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Bioengineering

Epifluorescence साथ ऊतक मैट्रिक्स घटकों और दो photon माइक्रोस्कोपी के लंबे समय तक intravital Immunofluorescence इमेजिंग

Published: April 22, 2014 doi: 10.3791/51388
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1
1Institute of Bioengineering and Swiss Institute of Experimental Cancer Research (ISREC), École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2Department of Cell and Developmental Biology and Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University
* These authors contributed equally

Summary

बाह्य मैट्रिक्स घाव भरने, सूजन और tumorigenesis दौरान पर्याप्त remodeling आए. हम तंतुमय की गतिशीलता के साथ ही epifluorescence या दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ जाल की तरह मैट्रिक्स घटकों कल्पना करने के लिए एक उपन्यास intravital immunofluorescence माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

ऊतक आकारिकी बनाए रखने के लिए एक शारीरिक पाड़ होने के अलावा, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सक्रिय रूप से विकास और अंग homeostasis के दौरान सेल और ऊतक समारोह को विनियमित करने में शामिल है. यह bioactive ईसीएम प्रोटीन टुकड़े की रिहाई के माध्यम से इस तरह के रूप में, जैव रासायनिक biomechanical, और biophysical संकेत दे रास्ते के माध्यम से अभिनय ऊतक तनाव को विनियमित करने, और सेल प्रवास के लिए रास्ते प्रदान करके ऐसा करता है. ट्यूमर microenvironment के बाह्य मैट्रिक्स गिरावट, बयान और तंतुमय और गैर तंतुमय मैट्रिक्स प्रोटीन की संगठन द्वारा विशेषता पर्याप्त remodeling, आए. ट्यूमर microenvironment की stromal stiffening ट्यूमर के विकास और आक्रमण को बढ़ावा देने, और रक्त और लसीका वाहिकाओं के पुनर्गठन पैदा कर सकता है. मैट्रिक्स प्रोटीन की लाइव इमेजिंग, हालांकि, इस बात के लिए मैट्रिक्स घटकों के बहुमत एल छोड़ने, बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी से पता लगाया जा सकता है कि तंतुमय कोलेजन तक सीमित हैargely अदृश्य. यहाँ हम बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और epifluorescence और दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग रहते चूहों में उजागर ऊतक की intravital इमेजिंग के immunolabeling, पतली पृष्ठीय कान त्वचा में ट्यूमर टीका के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. हमारे intravital इमेजिंग विधि एक से बढ़ त्वचीय ट्यूमर के संदर्भ में तंतुमय और गैर तंतुमय मैट्रिक्स प्रोटीन दोनों की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है. हम स्थानीय मैट्रिक्स संकुचन के कारण पोत remodeling के उदाहरण दिखाते हैं. हम भी दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के साथ पाया ट्यूमर का तंतुमय मैट्रिक्स हम भी ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ टी सेल बातचीत की लंबी अवधि (12 घंटे) इमेजिंग से पता चला है ऐसे tenascin सी के रूप में नव जमा मैट्रिक्स घटकों से स्थानिक अलग है कि पाया तहखाने झिल्ली के कोलेजन चतुर्थ साथ माइग्रेशन. साथ में ले ली, इस विधि अनोखे prov सकता है जो ट्यूमर कोशिकाओं के साथ पता लगाने, उनकी शारीरिक microenvironment और समय के साथ अंतर्जात ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के लिए अनुमति देता हैट्यूमर प्रगति और अंतिम सफलता या उपचार के लिए प्रतिरोध अंतर्निहित तंत्र में आईडीई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि.

Introduction

भड़काऊ, metastatic और मैट्रिक्स remodeling प्रक्रियाओं के intravital इमेजिंग अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र रहा है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन 1,2 व्यक्त कि कई ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल के निर्माण के लिए प्रेरित किया है. कारण छवि गुणवत्ता को कम करने और सीमा के ऊतकों के माध्यम से प्रवेश जो प्रकाश बाहर का ध्यान केंद्रित फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए, इमेजिंग मोटी ऊतक केवल confocal या बहु फोटॉन स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 3 के साथ संभव है. तेजी का उपयोग करना, कम खर्चीला और जटिल epifluorescence माइक्रोस्कोपी केवल ऐसे चिकन Chorio-अपरापोषिकीय झिल्ली 4 या माउस कान डर्मिस 5 के रूप में लगभग दो आयामी ऊतकों के साथ संभव है. अधिकांश इमेजिंग सिस्टम एक सेल प्रकार विशिष्ट फैशन में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का लाभ ले. इन प्रोटीनों कमजोर phototoxicity की पेशकश हालांकि, वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6 प्रेरित. इसके अलावा, यह विशेष सेल उपप्रकार के बीच स्विच या चिह्नित करने के लिए मुश्किल हैइस तरह के परिवर्तन के रूप में आईआर बेसल या सक्रिय राज्यों एक नया आनुवंशिक मॉडल की तैयारी की आवश्यकता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति आम तौर पर intracellular कम्पार्टमेंट के लिए प्रतिबंधित है ही इसके अलावा, यह आमतौर पर तहखाने झिल्ली प्रोटीन या ऊतक केमोकाइन जमा 7 की तरह छवि बाह्य संरचनाओं के लिए संभव नहीं है. इसके बजाय, कोशिकी एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ अप्रत्यक्ष लेबलिंग वास्तव में किसी भी कोशिका प्रकार या मैट्रिक्स विशिष्ट घटक 8,9 के लिए लचीलापन प्रदान करता है. हालांकि, इस लेबलिंग दृष्टिकोण का बड़ा नुकसान पूरक व्यवस्था पर निर्भर सेल विषाक्तता और कोशिकाओं और बाह्य संरचनाओं 10 के phagocytosis ट्रिगर कर सकते हैं कि प्रतिजन प्रतिरक्षी प्रतिरक्षा परिसरों द्वारा मध्यस्थता immunotoxicity साथ जुड़ा हुआ है.

