vävnadsstrukturer 5. I jämförelse med etablerade avbildningstekniker där den enda omgången av kontinuerliga intravital visualisering är i ett intervall av 30 minuter till 2 timmar 12 till 17, vår intravital immunofluorescens (IF)-teknik tillåts 12 timmar (långtids 8) avbildning. Det är viktigt att notera att avbildningstiden är begränsad till 12 timmar på grund av begränsningarna i vår djur-protokollet men det finns inga tekniska kontraindikationer att den inte kan förlängas om kritiska hälsoparametrar hos djur, som blodtryck och hjärtahastigheten styrs 8. Dessutom, genom att använda en automatiserad fluorescens stereomikroskop kunde vi samla in bilder från flera fält under ett enda experiment och observerade sällsynta immunologiska och ombyggnad processer som inträffade i fysiologiska sammanhang i huden som stöds av funktionell blod-och lymfkärl. Eftersom stereomicroscopic lins har en relativt stor, 2 cm, arbetsavstånd och i motsats till två-foton-mikroskopiska optik kräver inte förånga vattennedsänkning var långsiktig avbildning utförs endast under fluorescensstereomikroskop. Intravital IF tillät immun märkning och upptäckt av extracellulärmatrix komponent i normal hud. Utformningen av denna teknik är baserad på innovativa koncept för att använda immunfärgning för levande celler och vävnader matriselementen på kirurgiskt exponerade mus dermis utan att orsaka skadliga immuntoxiska effekter 5. Det kirurgiska ingreppet i sig är säkert att dermiskärlsystemet eftersom det bygger bara på separation av två hudlagren i örat som oberoende är innerveras, autonomt matas av blod och dräneras av separata lymfatiska upplagor. Vår experimentuppställning möjliggör avbildning av en rad viktiga patofysiologiska händelser under minst 12 timmar, inklusive leukocyt handel mellan blod-och lymfkärl och sårläkningsprocesser. I den ursprungliga publiceringen, vi jämfört vår teknik för att state-of-the-art standarder inom olika områden av intravital avbildning. Följaktligen konstaterade vi blodkärl extravasering och lymfatiska intravasation händelser genom olika typer av leukocyter, inklusive den unika visualisering av immunceller som leds in i stället för förväntade initiala lymfkärl 15. Dessutom kompletterar de iakttagelser som gjorts av andra grupper 9,18, fann vi att in vivo CCL21 kan bilda starka, diskontinuerliga avlagringar på att samla in, men bara sällan på initiala lymfkärlen.
19. Vi fann att det fibrillära matrisen av tumören, detekteras med den andra harmoniska generationen, intar olika platser i tumörens mikromiljö än den nyligen deponerade matris bestående av tenascin C. Dessutom beskriver vi exempel på fartygets ombyggnad orsakade av lokal matris kontraktion, lång- sikt (12 timmar) avbildning av T-cellsinteraktioner med tumörceller och tumörcellmigration längs kollagen IV i basalmembranet. Sådana händelser kan avbildas samtidigt som du spelar in lokala fysiologiska parametrar som blodkärls permeability och lymfdränage.
Protocol
Alla ingrepp på djur var i strikt enlighet med schweiziska djurskyddslagen, förordningen om djurskydd och förordningen om djurförsök det. Vi bekräftar att vår Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), uppkallad Commission de Surveillance de l'Etat de Vaud (Tillståndsnummer: 2687), uttryckligen godkänt denna studie.
1. Tumörympning Örats
- Kultur B16-F10-GFP melanomceller i en 10 cm petriskål med DMEM + 10% FBS media.
- När cellerna är 80-90% sammanflytande, tvätta dem med PBS och ta dem med trypsinization. Centrifugera ner cellerna vid 1500 xg under 5 min vid 4 ° C och återsuspendera pelleten i 1 ml Ringers lösning och överföra det till ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Snurra igen och ta bort alla supernatanten utom ett tunt lager av medium som stannar precis ovanför pelleten. Omsuspendera cellerna att sluta med en tjock cell uppslamning.
