Summary
Den ekstracellulære matrix undergår en væsentlig ombygning i løbet af sårheling, inflammation og tumorigenesis. Vi præsenterer en roman intravital immunfluorescensmikroskopi tilgang til at visualisere dynamikken i fibrillar samt mesh-lignende matrix komponenter med høj rumlig og tidsmæssig opløsning ved hjælp af epifluorescens eller to-foton mikroskopi.
Abstract
Udover at være et fysisk stillads at opretholde vævsmorfologi, er den ekstracellulære matrix (ECM) aktivt involveret i reguleringen af celle-og vævs funktion under udvikling og orgel homøostase. Det gør den ved at handle via biokemiske, biomekaniske og biofysiske signalveje, såsom gennem frigivelse af bioaktive ECM protein fragmenter, regulering væv spænding, og give veje for celle migration. Den ekstracellulære matrix af tumormikromiljøet undergår en væsentlig ombygning, kendetegnet ved nedbrydning, aflejring og organisering af fibrillære og ikke-fibrillære matrix-proteiner. Stromal afstivning af tumormikromiljøet kan fremme tumorvækst og invasion, og forårsage omdannelse af blod-og lymfekar. Levende billeder af matrix proteiner imidlertid at dette punkt er begrænset til fibrillære collagener der kan påvises ved anden harmonisk generation ved hjælp af multi-foton mikroskopi, forlader størstedelen af matrixkomponenter largely usynlig. Her beskrives procedurer for tumorinoculation i tynde dorsale øre hud, immunolabeling af ekstracellulære matrixproteiner og intravital billeddannelse af det eksponerede væv i levende mus ved hjælp af epifluorescens og to-foton mikroskopi. Vores intravital billeddannelse fremgangsmåde giver mulighed for direkte detektion af både fibrillært og ikke-fibrillære matrix-proteiner i forbindelse med en voksende dermal tumor. Vi viser eksempler på fartøj remodeling forårsaget af lokal matrix sammentrækning. Vi fandt også, fibrillære matrix af tumoren detekteres med den anden harmoniske generation er rumligt adskilt fra nyligt deponerede matrixkomponenter såsom tenascin C. Vi viste også på lang sigt (12 timer) billeddannelse af T-celle-interaktion med tumorceller og tumorceller migration langs collagen IV basalmembran. Tilsammen denne metode entydigt giver mulighed for samtidig påvisning af tumorceller, deres fysiske mikromiljø og den endogene immunrespons væv over tid, hvilket kan provIDE vigtig indsigt i de mekanismer, der ligger til grund tumor progression og ultimative succes eller resistens over for behandlingen.
Introduction
Intravital billeddannelse af inflammatoriske, metastatisk og matrix remodeling processer har været et vigtigt område for forskning og har motiveret oprettelsen af talrige transgene reporter musemodeller, der udtrykker fluorescerende proteiner 1,2. På grund af out-of-fokus fluorescerende signaler, som reducerer billedkvalitet og grænser lysgennemtrængning gennem vævet, billedbehandling tyk væv er kun muligt med konfokal eller multi-foton scanning mikroskopi 3.. Ved hjælp af hurtigere, billigere og kompleks epifluorescens mikroskopi er kun muligt med næsten todimensionelle væv såsom kylling Chorio-allantois membran 4 eller museøre dermis 5. De fleste billeddannende systemer drage fordel af transgene mus, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner i en celletype-specifik måde. Selvom disse proteiner giver svage fototoksicitet de inducerer immunrespons 6. Desuden er det vanskeligt at skifte mellem specifikke celle undertyper eller markereir basal eller aktiverede stater som sådan ændring kræver, at udarbejdelsen af en ny genetisk model. Hertil kommer, fluorescerende protein-ekspression er generelt begrænset til intracellulære rum, er det normalt ikke muligt at billedet ekstracellulære strukturer som basalmembranproteiner eller væv chemokine indskud 7. I stedet indirekte mærkning med antistoffer mod ekstracellulære antigener giver fleksibilitet til stort set alle celle-type eller matrix specifik komponent 8,9. Men den største ulempe ved denne mærkning tilgang forbundet med immuntoksicitet medieret af antigen-antistof-immunkomplekser, der kan udløse komplementsystemet cellemedieret toksicitet og fagocytose af celler og extracellulære strukturer 10.