सूजन या घाव भरने के दौरान बाह्य ट्यूमर microenvironment की मैट्रिक्स, लेकिन यह भी सामान्य ऊतकों की पर्याप्त remodeling आए. ट्यूमर microenvironment की stromal stiffening प्रोमो सकते हैंकारण तनाव प्रेरित संकेतन तंत्र और रक्त और लसीका वाहिकाओं 11 के कारण remodeling के लिए ते ट्यूमर के विकास और आक्रमण. हालांकि, मैट्रिक्स प्रोटीन की लाइव इमेजिंग बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी से पता लगाया जा सकता है कि तंतुमय कोलेजन तक सीमित है. हाल ही में हम imaged कोशिकाओं और ऊतकों संरचनाओं से 5 फोटो और प्रतिरक्षा विषैले नुकसान के जोखिम को कम करता है कि एक उपन्यास intravital इमेजिंग विधि को प्रकाशित किया है. निरंतर intravital दृश्य का एक दौर 2 घंटे 12-17 के लिए 30 मिनट की एक सीमा में है, जहां स्थापित इमेजिंग तकनीक के साथ तुलना में, हमारे intravital immunofluorescence (यदि) तकनीक 12 घंटे (लंबी अवधि 8) इमेजिंग की अनुमति दी. यह इमेजिंग समय हमारे पशु प्रोटोकॉल में परिभाषित सीमाओं की वजह से 12 घंटे तक ही सीमित है, लेकिन यह लंबे समय तक नहीं किया जा सकता कि कोई तकनीकी जवाबी संकेत मिले हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है अगर रक्तचाप और दिल की तरह जानवर के महत्वपूर्ण स्वास्थ्य मानकों,दर 8 नियंत्रित कर रहे हैं. इसके अलावा, एक स्वचालित प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग कर हम एक ही प्रयोग के दौरान कई क्षेत्रों से छवियों को इकट्ठा करने में सक्षम थे और कार्यात्मक रक्त और लसीका वाहिकाओं द्वारा समर्थित त्वचा के शारीरिक संदर्भ में हुई दुर्लभ प्रतिरक्षाविज्ञानी और remodeling प्रक्रियाओं मनाया. Stereomicroscopic लेंस एक अपेक्षाकृत बड़े, 2 सेमी, दूरी काम किया है और दो photon सूक्ष्म प्रकाशिकी के विपरीत पानी विसर्जन vaporizing की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि लंबे समय तक इमेजिंग केवल प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत प्रदर्शन किया गया था. Intravital यदि सामान्य त्वचा के किसी भी बाह्य मैट्रिक्स घटक की प्रतिरक्षा लेबलिंग और पता लगाने की अनुमति दी. इस तकनीक से डिजाइन हानिकारक immunotoxic प्रभाव 5 कारण के बिना जीवित कोशिकाओं और शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर माउस डर्मिस पर ऊतक मैट्रिक्स तत्वों के लिए immunostaining का उपयोग करने का अभिनव अवधारणा पर आधारित है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया ही डर्मिस के लिए सुरक्षित हैयह केवल स्वतंत्र रूप से स्वायत्त खून से तंग आ गया और अलग लसीका परिसंचरण द्वारा सूखा, innervated हैं कि कान में दो त्वचा की परतों की जुदाई पर निर्भर करता है के रूप में vasculature. हमारे प्रयोगात्मक स्थापना की अनुमति देता है रक्त और लसीका वाहिकाओं और घाव भरने प्रक्रियाओं के बीच ल्युकोसैट तस्करी सहित कम से कम 12 घंटे, अधिक महत्वपूर्ण patho शारीरिक घटनाओं की एक श्रृंखला के इमेजिंग. मूल प्रकाशन में, हम intravital इमेजिंग के विभिन्न क्षेत्रों में राज्य के अत्याधुनिक मानकों को हमारी तकनीक की तुलना में. नतीजतन, हम प्रारंभिक लसीका वाहिकाओं 15 इकट्ठा करने के बजाय उम्मीद में प्रवेश प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनूठा दृश्य सहित leukocytes के विभिन्न प्रकार, द्वारा रक्त वाहिका परिस्त्राव और लसीका intravasation घटनाओं मनाया. इसके अलावा, अन्य समूहों 9,18 द्वारा किया टिप्पणियों के पूरक, हम विवो CCL21 में एकत्रित पर लेकिन कदा ही प्रारंभिक lymphatics पर मजबूत, टूटनेवाला जमा के रूप में सक्षम है कि पाया.

19 से बड़े पैमाने पर बेरोज़गार हैं कि इस तरह के tenascin सी के रूप में मैट्रिक्स अणुओं, जो भी शामिल है गतिशील ट्यूमर microenvironment, के संदर्भ में इमेजिंग कैंसर सेल आक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम ट्यूमर का तंतुमय मैट्रिक्स, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के साथ पकड़ा, इसके अलावा, हम स्थानीय मैट्रिक्स संकुचन के कारण पोत remodeling के उदाहरण का वर्णन लंबी tenascin सी. से बना नव जमा मैट्रिक्स से ट्यूमर microenvironment के विभिन्न स्थानों पर रह रहे हैं पाया कि ट्यूमर कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली के कोलेजन चतुर्थ साथ ट्यूमर सेल प्रवास के साथ टी सेल बातचीत की अवधि (12 घंटे) इमेजिंग. एक साथ इस तरह के रक्त वाहिनियों पे के रूप में स्थानीय शारीरिक मापदंड, जबकि रिकॉर्डिंग इस तरह की घटनाओं imaged किया जा सकता हैrmeability और लसीका जल निकासी.

Protocol

जानवरों पर प्रदर्शन सभी प्रक्रियाओं स्विस पशु संरक्षण अधिनियम, पशु संरक्षण पर अध्यादेश और पशु प्रयोग पर अध्यादेश के साथ सख्त अनुसार थे. , विशेष रूप से इस अध्ययन को मंजूरी दे दी है: हम कमीशन डे निगरानी डी ल Etat डी Vaud (2687 परमिट नंबर) नाम हमारे संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), की पुष्टि करें.