- Bedöva musen med en blandning av marknadenamin / dorbene [medetomidin] (75mg/kg-1mg/kg) och bekräfta att djuret är tillräckligt sövd genom att utföra en mild tå nypa. Öka isofluran koncentrationen i steg om 0,1% i fallrörelser observeras (t.ex. tillbakadragande av tassen). Håll musen på en rektal termistor kontrollerad värmedyna (37 ° C) under hela proceduren och skydda sina ögon med en lämplig oftalmologiska salva.
- Förbered en Hamilton spruta (33 G nål, 10 ml spruta volym). Tag bort locket med nålen och placera 20 | il av cell uppslamning ovanpå spetskammaren. Dra tillbaka kolven tills 5 ml slam laddas inne i sprutan. Avlägsna överskott av uppslamningen från spetskammaren och stänga spetslock.
- Med hjälp av tejp, fixera den proximala kanten av örat på spetsen av ett pekfinger. I en 45 ° vinkel, långsamt in Hamilton sprutan nål mellan rygg dermis och brosk. Väl inne penetrera örat proximal till distal under ca 2-3 mm.
- Spruta in 3 mikroliter cell flytgödsel och sakta dra in nålen från örat.Låt tumörceller bildar en solid tumör under 7-9 dagar och följa tumörtillväxt med hjälp av en fluorescensstereomikroskop.
- Alternativt, för att följa de tidiga stegen av tumörcell interaktion med vävnadsmatrisen, applicera 50 pl av 100.000 tumörceller suspenderade i Ringers lösning på de exponerade och färgade öron dermis (efter steg 3,3).
2. Öron Kirurgi
- Tre dagar före experimentet, raka musens huvud, Vaxning varar håren runt huvudet och öron (10-15 sek) och skölj med vatten.
- Bedöva musen med en blandning av fuktig syre och isofluran (3-4% induktion, 1-2% underhåll) och bekräfta att djuret är tillräckligt sövd genom att utföra en mild tå nypa. Öka isofluran koncentrationen i steg om 0,1% i fallrörelser observeras (t.ex. tillbakadragande av tassen). Håll musen på en rektal termistor kontrollerad värmedyna (37 ° C) under hela proceduren och skydda sina ögon med enlämplig oftalmologiska salva.
- Bygg en plattform gjord av 8 limmade glas histologi diabilder. Vänd musen på rygg och placera försiktigt tumörbärande öra på stapeln av glasskivor. Använd små remsor av tejp för att fixera de främre och bakre kanterna på örat till stacken.
- Skär den ventrala huden på örat längs antihelix av musen pinna med hjälp av en skalpell. Med hjälp av böjda pincett, försiktigt dra av den ventrala dermis och brosk från rygg dermis där tumören var ympade. Dra av den ventrala hud och brosk med böjda pincett, utsätta rygg dermis. OBS: Om de stora kärlen i öra skärs eller blodcirkulationen inte återgå till det normala flödet i 15 min, kan örat inte användas för avbildning. Alltid hålla öppna örat huden fuktig med hjälp Ringers buffert och skydda luftfuktigheten med hjälp av ett täckglas.
- I de fall det finns ihållande blödningar formulär tumörkärl, stoppa blödningen genom att lägga till 100 ltrombin (5 U / ml) i Ringers buffert (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM natriumlaktat) ovanpå örat under 5 min.
- Tvätta örat två gånger med ca 5 ml Ringer-buffert och ta bort extra vätska med sterila dukar. Omedelbart gå vidare till nästa steg (låt inte den öppna örat torr när som helst!).
3. Immunofluorescensfärgning
Användning Ringers buffert kompletterat med humant serum (1:10), mus-polyklonal sekundär antikropp mot humant IgG (1:50) och 125 lU / ml (2,5 mg / ml) aprotinin (blockeringsbuffert) för alla färgningssteg. Aprotinin hämmar plasmin främjar koagulering att begränsa initial blödning som kan uppstå efter operationen.