Den ekstracellulære matrix af tumormikromiljøet, men også af normalt væv under inflammation eller sårheling undergår en væsentlig ombygning. Stromal afstivning af tumormikromiljøet kan promote tumorvækst og invasion på grund af stress-induceret signalering mekanismer og forårsage omdannelse af blod-og lymfekar 11. Dog er levende billeder af matrix proteiner begrænset til fibrillære collagener der kan påvises ved anden harmonisk generation ved hjælp af multi-foton mikroskopi. For nylig har vi udgivet en roman intravital billedbehandling metode, der minimerer risikoen for foto-og immun-giftige beskadigelse filmede celler og vævsstrukturer 5. I sammenligning med etablerede billeddiagnostiske teknikker, hvor enkelt runde kontinuerlig intravital visualisering er i et interval på 30 minutter til 2 timer 12-17, vores intravital immunfluorescens (IF) teknik tilladt 12 timer (langsigtede 8) billeddannelse. Det er vigtigt at bemærke, at imaging tid er begrænset til 12 timer på grund af grænserne i vores dyr protokol, men der er ingen tekniske counter-tegn på, at det ikke kan forlænges, hvis de kritiske sundhedsmæssige parametre af dyret, som blodtryk og hjertesats styres 8. Hertil kommer, ved hjælp af en automatiseret fluorescens stereomikroskop vi var i stand til at indsamle billeder fra flere felter i løbet af et enkelt eksperiment og observerede sjældne immunologiske og remodeling processer, der fandt sted i den fysiologiske sammenhæng i huden understøttes af funktionelle blod og lymfe-fartøjer. Fordi stereomikroskopisk linse har en forholdsvis stor, 2 cm,-afstand og i modsætning til to-foton mikroskopiske optik kræver ikke fordampe nedsænkning i vand blev langsigtet billeddannelse udført kun under fluorescens stereomikroskop. Intravital IF tilladt immun mærkning og detektion af enhver ekstracellulære matrix komponent af normal hud. Udformningen af denne teknik er baseret på den innovative begrebet ved hjælp af immunfarvning for levende celler og væv matrix elementer på kirurgisk eksponerede mus dermis uden at forårsage skadelige immunotoksiske virkninger 5.. Den kirurgiske procedure selv er sikkert at dermisvasculature da det kun er afhængig af adskillelsen af to hudlag i øret, som er uafhængigt innerverede, autonomt fodret af blod og drænet af særskilte lymfe oplag. Vores forsøgsopstilling tillader scanning af en række vigtige patofysiologiske begivenheder over mindst 12 timer, herunder leukocyttrafik mellem blod og lymfekar og sårheling processer. I den oprindelige publikation vi sammenlignet vores teknik til state-of-the-art standarder i forskellige områder af intravital billeddannelse. Derfor observerede vi blodkar ekstravasation og lymfe intravasation begivenheder ved forskellige typer af leukocytter, herunder den unikke visualisering af immunceller ind i stedet for at indsamle forventede indledende lymfekar 15. Også supplere de observationer udført af andre grupper 9,18, fandt vi, at in vivo CCL21 er i stand til at danne stærke, diskontinuerte indskud på indsamling, men kun sjældent om de første lymfevejene.
19. Vi fandt, at fibrillære matrix af tumor, detekteret med den anden harmoniske generation, indtager forskellige steder i tumormikromiljøet end den nyligt deponerede matrix sammensat af tenascin C. Desuden beskriver vi eksempler på fartøjet remodeling forårsaget af lokal matrix sammentrækning, lang sigt (12 timer) billeddannelse af T-celle-interaktioner med tumorceller og tumorcellemigration langs collagen IV basalmembranen. Sådanne arrangementer kan afbildes samtidig optager lokale fysiologiske parametre såsom blodkarrenes permeability og lymfedrænage.
Protocol
Alle procedurer udføres på dyr var i nøje overensstemmelse med den schweiziske Animal Protection Act, i lov om dyrebeskyttelse og bekendtgørelsen om dyreforsøg. Vi bekræfter, at vores institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC), opkaldt Commission de Surveillance de l'Etat de Vaud (Tilladelsens nummer: 2687), der specifikt er godkendt denne undersøgelse.
1.. Tumorinokulation af øret
- Kultur B16-F10-GFP melanomceller i en 10 cm petriskål hjælp DMEM + 10% FBS medier.
- Når cellerne er 80-90% sammenflydende, vaske dem med PBS og frigøre dem ved trypsinisering. Spin ned cellerne ved 1.500 x g i 5 min ved 4 ° C, pellet resuspenderes i 1 ml Ringers opløsning og overføre det til et 1,5 ml Eppendorf-rør. Spin igen og fjerne al supernatant undtagen et tyndt lag af medium, der holder sig lige over bundfaldet. Resuspender cellerne at ende op med en tyk celleopslæmningen.