कान की 1. ट्यूमर टीका

  1. DMEM + 10% FBS मीडिया का उपयोग कर एक 10 सेमी पेट्री डिश में संस्कृति B16-F10-GFP मेलेनोमा कोशिकाओं.
  2. कोशिकाओं 80-90% मिला हुआ हैं, तो पीबीएस के साथ उन्हें धोने और trypsinization द्वारा उन्हें अलग. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1500 XG पर कोशिकाओं स्पिन 1 मिलीलीटर घंटी समाधान में गोली resuspend और एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में स्थानांतरण. फिर स्पिन और सिर्फ गोली से ऊपर रहता है कि मध्यम की एक पतली परत को छोड़कर सभी पर तैरनेवाला हटा दें. एक मोटी सेल घोल के साथ समाप्त करने के लिए कोशिकाओं Resuspend.
  3. बाजार का एक मिश्रण के साथ माउस anesthetizeamine / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg) और पशु पर्याप्त एक सज्जन पैर के अंगूठे चुटकी प्रदर्शन से anesthetized है कि इस बात की पुष्टि. मामले आंदोलनों में 0.1% की सीढ़ियों में isoflurane एकाग्रता में वृद्धि (पंजा का उदाहरण वापसी) मनाया जाता है. पूरी प्रक्रिया के दौरान एक गुदा thermistor नियंत्रित हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें और एक उचित नेत्र मरहम के साथ अपनी आंखों की रक्षा.
  4. एक हैमिल्टन सिरिंज (33 जी सुई, 10 मिलीलीटर सिरिंज मात्रा) तैयार करें. सुई के साथ टिप टोपी निकालें और टिप चैम्बर के शीर्ष पर सेल घोल का 20 μl लोड. 5 एमएल घोल सिरिंज के अंदर भरी हुई है जब तक सवार वापस खींच. टिप कक्ष से अतिरिक्त घोल निकालें और टिप टोपी बंद करें.
  5. चिपकने वाला टेप का उपयोग करना, एक सूचकांक उंगली की नोक पर कान के समीपस्थ किनारे को ठीक. एक 45 डिग्री के कोण में, धीरे धीरे पृष्ठीय डर्मिस और उपास्थि के बीच हैमिल्टन सिरिंज सुई डालें. एक बार अंदर, के बारे में 2-3 मिमी के लिए बाहर करने के लिए कान समीपस्थ घुसना.
  6. 3 μl सेल घोल इंजेक्षन और धीरे से कान से सुई वापस लेना.ट्यूमर कोशिकाओं को 7-9 दिनों के दौरान एक ठोस ट्यूमर के रूप में और एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग कर ट्यूमर के विकास का पालन करते हैं.
  7. वैकल्पिक रूप से, ऊतक मैट्रिक्स के साथ ट्यूमर सेल बातचीत के प्रारंभिक चरणों का पालन करने के लिए, (3.3 कदम के बाद) संपर्क में है और दाग कान डर्मिस पर घंटी समाधान में निलंबित 100,000 ट्यूमर कोशिकाओं के 50 μl लागू होते हैं.

2. कान सर्जरी

  1. तीन दिन पहले प्रयोग, माउस सिर दाढ़ी सिर और कान (10-15 सेकंड) के आसपास बाल बाल हटाना और पानी से कुल्ला.
  2. Humidified ऑक्सीजन और isoflurane (3-4% प्रेरण, 1-2% रखरखाव) के मिश्रण के साथ माउस anesthetize और जानवर पर्याप्त एक सज्जन पैर के अंगूठे चुटकी प्रदर्शन से anesthetized है कि इस बात की पुष्टि. मामले आंदोलनों में 0.1% की सीढ़ियों में isoflurane एकाग्रता में वृद्धि (पंजा का उदाहरण वापसी) मनाया जाता है. पूरी प्रक्रिया के दौरान एक गुदा thermistor नियंत्रित हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें और एक साथ अपनी आंखों की रक्षाउचित नेत्र मरहम.
  3. 8 चिपके कांच ऊतक विज्ञान स्लाइड से बाहर कर दिया एक मंच का निर्माण. अपनी पीठ पर माउस मुड़ें और धीरे गिलास स्लाइड के ढेर पर ट्यूमर असर कान जगह है. ढेर करने के लिए कान की पूर्वकाल और कूल्हों किनारों fixate के लिए चिपकने वाला टेप के छोटे धारियों का प्रयोग करें.
  4. एक छुरी का उपयोग माउस पंख की antihelix साथ कान के उदर त्वचा में कटौती. घुमावदार चिमटी की मदद से, धीरे वेंट्रल डर्मिस और ट्यूमर inoculated किया गया था जहां पृष्ठीय डर्मिस से उपास्थि दूर छील. पृष्ठीय डर्मिस उजागर, घुमावदार संदंश के साथ उदर त्वचा और उपास्थि बंद खींचो. नोट: कान की प्रमुख वाहिकाओं में कटौती कर रहे हैं या रक्त परिसंचरण 15 मिनट के भीतर सामान्य प्रवाह के लिए वापस नहीं करता है, कान इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. हमेशा घंटी बफर का उपयोग करके गीला खोला कान त्वचा रखने के लिए और एक coverslip का उपयोग करके नमी की रक्षा करना.
  5. मामले में लगातार खून बह रहा फार्म ट्यूमर वाहिकाओं 100 μl जोड़कर रक्तस्राव को रोकने, वहाँ हैथ्रोम्बिन 5 मिनट के लिए कान के शीर्ष पर घंटी बफर (102 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 28 मिमी सोडियम लैक्टेट) में (5 यू / एमएल).
  6. घंटी बफर के लगभग 5 एमएल के साथ दो बार कान धो लें और बाँझ पोंछे के साथ अतिरिक्त तरल हटा दें. तुरंत (किसी भी बिंदु पर खुला कान सूखा नहीं है!) अगले चरण पर जाएँ.

3. Immunofluorescence धुंधला

इस्तेमाल की घंटी बफर मानव सीरम (1:10), मानव आईजीजी के लिए माउस पॉलीक्लोनल माध्यमिक एंटीबॉडी (1:50), और 125 आइयू / एमएल (2.5 मिलीग्राम / एमएल) सभी धुंधला कदम के लिए aprotinin (अवरुद्ध बफर) के साथ पूरक. Aprotinin सर्जरी के बाद हो सकता है कि प्रारंभिक रक्तस्राव को सीमित करने के plasmin को बढ़ावा देने जमावट को रोकता है.

  1. शक्ति उत्सेध में खुला डर्मिस साथ कान का हिस्सा मोड़ो और बाँझ पोंछे के साथ बाहरी बंद कान डर्मिस सूखी. पूर्वकाल और कूल्हों Dorsa के लिए शल्य चिकित्सा गोंद के 0.5 μl लगाने से गिलास स्लाइड के ढेर पर कान स्थिरएल किनारों. फिर, धीरे कांच पर पृष्ठीय कान डर्मिस समतल.
  2. उजागर कान को अवरुद्ध बफर 100 μl की कुल मात्रा में से 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में बाह्य मैट्रिक्स अणुओं को लक्षित प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें. कान किनारों पर सुखाने के लिए धुंधला समाधान को रोकने के क्रम में एक कवर पर्ची के साथ कान को कवर किया. 15 मिनट के लिए सेते हैं. घंटी बफर के लगभग 5 एमएल के साथ दो बार कान धो लें.
  3. उजागर कान को अवरुद्ध बफर 100 μl की कुल मात्रा में से 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी या streptavidin conjugates (जैसे 594 एनएम या 647 एनएम के रूप में एक उच्च उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ fluorophores intravital इमेजिंग के लिए अनुकूल हैं) लागू करें. एक कवर पर्ची के साथ कान को कवर और 15 मिनट के लिए सेते हैं. घंटी बफर के लगभग 5 एमएल के साथ दो बार कान धो लें.