- Vik delen av örat med de öppna dermis i eminentia conchae och torka de yttre oöppnade öron dermis med sterila dukar. Immobilisera örat på stapeln av glasskivan genom att applicera 0,5 pl av kirurgiska lim till främre och bakre Dorsal kanter. Sedan, försiktigt plattar de dorsala öron dermis på glaset.
- Använda primära antikroppar targeting extracellulära matrismolekyler i en koncentration av 10 ng / ml i en total volym av 100 | il blockeringsbuffert till det exponerade örat. Täck örat med ett täckglas för att förhindra färglösningen att torka på öron kanter. Inkubera under 15 min. Tvätta örat två gånger med cirka 5 ml av Ringers buffert.
- Tillämpa lämpliga sekundära antikroppar eller streptavidin konjugat (fluoroforer med en hög exciteringsvåglängd såsom 594 nm eller 647 nm är gynnsamma för intravital imaging) i en koncentration av 10 | ig / ml i en total volym av 100 | il blockeringsbuffert till det exponerade örat. Täck örat med ett täckglas och inkubera under 15 min. Tvätta örat två gånger med cirka 5 ml av Ringers buffert.
4. Interaktion av blodbuma Aktiverat Splenocyter med tumörceller in situ
- 7 dagar efter inoculation av GFP-B16-F10 melanom på baksidan huden på congenic mus, avliva djuret och samla mjälte. Isolera splenocyter med mekanisk störning av mjälten genom ett 70 ìm cell sil.
- Märknings splenocyter för 8 minuter vid 37 ° C med Red CMTPX cellcytoplasman fläck (1 | aM i PBS), tvätta 4 gånger i 15 ml vid 4 ° C och omedelbart injicera 200 ul serumfritt medium i svansvenen av mus vars öron var ympas med B16-F10-GFP 7 dagar tidigare.
5. Intravital Imaging med hjälp av en Stereo
- För korttids avbildning (upp till 2 timmar), tillsätt nyberedd steril askorbat-Ringer-buffert innehållande 140 mM natriumaskorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCl och 5 mM CaCl2, vid ett pH av 7,5 (askorbat-Ringers buffert slutlig osmolaritet 320 mOsm) ovanpå den immobiliserade öra. Täck örat med ett täckglas och börja avbildning genom användning av en fluorescensstereomikroskop med 2X lins.
- För långtids imaging(Mer än 2 timmar), placera utloppet av en nål (ansluten till en reservoar som innehåller askorbat-Ringer-buffert) under täckglaset, ca 0,5 cm från örat. Använd en peristaltisk pump med en hastighet av 1 | il / min för att kontinuerligt leverera askorbat-Ringer-buffert till kammaren under täckglaset.
- Ändra 1X objektiv (arbetsavstånd 6 cm) till 2X-objektiv (arbetsavstånd 2 cm). Öppna förvärv programvara och konfigurera inställningarna för den fluorescerande stereomikroskop. I kamerainställningarna väljer 12 bit som bilden färgdjup och justera kamerans olika grå skala värden från 0% (minimum) till 5,1% (max) och ange gammakorrigering på 2.
- Ställ förvärvsvinst till 1 (minimum), fluorescensintensiteten till 1000 (max), förstoringen inställd på 280X-320X och justera exponeringstiden undvika över-eller underexponering (exponeringstid bör vara mindre än 1 sek). Beroende på antalet avbildnings fält (vanligen 10-20), tidsintervall för förvärvscykel bör fastställas varamellan 1 till 2 min. Korta tider kan orsaka blekning och fototoxicitet.
- Välj flera fält som innehåller tumörceller såväl som färgade ECM-proteiner (såsom i figur 3). Med hjälp av motoriserade scenen, få bilder av lämpliga fluorescerande kanaler (t.ex. GFP och fluoroforen 647 i figur 3) över tid (t ex varje 2 min).