- Bedøver musen med en blanding af markedamin / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg), og bekræfter, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet ved at udføre en blid tå knivspids. Øg isofluran-koncentration i skridt på 0,1% i tilfælde bevægelser observeres (f.eks tilbagetrækning af poten). Hold musen på en rektal termistor kontrolleret varmepude (37 ° C) under hele proceduren og beskytte sine øjne med en passende oftalmologisk salve.
- Forbered en Hamilton sprøjte (33 G nål 10 sprøjtevolumen ml). Fjern hætten med nålen og indlæse 20 ul celleopslæmning oven spidskammeret. Træk stemplet tilbage, indtil 5 ml gylle er lagt inde i sprøjten. Fjern den overskydende gylle fra spidsen kammer og luk hætten.
- Ved hjælp af tape, fastsætte den proximale kant af øret på spidsen af en pegefinger. I en vinkel på 45 °, før langsomt Hamilton kanylen mellem dorsal dermis og brusk. Når indeni, trænge ind i øret proksimale til den distale for omkring 2-3 mm.
- Der indsprøjtes 3 pi celleopslæmningen og langsomt trække nålen fra øret.Lad tumorceller danner en fast tumor i 7-9 dage og følg tumorvækst ved hjælp af en fluorescens stereomikroskop.
- Alternativt til at følge de tidlige trin af tumor celle interaktion med væv matrix, anvende 50 pi 100.000 tumorceller suspenderet i Ringers opløsning på den udsatte og farvede øre dermis (efter trin 3.3).
2.. Øre kirurgi
- Tre dage før eksperimentet barbere musen hovedet, fjerne hår hårene omkring hovedet og ører (10-15 sek) og skylles med vand.
- Bedøver musen med en blanding af befugtet ilt og isofluran (3-4% induktion, 1-2% vedligeholdelse), og bekræft, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet ved at udføre en blid tå knivspids. Øg isofluran-koncentration i skridt på 0,1% i tilfælde bevægelser observeres (f.eks tilbagetrækning af poten). Hold musen på en rektal termistor kontrolleret varmepude (37 ° C) under hele proceduren og beskytte sine øjne med enpassende ophthalmisk salve.
- Byg en platform lavet af 8 limet glas histologi dias. Vend musen på ryggen og forsigtigt placere tumor-bærende øre på stakken af objektglas. Brug små striber af tape til at fiksere de forreste og bageste kanter af øret til stakken.
- Skær den ventrale huden på øret langs antihelix af musen pinna ved hjælp af en skalpel. Med hjælp af buede pincet, forsigtigt skrælle ventrale dermis og brusk fra dorsale dermis, hvor tumoren blev podet. Træk den ventrale hud og brusk med buede pincet, udsætter dorsale dermis. BEMÆRK: Hvis de store skibe i øret er skåret eller blodcirkulationen ikke vender tilbage til normale strøm inden for 15 min, kan øret ikke anvendes til billedbehandling. Altid holde den åbnede øre huden våd ved hjælp Ringers buffer og beskytte fugt ved hjælp af et dækglas.
- Hvis der er vedvarende blødning formular tumorkar, stoppe blødningen ved at tilsætte 100 pithrombin (5 U / ml) i Ringer-buffer (102 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 28 mM natriumlactat) oven på øret i 5 min.
- Vask øret to gange med omkring 5 ml Ringers puffer og fjerne ekstra væske med sterile klude. Umiddelbart gå videre til næste trin (lad ikke åbne øre tør på noget tidspunkt!).
3.. Immunfluorescensfarvning
Brug Ringers puffer suppleret med humant serum (1:10), muse polyklonalt sekundært antistof til human IgG (01:50) og 125 IU / ml (2,5 mg / ml) aprotinin (blokerende buffer) for alle farvningsprocedurer trin. Aprotinin inhiberer plasmin fremme koagulation at begrænse første blødning, som kan forekomme efter kirurgi.
- Fold den del af øret med de åbne dermis i eminentia conchae og tørre ydre uåbnede øre dermis med sterile klude. Immobilisere øret på stakken af objektglas ved at anvende 0,5 ul kirurgisk lim til den forreste og bageste Dorsal kanter. Derefter forsigtigt flade dorsale øre dermis på glasset.
- Anvend primære antistoffer rettet mod ekstracellulære matrix-molekyler i en koncentration på 10 ug / ml i et samlet volumen på 100 ul blokerende buffer til den eksponerede øre. Dæk øre med et dækglas for at forhindre farvningsopløsningen til tørre på øret kanter. Inkuber i 15 minutter. Vask øret to gange med omkring 5 ml Ringers puffer.