बगल में ट्यूमर कोशिकाओं के साथ रक्त जनित सक्रिय Splenocytes के 4. इंटरेक्शन

  1. 7 दिनों inoculatio के बादn congenic माउस के पीछे त्वचा पर GFP-B16-F10 मेलेनोमा की, पशु euthanize और spleens इकट्ठा. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से तिल्ली के यांत्रिक विघटन के साथ splenocytes अलग.
  2. लाल CMTPX सेल cytoplasm दाग (पीबीएस में 1 माइक्रोन) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए लेबल splenocytes, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर में 4 बार धो लें और तुरंत जिसका कान थे माउस की पूंछ नस में 200 μl सीरम मुक्त माध्यम से इंजेक्षन 7 दिन पहले B16-F10-GFP के साथ inoculated.

एक stereomicroscope का उपयोग करके 5. Intravital इमेजिंग

  1. अल्पकालिक इमेजिंग (अप करने के लिए 2 घंटे) के लिए, 7.5 (एस्कॉर्बेट-घंटी बफर फाइनल के एक पीएच में 140 मिमी सोडियम एस्कॉर्बेट, 10 मिमी HEPES, 4 मिमी KCl और 5 मिमी 2 CaCl, जिसमें हौसले से तैयार बाँझ एस्कॉर्बेट-घंटी बफर जोड़ immobilized कान के शीर्ष पर परासारिता 320 mOsm). एक coverslip के साथ कान को कवर किया और 2x लेंस के साथ एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग करके इमेजिंग शुरू करते हैं.
  2. लंबे समय तक इमेजिंग के लिए(अधिक से अधिक 2 घंटा), के बारे में 0.5 सेमी दूर कान से, coverslip के तहत (एस्कॉर्बेट-घंटी बफर युक्त एक जलाशय से जुड़े) एक सुई के आउटलेट जगह है. लगातार coverslip के तहत चैम्बर के लिए एस्कॉर्बेट-घंटी बफर देने के लिए 1 μl / मिनट की गति से एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का प्रयोग करें.
  3. 1X लेंस 2X लेंस के लिए (कार्य दूरी 6 सेमी) (कार्य दूरी 2 सेमी) बदलें. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और फ्लोरोसेंट stereomicroscope की सेटिंग को विन्यस्त. कैमरे में सेटिंग्स छवि रंग गहराई के रूप में 12 बिट का चयन और 5.1% (अधिकतम) 0% (न्यूनतम) से ग्रे पैमाने पर मूल्यों का कैमरा रेंज को समायोजित करने और गामा सुधार 2 के लिए सेट.
    1. सेट अधिग्रहण 1 (न्यूनतम), 1000 के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता (अधिकतम), बढ़ाई 280X-320X के लिए सेट और (जोखिम समय कम से कम 1 सेकंड) होना चाहिए या अधिक के तहत जोखिम से बचने के जोखिम समय समायोजित करने के लिए लाभ. इमेजिंग क्षेत्रों (20 करने के लिए आमतौर पर 10), अधिग्रहण चक्र के लिए समय अंतराल की संख्या के आधार पर किया जाना निर्धारित किया जाना चाहिए2 मिनट के लिए 1 tween. छोटा बार विरंजन और phototoxicity कारण हो सकता है.
  4. ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से (जैसे चित्रा 3 के रूप में) दाग ईसीएम प्रोटीन होते हैं कि कई क्षेत्रों चुनें. Motorized मंच का प्रयोग, समय (उदाहरण के लिए हर 2 मिनट) पर (जैसे GFP और चित्रा 3 में फ्लोरोफोरे 647) के रूप में उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों प्राप्त चित्रों.
  5. प्रयोग के बाद, संस्थागत पशु दिशा निर्देशों के अनुसार माउस euthanize. इस मामले में, प्रयोग के अंत में, Exsanguination (intracardiac छिड़काव) के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से anesthetized माउस euthanize.

एक Multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 6. Intravital इमेजिंग

  1. सिलिकॉन तेल का प्रयोग, कान के आधार पर शुरू करने के बारे में 2 सेमी व्यास और कान के आसपास 2-3 मिमी ऊंचाई का एक परिपत्र दीवार का निर्माण. सुनिश्चित करें कि कोई लीक अंक हैं बनाओ. एस्कॉर्बेट-घंटी बफर के साथ सर्कल भरें.
  2. जगह माउसमंच पर और हीटिंग पैड से कनेक्ट (37 डिग्री सेल्सियस).
  3. ओपन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और multiphoton माइक्रोस्कोप की सेटिंग को विन्यस्त.
  4. ट्यूमर कोशिकाओं और (चित्रा 3 के रूप में) दाग ईसीएम प्रोटीन होते हैं कि चार अलग अलग क्षेत्रों को चुनें. इस उदाहरण, धुन में GFP के लिए 850 एनएम तिवारी Saphire लेजर फ्लोरोफोरे 647 धुंधला के लिए बाद में एक फोटान 647 संकेत और स्वसहायता समूहों के साथ तंतुमय कोलेजन कल्पना. 1.00 एनए लेंस और 2 मिमी दूरी काम के साथ पानी विसर्जन HCX एपीओ 20X के साथ (जैसे GFP और चित्रा 3 में फ्लोरोफोरे 647) के रूप में उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों की छवियों और समय के साथ दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी, जैसे हर 2 मिनट, मोल.
  5. प्रयोग के बाद, Exsanguination (intracardiac छिड़काव) के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ anesthetized माउस euthanize.

Representative Results

तिथि करने के लिए, जी ऊतक में immunostaining के कारण आम तौर पर उच्च धुंधला पृष्ठभूमि और immunotoxicity 20 के प्रमुख के लिए प्रतिरक्षा परिसरों के गठन के लिए उपयोग नहीं किया है. यह इस प्रकार आनेवाले परोक्ष मजबूत immunostaining के लिए इन कोशिकाओं "चकाचौंध", ऊतक मैक्रोफेज पर Fcγ रिसेप्टर्स पूर्व अवरुद्ध से दूर था. लेबलिंग कोशिकी था, phototoxicity और फ्लोरोफोरे विरंजन प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट बफर, isosmotic एस्कॉर्बिक एसिड (छवि 1 ए) में ऊतक के विसर्जन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. Photobleaching अब हिचकते हैं लेकिन पूरी तरह से (छवि 1 बी) को रोका जा सकता है न केवल इतना है कि इस विधि 5 के बारे में हमारी प्रारंभिक वर्णन से, हम अपने विरोधी विरंजन और विरोधी phototoxic तकनीक में सुधार. यह कान स्थिर है जहां कक्ष के भीतर एंटीऑक्सीडेंट (100 μl) की एक बड़ी मात्रा में कान embedding द्वारा किया जाता है. तस्वीरें हैं जब 300 सेकंड लगातार इमेजिंग समय इमेजिंग के 10 घंटे से मेल खाती है कि नोट500 मिसे हर एक मिनट (औसत इमेजिंग सेटिंग) के लिए एकत्र की.