- Efter experimentet, avliva musen enligt lokala behandlingsrekommendationer djur. I det här fallet, i slutet av experimentet, avliva den sövda musen genom halsdislokation följt av avblodning (intrakardiell perfusion).
6. Intravital Imaging med hjälp av en multi mikroskop
- Med hjälp av silikonfett, bygga en cirkulär vägg av ca 2 cm i diameter och 2-3 mm höjd runt örat, med början vid basen av örat. Se till att det inte finns några läckande punkter. Fyll cirkeln med askorbat-Ringers buffert.
- Placera musenpå scenen och ansluta värmedyna (37 ° C).
- Öppna förvärv programvara och konfigurera inställningarna för multi mikroskop.
- Välj upp till fyra olika fält som innehåller tumörceller och färgade ECM-proteiner (såsom i figur 3). I detta exempel stämma Ti-Saphire laser till 850 nm för GFP signalerar en efterföljande enda foton 647 för fluoroforen 647 färgning och visualisera fibrillära kollagener med SHG. Förvärva bilder av lämpliga fluorescerande kanaler (t.ex. GFP och fluoroforen 647 i figur 3) och andra harmoniska generationen över tid, t ex varje 2 min, med nedsänkning i vatten HCX APO 20X med 1,00 NA objektiv och 2 mm arbetsavstånd.
- Efter experimentet euthanize sövda mus med halsdislokation följt av avblodning (intrakardiell perfusion).
Representative Results
Hittills är immunfärgning i levande vävnad inte typiskt används på grund av bildning av immunkomplex som leder till hög färgnings bakgrund och immunotoxicitet 20. Detta var övervinnas genom pre-blockerande Fcy receptorer på vävnadsmakrofager, alltså "bländande" dessa celler till efterföljande indirekt starkt immunfärgning. Som märkning var extracellulär kunde fototoxicitet och fluorofor blekning styras genom nedsänkning av vävnaden i naturlig antioxidant buffrad, isosmotisk askorbinsyra (Fig. 1 A). Sedan vår initiala beskrivning av denna metod 5, förbättrade vi vår anti-blekning och anti-fototoxisk teknik så att fotoblekning kan nu inte bara hämmas men helt förhindrade (Fig. 1B). Detta görs genom att bädda in i örat i en stor volym av antioxidant (100 | il) i kammaren där örat är immobiliserad. Observera att 300 sekunder konstant imaging tid motsvarar 10 timmars bildbehandling när bildernasamlas in för 500 msek varje minut (genomsnitts imaging inställningar).
Figur 1. Fotoblekning och fototoxicitet stoppades genom att ersätta klorid med askorbat i Ringers buffert och bädda in den exponerade örat i 100 pl volym av denna lösning. (A) Vävnad färgades först med en biotinylerad antikropp mot kollagen IV, skall den del av basalmembranet. Färgningen var senare detekterades med streptavidin-647 (röd), och sedan ständigt avbildas till 300 sekunder i antingen normal Ringers buffert (övre panelen) eller askorbat-Ringer-(lägre panelen). Observera att 300 sekunder konstant imaging tid motsvarar 10 timmars bildbehandling när bilderna samlas in för 500 msek varje minut (de vanliga avbildningsinställningar). Den ljusaste 25% av pixel intensitetsvärdena är grönfärgade. (B) Kvantifiering av immunofluorescens förfall (50% i Ringer-vs 0% i askorbat-Ringers). Värdena normaliserades till den ursprungliga fluorescensen. Bilder tagna med immunofluorescens stereomikroskop. Skala bar i A, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Undersöka samspelet mellan tumörmetastaserande celler och tumör stroma är avgörande för att förstå processen för tumörcellmigration och tumörimmunitet. Detta beror på det tumörassocierade stroma komponerar upp till 90% av tumörmassan och aktivt reglerar tumörtillväxt och metastatisk spridning 21. Men mekanistiska inblick i hur migrationsmatris driver tumörcellen mot antingen lymf-eller blodkärl saknas 22. Detta beror delvis på det faktum att intravital imåldring av matrisproteiner är begränsad till visualiseringen av förfallna fibrer av fibrillära kollagener som använder andra harmoniska generationen i två-foton-mikroskopi 23. Därför anpassade vi vår metod för visualisering av vävnad mikromiljön inklusive blod och lymfkärl, pericyter, nerver, muskler och adipocyter att inkludera direkt visualisering av extracellulära matriskomponenter. Många strukturer kan särskiljas baserat på deras morfologi efter immunfärgning för basalmembrankomponenter, såsom kollagen IV eller perlecan (Fig. 2A), men direkt färgning för specifika cellytmarkörer, t.ex. Lyve1 (fig. 2B och C) och podoplanin (Fig . 2C), gör ytterligare särskiljande initialt, kapillär lymfkärlen (Lyve1 +) från lymfatiska samlare (Lyve1 -). Färgning för matrisbundna CCL21 i huden visade insättningar av denna chemokine på basalmembranet av lymfatiska samlare identified med färgning för perlecan, den heparansulfat proteoglykan (Fig. 2D).