- Anvende passende sekundære antistoffer eller streptavidin konjugater (fluoroforer med stor excitationsbølgelængde såsom 594 nm eller 647 nm er gunstige for intravital billeddannelse) ved en koncentration på 10 ug / ml i et samlet volumen på 100 ul blokerende buffer til den eksponerede øre. Dæk øre med et dækglas og inkuberes i 15 min. Vask øret to gange med omkring 5 ml Ringers puffer.
4.. Interaktion af blodbårne Aktiverede Splenocyter med tumorceller in situ
- 7 dage efter inoculation af GFP-B16-F10 melanoma på bagsiden hud kongene mus, aflive dyret og indsamle milt. Isoler splenocytter med mekanisk sprængning af milten gennem et 70 um cellefilter.
- Label splenocytter til 8 minutter ved 37 ° C med Red CMTPX cellecytoplasma plet (1 uM i PBS), vaskes 4 gange i 15 ml ved 4 ° C og straks injicere 200 pi serumfrit medium i halevenen af mus, hvis ører inokuleret med B16-F10-GFP 7 dage tidligere.
5.. Intravital Imaging ved hjælp af et stereomikroskop
- Til kortvarig imaging (op til 2 timer), tilsættes frisk fremstillet steril ascorbat-Ringer puffer indeholdende 140 mM natriumascorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCI og 5 mM CaCl2, ved pH 7,5 (ascorbat-Ringer buffer endelig osmolaritet 320 mOsM) oven på det immobiliserede øre. Dæk øret med et dækglas og begynde billeddannelse ved hjælp af en fluorescens stereomikroskop med 2X linse.
- Til langvarig imaging(Mere end 2 timer), som anbringes udløbet af en nål (forbundet til et reservoir indeholdende ascorbat-Ringer buffer) under dækglasset, omkring 0,5 cm fra øret. Brug af en peristaltisk pumpe ved en hastighed på 1 ul / min til konstant at levere ascorbat-Ringer buffer til kammeret under dækglasset.
- Skift 1X objektiv (arbejder afstand 6 cm) til 2X objektiv (arbejder afstand 2 cm). Åbn erhvervelse software og konfigurere indstillingerne for det fluorescerende stereomikroskop. I kamera-indstillinger vælger 12 bit som billedet farvedybde og justere kameraets vifte af grå-skala-værdier fra 0% (minimum) til 5,1% (maksimum) og indstille gamma korrektion til 2..
- Indstil erhvervelse gevinst til 1 (minimum), fluorescens intensitet til 1.000 (maksimum), forstørrelse indstillet til 280X-320X og justere eksponeringstiden undgå over-eller under-eksponering (eksponeringstid skal være mindre end 1 sekund). Afhængig af antallet af imaging felter (normalt 10 til 20), tidsinterval for erhvervelse cyklus bør fastsættes værelem 1 til 2 min. Forkorte tider kan medføre blegning og fototoksicitet.
- Vælg flere felter, der indeholder tumorceller samt farvede ECM-proteiner (såsom i figur 3). Brug af den motoriserede trin erhverve billeder af de relevante fluorescerende kanaler (såsom GFP og fluorofor 647 i figur 3) over tid (fx hver 2 minutter).
- Efter eksperimentet, aflive musen efter fastlagte retningslinier dyr. I dette tilfælde ved afslutningen af eksperimentet aflive de bedøvede mus ved cervikal dislokation efterfulgt af afblødning (intrakardial perfusion).
6.. Intravital Imaging ved hjælp af en multiphoton Microscope
- Ved hjælp af silicium fedt, opbygge en cirkulær mur på omkring 2 cm i diameter og 2-3 mm højde rundt om øret, der starter ved basis af øret. Sørg for, at der ikke er utætte point. Fyld cirklen med ascorbat-Ringers buffer.
- Placer musenpå scenen, og tilslut varmepude (37 ° C).
- Åbent erhvervelse software og konfigurere indstillingerne for multiphoton mikroskop.
- Vælg op til fire forskellige felter, der indeholder tumorceller og farves ECM-proteiner (såsom i figur 3). I dette eksempel tune Ti-Saphire laser til 850 nm for GFP signal efterfølgende enkelt foton 647 for fluorofor 647 farvning og visualisere fibrillære collagener med SHG. Anskaf billeder af de relevante fluorescerende kanaler (f.eks GFP og fluorophor 647 i figur 3) og anden harmonisk generation over tid, fx hver 2 min, med nedsænkning i vand HCX APO 20X med 1,00 NA linse og 2 mm arbejder afstand.
- Efter eksperimentet aflive bedøvede mus med cervikal dislokation efterfulgt af afblødning (intrakardial perfusion).