चित्रा 1
चित्रा 1. Photobleaching और phototoxicity घंटी बफर में एस्कॉर्बेट साथ क्लोराइड की जगह और उस समाधान के 100 μl मात्रा में उजागर कान embedding द्वारा बंद कर दिया गया था. (ए) ऊतक कोलेजन चतुर्थ, तहखाने झिल्ली के घटक के खिलाफ एक biotinylated एंटीबॉडी के साथ पहले सना हुआ था. धुंधला बाद streptavidin-647 (लाल) के साथ पकड़ा, और फिर लगातार सामान्य घंटी बफर (ऊपरी पैनल) या एस्कॉर्बेट-घंटी (कम पैनल) में या तो 300 सेकंड के लिए उतारी थी. तस्वीरों 500 मिसे हर एक मिनट (सामान्य इमेजिंग सेटिंग) के लिए एकत्र कर रहे हैं जब 300 सेकंड लगातार इमेजिंग समय इमेजिंग के 10 घंटे से मेल खाती है ध्यान दें. गड़बड़ी के प्रतिभाशाली 25%Xel तीव्रता मूल्यों हरे रंग का है. Immunofluorescence क्षय (बी) मात्रा (घंटी बनाम में 50% एस्कॉर्बेट-घंटी में 0%). मान प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत थे. Immunofluorescence stereomicroscope साथ एकत्र छवियाँ. एक में स्केल बार, 100 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ट्यूमर metastatic कोशिकाओं और ट्यूमर स्ट्रोमा के बीच बातचीत की जांच कर ट्यूमर सेल प्रवास और ट्यूमर प्रतिरक्षा की प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. ट्यूमर जुड़े स्ट्रोमा ट्यूमर मास की 90% तक composes और सक्रिय रूप से ट्यूमर के विकास और metastatic प्रसार 21 को नियंत्रित करता है, क्योंकि यह है. हालांकि, लसीका या रक्त वाहिकाओं या तो दिशा में मैट्रिक्स ड्राइव ट्यूमर सेल प्रवास 22 की कमी है कैसे में यंत्रवत अंतर्दृष्टि. इस तथ्य के कारण आंशिक रूप से है कि intravital Imमैट्रिक्स प्रोटीन की उम्र बढ़ने के दो photon माइक्रोस्कोपी 23 में दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी का उपयोग तंतुमय कोलेजन की परिपक्व फाइबर के दृश्य तक सीमित है. इसलिए, हम बाह्य मैट्रिक्स घटकों के प्रत्यक्ष दृश्य शामिल करने के लिए रक्त और लसीका वाहिकाओं, pericytes, नसों, मांसपेशियों और adipocytes सहित ऊतक microenvironment के दृश्य के लिए हमारे विधि रूपांतरित किया. कई इमारतों में इस तरह कोलेजन चतुर्थ या perlecan (2A छवि), तथापि, विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों के लिए प्रत्यक्ष धुंधला हो जाना, जैसे Lyve1 (छवि 2 बी और सी) और podoplanin रूप तहखाने झिल्ली घटकों के लिए immunostaining के बाद उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्र .) - 2 सी), आगे प्रारंभिक, केशिका lymphatics लसीका कलेक्टरों से (Lyve1 +) (Lyve1 भेद देता है. त्वचा में मैट्रिक्स बाध्य CCL21 लिए धुंधला हो जाना लसीका संग्रहकर्ता आईडीई के तहखाने झिल्ली पर इस केमोकाइन की जमा राशि का पता चलाperlecan के लिए धुंधला हो जाना, हेपारन सल्फेट proteoglycan (छवि 2 डी) के साथ ntified.

चित्रा 2
एक सामान्य माउस कान में रहते धुंधला की 2. उदाहरण चित्रा. (ए) perlecan के लिए धुंधला हो जाना, एक तहखाने झिल्ली घटक, सभी रक्त और लसीका वाहिकाओं, नसों, मांसपेशियों फाइबर और adipocytes दर्शाया गया है. (बी) Lyve1 धुंधला प्रारंभिक लसीका केशिका नेटवर्क के निशान. Lyve1 और podoplanin, अखिल लसीका मार्कर, (ग) सह धुंधला प्रारंभिक और एकत्रित lymphatics के नेटवर्क को दर्शाया गया है. पृष्ठीय कान डर्मिस कान डर्मिस के रूप में (ऑप्टिकल सेक्शनिंग के बिना) क्लासिक epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया जा सकता है अन्यथा इमेजिंग क्षेत्र को कवर किया जाएगा कि adipocytes की कम संख्या है. (डी) CCL21 stai perlecan (लाल) के लिए दाग लसीका तहखाने झिल्ली पर निंग (हरा). Immunofluorescence stereomicroscope साथ एकत्र छवियाँ. ए और बी में स्केल सलाखों, 1 मिमी; सी में, 100 मीटर और डी में 50 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

सबसे महत्वपूर्ण बात है, सामान्य रूप से स्वयं सहायता समूह, क्लासिक मैट्रिक्स पहचान पद्धति 23 से नहीं पाया जा सकता है कि संरचनात्मक प्रोटीन, देखे जा सकते हैं. उदाहरण के लिए, हम कि tenascin सी (छवि 3 ए), tumorigenesis दौरान व्यक्त की है कि एक मैट्रिक्स प्रोटीन पाया, घाव भरने और सूजन 19 तंतुमय कोलेजन (छवि 3 बी) से ट्यूमर स्ट्रोमा के विभिन्न स्थानों में जमा है. इस मैट्रिक्स विविधता ट्यूमर कोशिका वितरण और मेटास्टेसिस (छवि -3 सी) को प्रभावित कर सकता है.