Figur 2. Exempel på levande färgning i en normal mus öron. (A) Färgning för perlecan, en basalmembrankomponent, skildrar alla blod-och lymfkärl, nerver, muskelfibrer och adipocyter. (B) Lyve1 färgning markerar den initiala lymfatiska kapillärnätverk. (C) Co-färgning för Lyve1 och podoplanin, en pan-lymfatiska markör, skildrar nätverk av initiala och samla lymfkärlen. Den dorsala öron dermis kan avbildas med klassiska epifluorescensmikroskopi (utan optisk sektionering) som öron dermis har lågt antal adipocyter som annars skulle täcka bildfältet. (D) CCL21 stai ning (grön) på lymfatiska basalmembran färgas för perlecan (röd). Bilder tagna med immunofluorescens stereomikroskop. Skala barer i A och B, 1 mm; i C, 100 nm och 50 nm i D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Viktigast är strukturella proteiner som normalt inte kan detekteras genom SHG, den klassiska matrisdetektionsmetoden 23, kan visualiseras. Till exempel fann vi att tenascin C (Fig. 3A), en matrisprotein som uttrycks vid tumörbildning, är sårläkning och inflammation 19 deponeras på olika platser i tumör stroma än fibrillära kollagener (Fig. 3B). Denna matris heterogenitet kan påverka tumör distribution och metastaser (fig. 3C) cell.
t "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 3. De dorsala öron dermis kan leva avbildas med multi-foton mikroskopi. Ett enda fält av tumör B16-F10. Tumör stroma märktes med tenascin C antikroppen och färgning detekterades med anti-get-594 åsna antikropp. Immunfluorescens av tenascin C (röd) nätverk visas i A-och fibrillära kolla detekteras med andra harmoniska generationen (SGH) i B. Dessa två nätverk överlagras med tumörceller (cyan) i C (sammanslagna). Ny tumör matris präglas av tenascin C inte överlappar med fibrillar gener upptäckta med SHG (grön). Bilden med 44, fyra gånger i genomsnitt z-sektioner med z-steg 1,0 um förvärvades 16 bitars färgdjup läge. Bilder tagna med två-photon mikroskop. Skala bar, 100 nm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter immunomärkning av olika tumörmatriskomponenter (t.ex. tenascin C och kollagen IV) av tumör matris vi kunde identifieras begränsad och plötsliga händelser av tumörmatris riktad ombyggnad (Video 1). Krafter som utvecklas inom tumormicroenvironmenten kan leda till expansion eller kontraktion av tumörmassan och följaktligen remodellering och töjning av tumörens kärlsystem till en liknande omfattning som vi visade tidigare i fallet med läkande sår 11,24.
Video 1. Utbyggnad av tumör matris märkta med kollagen IV (röd) och tenascin C (cyan) avlånga blodkärl (pil) och passivt translokerar tre tumörceller (grön). Lokaliserad sammandragning av teascin C-rika tumörmatris translocate blodkärl (röd horisontellt orienterad strukturee) med ca 100 nm under 12 timmar av bildbehandling. Bilder tagna med immunofluorescens stereomikroskop. Klicka här för att se video.