Representative Results
Til dato er immunfarvning i levende væv typisk ikke anvendes på grund af dannelse af immunkomplekser, der fører til høj farvning baggrund og immuntoksicitet 20. Dette blev overvundet ved præ-blokerende Fcy receptorer på vævsmakrofager dermed "blinding" disse celler til efterfølgende indirekte kraftig immunfarvning. Som var mærkningen ekstracellulære kunne fototoksicitet og fluorofor blegning styres ved nedsænkning af vævet i naturlig antioxidant bufferet isosmotisk ascorbinsyre (fig. 1A). Siden vores indledende beskrivelse af denne metode 5, vi forbedret vores anti-blegning og anti-fototoksisk teknik, så fotoblegning kan nu ikke kun være hæmmet, men fuldstændig forhindret (Fig. 1B). Dette gøres ved at indlejre øret i et stort volumen af antioxidant (100 ul) i kammeret, hvor øret er immobiliseret. Bemærk, at 300 sekunder konstant billedbehandling tid svarer til 10 timers billedbehandling, når billederne erindsamlet til 500 msek hver minut (den gennemsnitlige imaging-indstillingerne).
Figur 1.. Fotoblegning og fototoksicitet blev stoppet ved at erstatte chlorid med ascorbat i Ringers buffer og forankre den udsatte øre i 100 ul af den pågældende løsning. (A) Væv blev farves først med et biotinyleret antistof mod collagen IV, den del af basalmembranen. Den farvning blev senere opdaget med streptavidin-647 (rød), og derefter konstant filmede i 300 sekunder enten normal Ringers buffer (øverste panel), eller ascorbat-Ringers (nederste panel). Bemærk, at 300 sekunder konstant billedbehandling tid svarer til 10 timers imaging når billederne indsamlet til 500 msek hver minut (de sædvanlige imaging-indstillingerne). Den lyseste 25% af pixel intensitetsværdier er grønne farve. (B) Kvantificering af immunofluorescens henfald (50% i Ringers versus 0% i ascorbat-Ringers). Værdier blev normaliseret til det indledende fluorescens. Billeder, der er indsamlet med immunfluorescens stereomikroskop. Målestokken i A, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Undersøgelse af samspillet mellem tumor metastatiske celler og tumor stroma er afgørende for at forstå processen med tumorcellemigration og tumor immunitet. Dette skyldes, at tumorassocierede stroma komponerer op til 90% af tumormassen og aktivt regulerer tumorvækst og metastatisk spredning 21. Men mekanistisk indsigt i, hvordan matrix drev tumorcellemigration mod enten lymfe-eller blodkar mangler 22. Dette skyldes til dels det faktum, at intravital imældning af matrixproteiner er begrænset til visualisering af modnet fibre af fibrillære collagener hjælp anden harmonisk generation to-foton mikroskopi 23. Derfor har vi tilpasset vores metode til visualisering af vævet mikromiljø, herunder blod-og lymfe-fartøjer, pericytes, nerver, muskler og adipocytter at omfatte direkte visualisering af ekstracellulære matrix komponenter. Kan skelnes Mange strukturer, der bygger på deres morfologi efter immunfarvning til basalmembrankomponenter såsom collagen IV eller perlecan (fig. 2A), men direkte farvning for specifikke celleoverflademarkører, fx Lyve1 (fig. 2B og C) og podoplanin (Fig . 2C), tillader yderligere skelne indledende, kapillær lymfevejene (Lyve1 +) fra lymfe samlere (Lyve1 -). Farvning for matrix-bundne CCL21 i huden viste aflejringer af dette chemokin på basismembranen lymfatiske samlere identified med farvning for perlecan, at heparansulfat-proteoglycan (fig. 2D).
Figur 2. Eksempler på levende farvning i en normal mus ører. (A) Farvning for perlecan, en basalmembran komponent, skildrer alle blod og lymfe-fartøjer, nerver, muskelfibre og adipocytter. (B) Lyve1 farvning markerer den oprindelige lymfe kapillære netværk. (C) Co-farvning for Lyve1 og podoplanin, en pan-lymfatisk markør, skildrer netværk af indledende og indsamling lymfevejene. Den dorsale øre dermis kan filmede med klassiske epifluorescens mikroskopi (uden optisk sektionering), da øret dermis har lavt antal fedtceller, som ellers ville dække billedfeltet. (D) CCL21 stai ning (grøn) på lymfe basalmembran farvet for perlecan (rød). Billeder, der er indsamlet med immunfluorescens stereomikroskop. Skalapanelerne i A og B, 1 mm; i C, 100 mM og 50 mM i D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vigtigst er det, strukturelle proteiner, der normalt ikke kan påvises ved SHG, den klassiske matrix detektionsmetoden 23, kan visualiseres. For eksempel fandt vi, at tenascin C (fig. 3A), en matrix-protein, der udtrykkes i tumorigenese, er sårheling og inflammation 19 deponeret forskellige steder i tumorstroma end fibrillære collagener (fig. 3B). Denne matrix heterogenitet kan påvirke tumorceller distribution og metastaser (fig. 3C).