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चित्रा 3. पृष्ठीय कान डर्मिस लाइव बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया जा सकता है. ट्यूमर B16-F10 के एक ही क्षेत्र. ट्यूमर stroma tenascin सी एंटीबॉडी के साथ चिह्नित किया गया और धुंधला विरोधी बकरी-594 गधा एंटीबॉडी के साथ पाया गया. Tenascin सी (लाल) के immunofluorescence नेटवर्क में दिखाया गया है और तंतुमय कोलेजन बी में दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (SGH) के साथ पाया जाता है. इन दोनों नेटवर्क (विलय) सी में ट्यूमर कोशिकाओं (सियान) के साथ आरोपित कर रहे हैं. Tenascin सी द्वारा चिह्नित नया ट्यूमर मैट्रिक्स एसएचजी (हरा) के साथ पाया तंतुमय कोलेजन के साथ अतिव्यापी नहीं है. 44, चार बार z कदम 1.0 माइक्रोन से Z-वर्गों के औसत के साथ छवि 16 बिट रंग गहराई मोड में अधिग्रहण कर लिया था. दो photon माइक्रोस्कोप के साथ एकत्र छवियाँ. स्केल बार, 100 माइक्रोन.रेफरी = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

विभिन्न ट्यूमर मैट्रिक्स घटक ट्यूमर मैट्रिक्स (जैसे tenascin सी और कोलेजन चतुर्थ) की immunolabeling के बाद हम कर सकते थे पहचान प्रतिबंधित और ट्यूमर मैट्रिक्स दिशात्मक remodeling के अचानक घटनाओं (वीडियो) 1. हम घाव 11,24 चिकित्सा के मामले में पहले से पता चला है के रूप में ट्यूमर microenvironment भीतर विकसित बलों है कि ट्यूमर मैट्रिक्स और परिणाम remodeling और एक समान हद तक ट्यूमर वाहिका के बढ़ाव में के विस्तार या संकुचन पैदा हो सकती है.

कोलेजन चतुर्थ (लाल) और tenascin सी (सियान) रक्त वाहिकाओं (तीर) बढ़ाना और निष्क्रिय तीन ट्यूमर कोशिकाओं (हरा) सरकाना के साथ लेबल ट्यूमर मैट्रिक्स के वीडियो 1. विस्तार. Teascin सी युक्त ट्यूमर मैट्रिक्स सरकाना रक्त वाहिका (लाल क्षैतिज उन्मुख स्ट्रक्चरल के स्थानीयकृत संकुचनई) इमेजिंग के 12 घंटे के दौरान लगभग 100 माइक्रोन से. Immunofluorescence stereomicroscope साथ एकत्र छवियाँ. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

इन प्रयोगों में इस्तेमाल फोटॉन प्रवाह जल्दी ऑक्सीकरण 25 से सुरक्षित नहीं हैं कि फ्लोरोसेंट रंगों ब्लीच के रूप में होगा fluorophore लेबलिंग के साथ बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग समस्याग्रस्त है. यहाँ हम एक साथ भी (वीडियो 2) उच्च फोटॉन घनत्व दो photon माइक्रोस्कोपी में fluorophores के न्यूनतम photobleaching के साथ immunolabeled tenascin सी मैट्रिक्स इमेजिंग जबकि हम दो photon समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन कर सकते हैं.

दो photon माइक्रोस्कोपी के दौरान tenascin सी immunofluorescence (लाल) की वीडियो 2. निम्न स्तर photobleaching. B16-F10-GFP ट्यूमर कोशिकाओं (सियान) 9 दिनों टीका के बाद खुला पृष्ठीय कान में imaged किया गया. फ्लोरोसेंट संकेत एस्कॉर्बेट के आवेदन द्वारा संरक्षित किया गयाImaged ऊतक पर घंटी बफर. दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (हरा) चार बार z कदम 1.9 माइक्रोन से Z-वर्गों का औसत 11, 15 मिनट के लिए अधिग्रहण कर लिया था साथ सी. 16 बिट रंग गहराई छवि tenascin द्वारा प्रतिनिधित्व नए मैट्रिक्स के साथ अतिव्यापी नहीं है. छवियाँ एकत्र 6 Z-विमानों में हर 1 मिनट 5 सेकंड एकत्र किए गए थे. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

हम भी metastatic ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षा सेल बातचीत imaged. 8 घंटे चतुर्थ आधान के बाद ट्यूमर जुड़े रक्त वाहिकाओं से extravasated एक ट्यूमर असर माउस से CMTPX लेबल splenocytes, ट्यूमर मैट्रिक्स आक्रमण किया और सक्रिय रूप से लंबे समय तक चलने वाले सेल संपर्क (वीडियो 2) के गठन से ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत की. Fluorophore-647-लेबल कोलेजन चतुर्थ संरचनाओं इमेजिंग के 12 घंटे के दौरान photobleaching लिए प्रतिरोधी रहे थे.

ट्यूमर से CMTPX लेबल splenocytes (B16-F10) बी के वीडियो 3. सहभागिताव्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं (GFP-B16-F10) के साथ माउस earing. Splenocytes कोलेजन चतुर्थ के लिए ऊतक धुंधला के बाद चढ़ाया चतुर्थ थे. कोलेजन चतुर्थ हरी (647), splenocytes लाल (CMTPX), B16-F10 सियान (GFP). Immunofluorescence stereomicroscope साथ एकत्र छवियाँ. वीडियो अवधि 12 घंटे. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

हौसले से अलग ट्यूमर कोशिकाओं को उजागर कान डर्मिस कोलेजन चतुर्थ के लिए पूर्व दाग पर मढ़ा गया. हम ऊतक का पालन करने के बाद कोशिकाओं के कुछ समूहों के रक्त वाहिकाओं और adipocytes के तहखाने झिल्ली के साथ सामूहिक प्रवास शुरू कर दिया है कि मनाया सकता है.

वीडियो 4. ट्यूमर कोशिकाओं तहखाने झिल्ली विस्थापित साथ. सामान्य कान त्वचा हौसले passaged B16-F10-GFP कोशिकाओं से मढ़ा और 5 घंटे के लिए उतारी थी (लाल 647,) कोलेजन चतुर्थ के लिए दाग. ऊतक का पालन किया है कि कुछ ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सामूहिक माइग्रेशन प्रारंभरक्त वाहिकाओं और adipocytes के तहखाने झिल्ली. Immunofluorescence stereomicroscope साथ एकत्र छवियाँ. वीडियो वीडियो. 5 घंटे वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कान डर्मिस लगभग दो आयामी है, क्योंकि हम आसानी बजाय धीमी और अधिक महंगा confocal या multiphoton माइक्रोस्कोपी, तेजी से प्रतिदीप्ति stereomicroscopy का उपयोग डेटा की बड़ी मात्रा में एकत्र कर सकते हैं. हालांकि, यह हमारे intravital के साथ उल्लेख किया माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग तरीकों में से किसी का उपयोग करने के लिए भी संभव है तैयारी (3 छवि, वीडियो 1).