Med hjälp av flera foton mikroskopi med fluoroforen märkning är problematiskt eftersom fotonflöde som används i dessa experiment kommer snabbt bleka fluorescerande färger som inte skyddas från oxidation 25. Här visar vi att vi kan utföra två-foton tidsförlopp mikroskopi samtidigt avbildning immunolabeled tenascin C matris med minimal fotoblekning av fluoroforer även i hög fotontäthet två foton mikroskopi (Video 2).
Video 2. Fotoblekning av tenascin C immunofluorescens (röd) Låg nivå under två foton mikroskopi. B16-F10-GFP tumörceller (cyan) avbildades i öppen rygg örat 9 dagar efter ympning. Den fluorescerande signalen var skyddad av tillämpning av askorbat-Ringers buffert på den avbildade vävnaden. Andra harmoniska generationen (grön) är inte överlappar med ny matris representeras av tenascin C. 16 bitars färgdjup bild med 11, fyra gånger i genomsnitt z-sektioner med z-steg 1,9 um förvärvades i 15 min. Bilder samlades var 1 minut 5 sekunder i 6 z-plan som samlats. Klicka här för att se video.
Vi avbildas också immun-cell interaktioner med metastaserande tumörceller. CMTPX Märkta splenocyter från en tumörbärande mus extravaserat från tumörassocierade blodkärl 8 timmar efter intravenös transfusion, invaderade tumören matrisen och aktivt interagerade med tumörceller genom att bilda långvariga cellkontakter (Video 2). Fluorofor-647-märkta kollagen IV strukturer var resistenta mot fotoblekning under de 12 timmarna av bildbehandling.
Video 3. Interaktion av CMTPX Märkta splenocyter från tumör (B16-F10)-bearing mus med enskilda tumörceller (GFP-B16-F10). Splenocytes var iv transfusion efter vävnad färgning för kollagen IV. Kollagen IV-grön (647), splenocyter-röd (CMTPX), B16-F10 cyan (GFP). Bilder tagna med immunofluorescens stereomikroskop. Video längd 12 timmar. Klicka här för att se video.
Nyligen isolerade tumörceller överlagras på de exponerade öron dermis pre-färgade för kollagen IV. Vi kunde konstateras att efter vidhäftning till vävnaden vissa grupper av celler startade kollektiv migration längs basalmembranet av blodkärlen och adipocyter.
Video 4. Tumörceller migrera längs basalmembran. Normal öra huden färgas för kollagen IV (647, röd) överskiktades med nyligen passe B16-F10-GFP-celler och avbildas i 5 timmar. Vissa tumörceller som anslutit sig till vävnaden började kollektiva migration längsbasalmembranet av blodkärlen och adipocyter. Bilder tagna med immunofluorescens stereomikroskop. Video duration:. 5 timmar Klicka här för att se video.
Också, eftersom örat dermis är nästan tvådimensionell, vi kunde lätt samla stora mängder data med hjälp av snabb fluorescens stereomikroskopi, istället för långsammare och dyrare konfokal eller multi mikroskopi. Det är emellertid också möjligt att använda någon av de nämnda avsöknings mikroskopimetoder med vår intravital IF beredningar (Fig. 3, video 1).