t "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 3.. Den dorsale øre dermis kan leve filmede med multi-foton mikroskopi. En enkelt område tumor B16-F10. Tumorstroma blev mærket med tenascin C-antistof og farvningen blev påvist med anti-ged-594 æsel antistof. Immunofluorescens af tenascin C (rød) netværk vises i A og fibrillære collagener påvist med anden harmonisk generation (SGH) i B. Disse to netværk overlejret med tumorceller (cyan) i C (fusionerede). Ny tumor matrix præget af tenascin C er ikke overlappende med fibrillar kollagener opdages med SHG (grøn). Billedet med 44, fire gange i gennemsnit z-sektioner med z-trin 1,0 um blev købt i 16 bit farvedybde mode. Billeder, der er indsamlet med to-foton mikroskop. Scale bar, 100 pm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter immunolabeling forskellige tumor matrixkomponenterne (f.eks tenascin C og kollagen IV) af tumor matrix vi kunne identificeres begrænset og pludselige begivenheder tumor matrix retningsbestemt remodeling (Video 1). Kræfter, der udvikles inden tumormikromiljøet kan føre til ekspansion eller sammentrækning af tumor matrix og derfor remodellering og forlængelse af tumorvaskulatur i et lignende omfang som vi viste tidligere i tilfælde af heling af sår 11,24.
Video 1. Udvidelse af tumor matrix mærket med collagen IV (rød) og tenascin C (cyan) langstrakt blodkar (pil) og passivt translocate tre tumorceller (grøn). Lokaliseret sammentrækning af teascin C-rige tumor matrix translocate blodkar (rød vandret orienterede struktue) ved cirka 100 mM i løbet af 12 timer af billeddannelse. Billeder, der er indsamlet med immunfluorescens stereomikroskop. Klik her for at se video.
Ved hjælp af multi-foton mikroskopi med fluoroforen mærkning er problematisk, da fotonflux anvendt i disse eksperimenter hurtigt vil blege fluorescerende farvestoffer, der ikke er beskyttet mod oxidation 25. Her viser vi, at vi kan udføre to-foton time-lapse mikroskopi samtidig billeddannelse immunolabeled tenascin C matrix med minimal fotoblegning af fluorophores selv (Video 2) i høj foton tæthed to-foton mikroskopi.
Video 2. Lavt fotoblegning af tenascin C immunofluorescens (rød) i løbet af to-foton mikroskopi. B16-F10-GFP-tumorceller (cyan) blev afbildet i den åbne dorsale øre 9 dage efter inokulering. Den fluorescerende signal blev beskyttet ved anvendelse af ascorbat-Ringers puffer på afbildet væv. Anden harmonisk generation (grøn) ikke overlapper med ny matrix repræsenteret ved tenascin C. 16 bit farvedybde billede med 11, fire gange i gennemsnit z-sektioner med z-trin 1,9 um blev erhvervet i 15 min. Billeder blev indsamlet hver 1 minut 5 sekunder i 6 z-fly indsamlet. Klik her for at se video.
Vi filmede også immun-celle interaktioner med metastatiske tumorceller. CMTPX-mærkede splenocytter fra en tumor-bærende mus ekstravaseret fra tumorassocierede blodkar 8 timer efter iv transfusion, invaderede tumor matrix og aktivt interageret med tumorceller ved at danne langvarige celle-kontakter (Video 2). Fluorophor-647-mærkede kollagen IV strukturer var resistente over for fotoblegning løbet af de 12 timer af billeddannelse.
Video 3. Samspil mellem CMTPX-mærkede splenocytter fra tumor (B16-F10)-bearing mus med individuelle tumorceller (GFP-B16-F10). Splenocyter var iv transfunderet efter vævsfarvning for kollagen IV. Collagen IV-grøn (647), splenocytter-rød (CMTPX), B16-F10 cyan (GFP). Billeder, der er indsamlet med immunfluorescens stereomikroskop. Videovarighed 12 timer. Klik her for at se video.
Frisk isolerede tumorceller blev overlejret på den udsatte øre dermis pre-farvet for collagen IV. Vi kunne observeret, at efter at overholde vævet nogle grupper af celler begyndte kollektiv migration langs basalmembranen af blodkar og adipocytter.