Discussion

महत्व

यहाँ हम उच्च संकल्प और तंतुमय के साथ ही जाल की तरह मैट्रिक्स प्रोटीन सहित विभिन्न ऊतक microenvironment घटकों के गतिशील दृश्य की अनुमति देता है कि एक उपन्यास intravital माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. (मैं) intravital प्रतिदीप्ति इमेजिंग खून से या lymphatics में घुला हुआ पदार्थ के रिसाव पर नज़र रखने के लिए, जैसे, microcirculation अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन immunostaining के साथ संयुक्त नहीं किया गया है: यह विधि वर्तमान intravital इमेजिंग तकनीक पर कई फायदे हैं. (Ii) आनुवंशिक रूप से संशोधित संवाददाता चूहों का उपयोग imaged किया जा करने के लिए विशेष प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुमति देता है, लेकिन उनकी उपलब्धता (या नए लोगों को बनाने के लिए पर्याप्त प्रयास) की आवश्यकता है और अध्ययन किया जा सकता है कि सेल प्रकार बातचीत की संख्या की सीमा. (Iii) बाह्य मैट्रिक्स दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी का उपयोग vivo में imaged किया जा सकता है, लेकिन इस तकनीक ही महत्वपूर्ण बाह्य घटकों की एक बड़ी संख्या को छोड़ने, रेशेदार कोलेजन पता लगा सकते हैंतहखाने झिल्ली, fibronectins, tenascins, वृद्धि कारक है, chemokines और वर्तमान अनुसंधान के लिए पहुंच से बाहर ऊतक glycosaminoglycans के रूप में इस तरह के. हमारे विधि इन सीमाओं पर काबू, और मानक इमेजिंग तकनीक विकास कारकों (जैसे VEGF 26) और chemokines (CCL21 5,18 और अंजीर. 2 डी बाध्यकारी अन्य प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों संरचनाओं, हेपरिन सल्फेट की जमा राशि के लिए immunostainings के साथ शामिल है और आगे जोड़ा जा करने की अनुमति देता है ), या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन एक साथ रक्त और / या लसीका प्रवाह ट्रैकिंग करते हुए.

सीमाएं

intravital अगर epifluorescence इमेजिंग मोटी हाइपोडर्मिस (वसा ऊतकों) से वंचित पतली त्वचा फ्लैप, तक ही सीमित है. हम पृष्ठीय कान डर्मिस तकनीक कान डर्मिस तक ही सीमित नहीं है, तो intravital साथ कान त्वचा, epifluorescence की अपेक्षाकृत हानिरहित शल्य प्रदर्शनी के लिए इष्टतम है और संभवतः जैसे को लागू किया जा सकता है पाया जबकिपैर की उंगलियों या नवजात माउस के पीछे त्वचा के संपर्क में त्वचा. Immunofluorescence में रैपिड एंटीबॉडी धुंधला (15 मिनट) यदि निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर नहीं है लेकिन कार्यात्मक लसीका जल निकासी और मध्य द्रव प्रवाह की आवश्यकता है, लसीका वाहिकाओं 27 occluded रहे हैं इसलिए कोई धुंधला मनाया जा सकता है. उस के साथ लाइन में, लसीका वाहिकाओं मजबूत तो टपकाया रक्त वाहिका संरचना (घायल वाहिकाओं, arterioles) 5 दाग. पृष्ठीय और उदर कान त्वचा फ्लैप की जुदाई एक हल्के शल्य प्रक्रिया है लेकिन यह विभिन्न ऊतकों की कोशिकाओं के लिए कुछ केशिकाओं और कोशिका मृत्यु के लिए चोट के कारण. एक जैसे सेल अस्तित्व पर दवाओं के हल्के प्रभाव को देख, पूरी तरह से बरकरार ऊतक की जांच करने की जरूरत है जब यह एक समस्या हो सकती है. इसके अलावा phototoxicity और photobleaching से त्वचा की रक्षा करता है कि एंटीऑक्सीडेंट के आवेदन ऊतक oxidative तनाव या नाइट्रिक ऑक्साइड biolog जैसे अध्ययन करने के लिए intravital immunofluorescence तकनीक का उपयोग शामिल नहींवाई.

अंत में, प्रतिरक्षा परिसरों के साथ ऊतक निवासी मैक्रोफेज की चकाचौंध इन कोशिकाओं और ऊतकों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वृक्ष के समान सेल सक्रियण के अध्ययन जैसे प्रभाव को सक्रिय कर सकते हैं.

संशोधन और निवारण

ऊतक oxidative तनाव या नाइट्रिक ऑक्साइड जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, एस्कॉर्बेट प्रायोगिक उत्पादन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि अन्य ऊतकों संगत मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया गया है. अध्ययन के लक्ष्य समारोह और ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वृक्ष के समान सेल सक्रियण और प्रवास के सक्रियण है कि अगर इसी तरह, चमड़े का प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अवरुद्ध एफसी रिसेप्टर्स से बचा जाना चाहिए. यह (एफ (एबी) 2 एंटीबॉडी टुकड़े) या पता लगाने अभिकर्मकों के रूप में biotinylated एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट streptavidin का उपयोग cleaved एफसी टुकड़ा के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के साथ किया जा सकता है.

भविष्य अनुप्रयोगों

हम एक उपन्यास और अद्वितीय इंट्रा पेशमहत्वपूर्ण अगर दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर स्वयं सहायता समूह का पता चला तंतुमय और परिपक्व कोलेजन के साथ संयोजन में transplantable त्वचा ट्यूमर में बाह्य मैट्रिक्स की छवि गैर तंतुमय घटकों के लिए तकनीक. Epifluorescence इमेजिंग पर बहु - फोटान (या confocal) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के लाभ में से एक Z-stacking संभावना है और में परिणाम बाह्य मैट्रिक्स के भीतर होने वाली घटनाओं के सह स्थानीयकरण स्थानिक, लसीका या रक्त वाहिका, में जैसे ट्यूमर intravasation जो के मामले में मानक epifluorescence माइक्रोस्कोपी ही हमलावर सेल के morphological परिवर्तन से अनुमान लगाया जा सकता है. इस तकनीक को दूर व्यापक क्षमता है. लसीका विशेष photodynamic चिकित्सा 27 से लसीका रोड़ा की व्यवस्था की जांच करने के लिए उदाहरण के लिए यदि हम intravital का इस्तेमाल किया है. इस विधि के अतिरिक्त संभावित अनुप्रयोगों में शामिल हैं लेकिन प्रत्यारोपण अस्वीकृति या रक्त और लसीका के तरीकों की सूजन, तंत्र दौरान त्वचा उन्मुक्ति की जांच तक ही सीमित नहीं रहे tumorigenesis दौरान atic वाहिका विकास.