Discussion
Signifikans
Här presenterar vi en ny intravital mikroskopi strategi som möjliggör hög upplösning och dynamisk visualisering av olika vävnadsmikrokomponenter, inklusive fibrillär samt maskliknande matrixproteiner. Denna metod har flera fördelar jämfört med nuvarande intravital avbildningstekniker: (i) Intravital fluorescens avbildning har använts i mikrocirkulation studier, t.ex. för att spåra solute läckage från blod eller in i lymfkärlen, men har inte kombinerats med immunfärgning. (Ii) användning av genetiskt modifierade reporter möss tillåter specifika celltyper som ska avbildas, men kräver tillgången (eller en väsentlig insats för att skapa nya) och begränsar antalet samverkande celltyper som kan studeras. (Iii) Extracellulär matris kan avbildas in vivo med användning av andra harmoniska generationen, men denna teknik kan bara detektera fibrösa kollagener och lämnar ett stort antal viktiga extracellulära komponentersåsom basalmembran, fibronektiner, tenascins, tillväxtfaktorer, kemokiner och vävnads glykosaminoglykaner utom räckhåll för aktuell forskning. Vår metod övervinner dessa begränsningar och tillåter standardavbildningstekniker som skall införlivas och dessutom kombineras med immunostainings för andra celltyper, vävnadsstrukturer, fyndigheter av heparinsulfat bindande tillväxtfaktorer (t.ex. VEGF 26) och kemokiner (CCL21 5,18 och figur. 2D ), eller extracellulära matrixproteiner och samtidigt spåra blod och / eller lymfatiska flöden.
Begränsningar
Den epifluorescens avbildning av intravital IF är begränsad till de tunna huden klaffar, berövade tjocka huden (fettvävnad). Samtidigt som vi fann att de dorsala öron dermis är optimal för relativt ofarliga kirurgiska utläggning av örat huden, epifluorescens med intravital IF tekniken inte är begränsad till öron dermis och skulle kunna tillämpas på t.ex.den exponerade huden på tår eller baksidan huden hos nyfödd mus. Snabb färgning antikropp (15 minuter) i immunofluorescens IF är inte beroende av passiv diffusion men kräver funktionellt lymfdränage och interstitiell fluidflöde, därav kan observeras ingen färgning om lymfkärl är ockluderad 27. I linje med detta, lymfkärl fläckar starkare sedan läckande blodkärlen (skadade fartyg, arterioler) 5. Separationen av den dorsala och ventrala örat hud klaffar är en mild kirurgiskt ingrepp, men det orsakar skada på vissa kapillärer och celldöd i olika vävnadsceller. Detta kan vara ett problem när en behöver utreda helt intakt vävnad, till exempel tittar på den milda effekten av läkemedel på cellöverlevnad. Även tillämpningen av antioxidant som tjänar till att skydda huden mot fototoxicitet och fotoblekning utesluter användning av intravital immunofluorescens teknik för att studera t.ex. vävnads oxidativ stress eller kväveoxid biology.
Slutligen kan blinding av vävnad residenta makrofager med immunkomplex aktiverar dessa celler och inflytande t.ex. studier av vävnad immunsvar och dendritisk cell-aktivering.
Ändringar och felsökning
För att studera vävnads oxidativ stress eller kväveoxid biologi, måste ersättas med andra vävnads kompatibla media som inte stör den experimentella utgång askorbat. På samma sätt bör blockera Fc-receptorer på dermala immunceller undvikas om målet med studien är att funktion och aktivering av vävnaden immunförsvaret och dendritiska cellaktivering och migration. Detta kan göras med användning av den sekundära antikroppen med Fc-fragmentet klyvs (F (ab) 2-antikroppsfragment) eller användning av biotinylerad antikropp och fluorescerande streptavidin som detektionsreagens.
Framtida applikationer
Vi presenterar en ny och unik inomavgörande om teknik för bild icke-fibrillar komponenter i extracellulär matrix i transplanterbara hudtumörer i kombination med SHG-detekterade fibrillär och mognat gener med hjälp av två-photon mikroskopi. En av fördelarna med att använda multifoton (eller konfokal) mikroskopi över epifluorescens avbildning är z-stapling möjlighet och följaktligen rumslig co-lokalisering av händelser som inträffar i extracellulära matrix, t.ex. tumör intravasation i lymfatiska eller blodkärlet, som i fallet med standard epifluorescensmikroskopi kan endast härledas från morfologiska förändringar av de invaderande cellen. Denna teknik har mycket bredare potential. Till exempel har vi använt intravital IF att undersöka mekanismen för lymfatiska ocklusion av lymfatiska specifika fotodynamisk terapi 27. Andra potentiella tillämpningar av denna metod innefattar, men är inte begränsade till undersökning av hud immunitet under inflammation, mekanism av transplantatavstötning eller metoder för blod och lymfa ATIC kärltillväxt under tumörbildning.