Video 4. Tumorceller vandrer langs kælderen membraner. Normal øre hud farvet for kollagen IV (647, red) blev overlejret med frisk passeret B16-F10-GFP-celler og filmede i 5 timer. Nogle tumorceller, der overholdt væv startede kollektive migration sammenkælder membran af blodkar og adipocytter. Billeder, der er indsamlet med immunfluorescens stereomikroskop. Video varighed:. 5 timer Klik her for at se video.
Også, fordi øret dermis er næsten to-dimensionelle, kunne vi let indsamle store mængder af data ved hjælp af hurtig fluorescens stereomikroskopi, i stedet for langsommere og dyrere konfokal eller multiphoton mikroskopi. Men det er også muligt at bruge nogen af de nævnte scanning mikroskopi-metoder med vores intravital IF præparater (fig. 3, Video 1).
Discussion
Betydning
Her præsenterer vi en ny intravital mikroskopi tilgang, der tillader høj opløsning og dynamisk visualisering af forskellige væv microenvironment komponenter, herunder fibrillar samt mesh-lignende matrix proteiner. Denne fremgangsmåde har flere fordele i forhold til de nuværende intravital billeddannende teknikker: (i) Intravital fluorescensimagografi har været anvendt i mikrocirkulationen undersøgelser, fx for at spore opløste lækage af blod eller i lymfekar, men er ikke blevet kombineret med immunfarvning. (Ii) anvendelse af genetisk modificerede reporter mus giver mulighed for specifikke celletyper, der skal afbildes, men kræver deres tilgængelighed (eller en væsentlig indsats for at skabe nye) og begrænser antallet af interagerende celletyper, der kan studeres. (Iii) Ekstracellulær matrix kan afbildes in vivo ved hjælp af anden harmoniske generation, men denne teknik kan kun afsløre fibrøse collagener, hvilket efterlader et stort antal vigtige ekstracellulære komponentersåsom kælderen membraner, fibronectiner, tenasciner, vækstfaktorer, kemokiner og væv glycosaminoglycans uden for rækkevidde for aktuel forskning. Vores metode overvinder disse begrænsninger, og giver standard billeddannende teknikker skal indarbejdes, og yderligere kombineres med immunostainings for andre celletyper, vævsstrukturer, aflejringer af heparinsulfat bindende vækstfaktorer (f.eks VEGF 26) og chemokiner (CCL21 5,18 og fig. 2D ), eller ekstracellulære matrixproteiner samtidig sporing blod og / eller lymfe-flow.
Begrænsninger
Den epifluorescence billeddannelse af intravital IF er begrænset til de tynde hudlapper, berøvet tykke underhuden (fedtvæv). Mens vi fundet, at de dorsale øre dermis er optimal for relativt harmløse kirurgisk fremstilling af øret huden epifluorescens med intravital IF teknik ikke er begrænset til øre dermis og kan potentielt anvendes til fxblottet hud af tæer eller rygskindet af nyfødte mus. Rapid antistoffarvning (15 minutter) i immunofluorescens IF er ikke afhængig af passiv diffusion, men kræver funktionel lymfedrænage og fluidstrømning interstitiel dermed kan observeres nogen farvning hvis lymfekar okkluderes 27. I tråd med det, lymfekar pletten stærkere så utæt blod vasculature (tilskadekomne skibe, arterioler) 5. Adskillelsen af den dorsale og ventrale øre hudlapper er en mild kirurgisk procedure, men det forårsager skade på visse kapillærer og celledød til forskellige vævsceller. Dette kan være et problem, når man skal undersøge helt intakt væv, fx ser på den milde af lægemidlers virkning på celleoverlevelse. Også anvendelsen af antioxidant, der tjener til at beskytte huden mod fototoksicitet og fotoblegning udelukker brugen af intravital immunfluorescens teknik til at undersøge fx vævet oxidativt stress eller nitrogenoxid biologisty.
Endelig kan aktivere disse celler og indflydelse fx undersøgelse af respons væv immune og dendritisk celleaktivering blinding af væv residente makrofager med immunkomplekser.
Ændringer og fejlfinding
For at studere væv oxidativt stress eller nitrogenoxid biologi, ascorbat skal udskiftes med andre væv kompatible medier, der ikke interfererer med den eksperimentelle output. Tilsvarende bør blokerer Fc receptorer på dermal immunceller undgås, hvis målet med undersøgelsen er den funktion og aktivering af reaktion vævet immun og dendritiske celle aktivering og migration. Dette kan gøres ved anvendelse af sekundært antistof med Fc-fragmentet spaltet (F (ab) 2-antistoffragmenter), eller anvendelsen af biotinyleret antistof og fluorescerende streptavidin som detekteringsreagenser.