प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम

एक शारीरिक ऊतक वातावरण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि सबसे महत्वपूर्ण कदम पृष्ठीय डर्मिस से उदर त्वचा और उपास्थि की एक शल्य चिकित्सा जुदाई है. काटने या प्रमुख धमनी या शिरा occluding उपचार और सेल आंदोलन 8 को सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित करेगा, जो अत्यधिक रक्तस्राव और स्थानीय ऊतक हाइपोक्सिया को बढ़ावा मिलेगा. शल्य गोंद के साथ कान immobilizing ऊतक बेनकाब पर गोंद spilling के रूप में सावधानी से किया जाना चाहिए रक्त वाहिकाओं का रोड़ा द्वारा ऊतकों को एक स्थायी चोट के कारण होगा. माउस का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और नियंत्रित रखा जाना चाहिए आंखों और फेफड़े ठीक से प्रयोग के दौरान humidified रहना इतना है कि इसके अतिरिक्त, humidified ऑक्सीजन, isoflurane संज्ञाहरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, सोडियम एस्कॉर्बेट हौसले से तैयार रहना चाहिए और अपनी पीएच उपयोग करने से पहले जाँच की.

सारांश में ntent ">, इस intravital immunofluorescence माउस त्वचा में जटिल सेलुलर घटनाओं की आणविक इमेजिंग के साथ शारीरिक समारोह की वास्तविक समय, स्थानीय माप पुल. यह आसानी से के बाद विकास जैसे अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है इसके अलावा, इस पद्धति काफी संभावना है रक्त और लसीका-angiogenesis या अपने लचीलापन और उच्च throughput क्षमता के साथ. विभिन्न रोगजनक एजेंटों द्वारा त्वचा संक्रमण के प्रारंभिक चरणों कल्पना करने के तंत्र, इस intravital तकनीक काफी जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में योगदान कर सकते हैं.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों इमेज प्रोसेसिंग में मदद के लिए जेरेमी मुख्यमंत्री Teo और एस रयान ओलिवर उनके योगदान के लिए और जोलांटा Kilarska के लिए आभारी हैं. हम दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए EPFL में BIOP कोर सुविधा धन्यवाद

इस काम यूरोपीय अनुसंधान आयोग (डीसी लसीका, 206653-2), यूरोपीय फ्रेमवर्क प्रोजेक्ट 7 (AngioScaff), स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (31-135756), और अमेरिकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (एनआईएच) / एनआईएच हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI) (RO1 HL096539). इसके अतिरिक्त, रॉबर्ट Wenner पुरस्कार (स्विस कैंसर लीग) से धन खरीद इस अध्ययन में इस्तेमाल Leica stereomicroscope की अनुमति दी. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Strain
BALB/C mice (8-12 weeks ) Charles River Orleans,France
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) Harlan Carshalton UK
Cell Line 
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP 
Anesthesia Maintenance 
Isofluorane  Minrad Inc. 2222 Minrad Inc., Buffalo, NY
Humidified delivery system  Rothhacher GmBH Berne, Switzerland 
DC Temperature Control System  FHC Inc Bowdoin, MA
Stereomicroscope 
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH Wetzlar, Germany
1X lens (linear system magnification from 7.5X to 160X) Leica Microsystems CMS GmbH Wetzlar, Germany
2X lens (linear system magnification from 15.6X to 320X) Leica Microsystems CMS GmbH Wetzlar, Germany
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software  Leica Microsystems CMS GmbH Wetzlar, Germany
Multiphoton Microscopy 
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage  Leica Microsystems CMS GmbH Wetzlar, Germany
HCX APO 20X/1.2 oil immersion 
Chameleon Ultra Laser 
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) B. Braun Medical AG 445968 Sempach, Germany
Aprotinin  Elastin AP92 Owensville, MO
Thrombin  Sigma-Aldrich T7326-1KU Taufkirchen, Germany 
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich 11140-50G Taufkirchen, Germany 
Mouse Serum raised against human IgG  Abcam ab34834 Cambridge, UK
Collagen IV  Abcam AB6581 Cambridge, UK
Perlacan  RnD ab79465 Minneapolis, MN
Tenascin C  RnD AF3358 Minneapolis, MN
Podoplanin RnD AF3244 Minneapolis, MN
LYVE-1  Reliatech 103-PA50 Wolfenbüttel, Germany
CCL21 RnD AF457 Minneapolis, MN
Streptavidin Pacific Blue  Invitrogen S11222 Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 647  Invitrogen S21374 Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 488  Invitrogen S11223 Grand Island, NY
Donkey Anti Goat 594  Invitrogen A21113 Grand Island, NY
Donkey Anti Rabbit 594  Invitrogen A21207 Grand Island, NY
CMTPX CellTracker Lifetechnologies C34552 Carlsbad, California
Histocryl (surgical glue) Braun Aesculap 1050060 Tuttlingen, Germany
Cell Culture Reagents 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM Gibco Invitrogen E15-843 Grand Island, NY
Fetal bovine serum (FBS Gibco Invitrogen Grand Island, NY
Trypsin Gibco Invitrogen 25300062 Grand Island, NY
PBS  Gibco Invitrogen Grand Island, NY

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References

  1. Martinez-Corral, I., et al. In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis. Proc Natl Acad Sci. , (2012).
  2. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  3. Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
  4. Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels. Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).
  5. Kilarski, W. W., et al. Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis. PLoS ONE. 8, (2013).
  6. Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).
  7. Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).
  8. Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).
  9. Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).
  10. Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. 1-14 (2005).
  11. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nat Med. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. 15, 657-664 (2009).
  12. Sahai, E., et al. Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy. BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).
  13. Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).
  14. Pinner, S., Sahai, E. Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo. J. Microsc. 231, 441-445 (2008).
  15. Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
  16. Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions. Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).
  17. Giampieri, S., et al. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
  18. Weber, M., et al. Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients. Science. 339, 328-332 (2013).
  19. Midwood, K. S., Orend, G. The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis. Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).
  20. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. 340-341 (2006).
  21. Sund, M., Kalluri, R. Tumor stroma derived biomarkers in cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).
  22. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).
  23. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
  24. Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies. Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).
  25. Patterson, G. H., Piston, D. W. Photobleaching in two-photon excitation microscopy. Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).
  26. Jakobsson, L., et al. Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis. Dev Cell. 10, 625-634 (2006).
  27. Kilarski, W. W., et al. Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis. Angiogenesis. , (2013).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 86 intravital इमेजिंग epifluorescence दो photon इमेजिंग ट्यूमर मैट्रिक्स मैट्रिक्स remodeling
Epifluorescence साथ ऊतक मैट्रिक्स घटकों और दो photon माइक्रोस्कोपी के लंबे समय तक intravital Immunofluorescence इमेजिंग
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Güç, E., Fankhauser, M., Lund, A. W., Swartz, M. A., Kilarski, W. W. Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51388, doi:10.3791/51388 (2014).

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