Kritiska steg i proceduren
Det viktigaste steget som har kritiska implikationer för att upprätthålla en fysiologisk vävnadsmiljö är en kirurgisk separation av den ventrala hud och brosk från rygg dermis. Kapning eller ockludera den stora artären eller venen kommer att leda till kraftig blödning och lokal vävnadshypoxi, vilket kommer att påverka cellulär respons till behandlingar och cellrörelse 8. Immobilisera örat med kirurgiskt lim bör ske med försiktighet eftersom många texter limmet på utsätta vävnaden kommer att orsaka permanent skada på vävnaden genom ocklusion av blodkärl. Temperaturen hos mus måste kontrolleras och hålls vid 37 ° C. Dessutom behöver fuktad syre som skall användas för den isoflurananestesi, så att ögon och lungor stanna ordentligt fuktas under experimentet. Dessutom måste natriumaskorbat beredas och dess pH kontrolleras före användning.
ntent "> Sammanfattningsvis överbryggar detta intravital immunofluorescens realtid, lokala mätningar av fysiologiska funktioner med molekylär avbildning av komplexa cellulära händelser i musen huden. Dessutom har denna metod en stor potential eftersom det lätt kan appliceras på t.ex. studiepostutvecklings mekanismer för blod och lymfa-angiogenes eller för att visualisera de tidiga faserna av hudinfektion av olika patogena agens. Med sin flexibilitet och hög genomströmning potential, kan detta intravital teknik avsevärt bidra till flera inom biologi.Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Jeremy CM Teo och S. Ryan Oliver för deras bidrag och Jolanta Kilarska för hjälp med bildbehandling. Vi tackar BlOP kärnanläggningen vid EPFL för stödet med två-photon mikroskopi
Detta arbete stöddes delvis av anslag från Europeiska forskningsrådet kommissionen (DC-lymfa, från 206.653 till 2), det europeiska ramverket Project 7 (AngioScaff), Swiss National Science Foundation (31-135.756), och National Institutes of Health (NIH) / NIH Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). Dessutom medel från Robert Wenner Award (Swiss Cancer League) tillät köpet Leica stereomikroskop som används i denna studie. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice Strain | |||
| BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
| C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
| Cell Line | |||
| B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
| Anesthesia Maintenance | |||
| Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
| Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
| DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
| Stereomicroscope | |||
| Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 1X lens (linear system magnification from 7.5X to 160X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 2X lens (linear system magnification from 15.6X to 320X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| Multiphoton Microscopy | |||
| LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| HCX APO 20X/1.2 oil immersion | |||
| Chameleon Ultra Laser | |||
| Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
| Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
| Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
| Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
| Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
| Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
| Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
| LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
| CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
| Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
| CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
| Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
| Cell Culture Reagents | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
| Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
| PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |
References
- Martinez-Corral, I., et al. In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis. Proc Natl Acad Sci. , (2012).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels. Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis. PLoS ONE. 8, (2013).
- Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).
- Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).
- Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. 1-14 (2005).
- Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nat Med. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. 15, 657-664 (2009).
- Sahai, E., et al. Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy. BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).
- Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).
- Pinner, S., Sahai, E. Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo. J. Microsc. 231, 441-445 (2008).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions. Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).
- Giampieri, S., et al. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
- Weber, M., et al. Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients. Science. 339, 328-332 (2013).
- Midwood, K. S., Orend, G. The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis. Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. 340-341 (2006).
- Sund, M., Kalluri, R. Tumor stroma derived biomarkers in cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies. Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).
- Patterson, G. H., Piston, D. W.
- Jakobsson, L., et al. Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis. Dev Cell. 10, 625-634 (2006).
- Kilarski, W. W., et al. Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis. Angiogenesis. , (2013).