Fremtidige anvendelser
Vi præsenterer et nyt og unikt intraafgørende, hvis teknik til billed-ikke-fibrillære komponenter af ekstracellulær matrix i transplanterbare hudtumorer i kombination med SHG-opdaget fibrillar og modnet collagener hjælp af to-foton mikroskopi. En af fordelene ved at anvende multi-foton (eller konfokal) mikroskopi løbet epifluorescens billeddannelse er z-stabling mulighed og følgelig rumlig co-lokalisering af begivenheder inden ekstracellulære matrix, fx tumor intravasation i lymfe eller blodkar, som i tilfælde af standard epifluorescens mikroskopi kun kan udledes morfologiske ændringer af den invaderende celle. Denne teknik har langt bredere potentiale. For eksempel har vi brugt intravital IF til at undersøge den mekanisme af lymfatisk okklusion af lymfe-specifikke fotodynamisk terapi 27. Yderligere mulige anvendelser af denne metode omfatter, men er ikke begrænset til undersøgelse af hudens immunitet under inflammation, mekanisme afstødning eller metoder til blod og lymfe ATIC fartøj vækst i løbet tumorigenesis.
Kritiske trin i proceduren
Det vigtigste skridt, der har afgørende konsekvenser for at opretholde et fysiologisk væv miljø er en kirurgisk adskillelse af den ventrale hud og brusk fra ryg dermis. Skæring eller tilstoppe den store pulsåre eller vene vil føre til overdreven blødning og lokal vævshypoxi, hvilket vil påvirke cellulære respons på behandlinger og cellebevægelse 8. Immobilisere øret med kirurgisk lim bør ske med forsigtighed, da spilde limen på eksponere væv vil medføre en permanent skade på vævet ved tillukning af blodkar. Temperaturen af musen skal kontrolleres og holdes ved 37 ° C. Derudover befugtet oxygen skal anvendes til isofluran anæstesi, således at øjne og lunger blive ordentligt befugtet under eksperimentet. Desuden skal natriumascorbat fremstilles frisk, og dens pH kontrolleres før brug.
ntent "> Sammenfattende denne intravital immunfluorescens bro real-time, lokale målinger af fysiologiske funktion med molekylær billeddannelse af komplekse cellulære begivenheder i mus huden. Desuden er denne metode har et stort potentiale, da det let kan anvendes til fx studie post-udviklingsmæssige mekanismer for blod og lymfe-angiogenese eller at visualisere de tidlige faser af hudinfektion af forskellige patogener. Med sin fleksibilitet og high-throughput potentiale, kan denne intravital teknik bidrage væsentligt til flere områder af biologi.Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Jeremy CM Teo og S. Ryan Oliver for deres bidrag og Jolanta Kilarska om hjælp til billedbehandling. Vi takker BIOP core facilitet på EPFL for støtte med to-foton mikroskopi
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd Kommissionen (DC-lymfe, 206.653-2), den europæiske referenceramme for Projekt 7 (AngioScaff), den schweiziske National Science Foundation (31-135.756), og det amerikanske National Institutes of Health (NIH) / NIH Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). Derudover midler fra Robert Wenner Award (schweizisk Cancer League) tilladt købet Leica stereomikroskopet anvendt i denne undersøgelse. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice Strain | |||
| BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
| C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
| Cell Line | |||
| B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
| Anesthesia Maintenance | |||
| Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
| Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
| DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
| Stereomicroscope | |||
| Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 1X lens (linear system magnification from 7.5X to 160X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 2X lens (linear system magnification from 15.6X to 320X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| Multiphoton Microscopy | |||
| LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| HCX APO 20X/1.2 oil immersion | |||
| Chameleon Ultra Laser | |||
| Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
| Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
| Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
| Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
| Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
| Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
| Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
| LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
| CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
| Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
| CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
| Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
| Cell Culture Reagents | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
| Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
| PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |
References
- Martinez-Corral, I., et al. In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis. Proc Natl Acad Sci. , (2012).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels. Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis. PLoS ONE. 8, (2013).
- Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).
- Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).
- Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. 1-14 (2005).
- Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nat Med. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. 15, 657-664 (2009).
- Sahai, E., et al. Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy. BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).
- Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).
- Pinner, S., Sahai, E. Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo. J. Microsc. 231, 441-445 (2008).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions. Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).
- Giampieri, S., et al. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
- Weber, M., et al. Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients. Science. 339, 328-332 (2013).
- Midwood, K. S., Orend, G. The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis. Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. 340-341 (2006).
- Sund, M., Kalluri, R. Tumor stroma derived biomarkers in cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies. Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).
- Patterson, G. H., Piston, D. W. Photobleaching in two-photon excitation microscopy. Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).
- Jakobsson, L., et al. Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis. Dev Cell. 10, 625-634 (2006).
- Kilarski, W. W., et al. Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis. Angiogenesis. , (2013).
