Summary
Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.
Abstract
Doku morfolojisi muhafaza edilmesi için bir fiziksel bir iskele olmanın yanı sıra, hücre dışı matris (ECM) gelişim ve organ aktif homeostazı sırasında, hücre ve doku fonksiyonlarının düzenlenmesinde yer almaktadır. Bu biyolojik olarak aktif ECM protein fragmanlarının salınmasıyla gibi, biyomekanik biyokimyasal ve biyofiziksel sinyal yollarının, aracılığıyla etki doku gerilimi düzenlemek ve hücre göçü için yollar sağlayarak yapar. Tümör mikro-hücre dışı matris bozulması, birikimi ve fibriler ve fibriler olmayan matris proteinlerinin düzenlenmesi ile karakterize edilen önemli yeniden, maruz kalır. Tümör mikro stromal sertleşmesi tümör büyümesini ve istilasını teşvik, kan ve lenfatik damarların yeniden neden olabilir. Matris proteinlerinin canlı görüntüleme, ancak bu noktaya matris bileşenlerinin çoğunluğu l bırakarak, çoklu foton mikroskopi kullanılarak ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilebilir fibril kolajenlerin sınırlıdırargely görünmez. Burada hücre dışı matris proteinleri ve Epifloresans ve iki foton mikroskopi kullanılarak canlı farelerde maruz doku intravital görüntüleme immün, ince dorsal deri, kulak tümör aşılama için işlemleri tarif eder. Bizim intravital görüntüleme yöntemi büyüyen tümör dermal bağlamında fibriler ve fibriler olmayan matris proteinlerinin her ikisinin de doğrudan saptanması için izin verir. Biz yerel matris kasılması neden gemi yeniden örneklerini göstermektedir. Ayrıca, ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilen tümör fibriler matris Ayrıca tümör hücreleri ve tümör hücreleri ile T-hücre etkileşiminin uzun süreli (12 saat) gibi görüntüleme gösterdi tenaskin C gibi yeni yatırılan matris bileşenleri uzamsal olarak ayrı olduğu bulunmuştur bazal membran kolajen IV boyunca göç. Birlikte ele alındığında, bu yöntem, benzersiz ata olabilir tümör hücrelerinin eş zamanlı saptanması, fiziksel mikro-ve zaman içinde endojen doku immün tepkisi için, izin verirtümör ilerlemesi ve nihai başarı veya tedaviye direnç altında yatan mekanizmalar içine ide önemli anlayışlar.
Introduction
Inflamatuar, metastatik ve matriks yeniden süreçlerin Intravital görüntüleme araştırma önemli bir alan olmuştur ve floresan proteinleri 1,2 ifade sayıda transgenik muhabiri fare modellerinin oluşturulması motive etti. Nedeniyle görüntü kalitesini düşürür ve sınırları doku yoluyla nüfuz ışık out-of-focus floresan sinyallerine, görüntüleme kalın doku sadece konfokal veya çoklu foton tarama mikroskobu 3 ile mümkündür. Daha hızlı kullanarak, daha az pahalı ve karmaşık bir epifluorışıma mikroskopi sadece bu tavuk Chorio-allantoik zar 4 ya da 5 fare kulak dermiş olarak yaklaşık iki boyutlu bir doku ile mümkündür. Çoğu görüntüleme sistemleri, hücre tipine özgü bir şekilde çeşitli floresan proteinleri ifade eden transjenik farelerin yararlanmak. Bu proteinler zayıf fototoksisite sunmak olsa da, onlar immün yanıtı 6 neden. Ayrıca, belirli bir hücre alt tipleri arasında geçiş ya da işaretlemek için zordurBöyle bir değişiklik gibi ir bazal veya aktif devletlerin yeni bir genetik modelin hazırlık gerektirir. Floresan protein ifadesi genel olarak hücre içi bölüm ile sınırlandırılmıştır Buna ek olarak, genellikle bazal membran proteinleri ya da doku kemokin mevduat 7 gibi görüntü dışı yapılara mümkün değildir. Bunun yerine, hücre dışı antijenlere karşı antikor ile dolaylı etiketleme hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da belirli matris bileşeninin 8,9 için esneklik sağlar. Bununla birlikte, bu etiketleme yaklaşımın en önemli dezavantajı, kompleman sistemi bağımlı hücre toksisitesi ve hücreler ve hücre dışı yapıların 10 fagositozunun tetikleyebilir antijen-antikor bağışıklık kompleksleri tarafından bağdaştırılan İmmünotoksisite ile ilişkilidir.
Inflamasyon ya da yara iyileşmesi sırasında, hücre dışı, tümör mikro matris, aynı zamanda, normal doku, önemli yeniden şekil alır. Tümör mikro-Stromal sertleştirici promo olabilirnedeniyle stres kaynaklı sinyal mekanizmaları ve kan ve lenf damarlarının 11 nedeni biçimlenme te tümör büyümesi ve işgali. Bununla birlikte, matris proteinlerinin canlı görüntüleme çoklu foton mikroskopi kullanılarak ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilebilir fibril kolajenlerin sınırlıdır. Son zamanlarda biz görüntülenmiş hücre ve doku yapılarına 5 fotoğraf ve immün-toksik hasar riskini en aza indiren yeni bir Intravital görüntüleme yöntemi yayınladı. Sürekli intravital görselleştirme bir yuvarlak, 2 saat 30 dakika 12-17 aralığı içinde kurulmuş görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, bizim intravital immünofloresan (IF) tekniği 12 saat (uzun süreli 8) görüntüleme izin verdi. Bu görüntüleme zamanı bizim hayvan protokolde belirlenen limitler nedeniyle 12 saat ile sınırlı ancak bu uzun süreli olamaz hiçbir teknik karşı göstergeler var olduğunu not etmek önemlidir eğer tansiyon ve kalp gibi hayvanın kritik sağlık parametreleri,hızı 8 kontrol edilir. Buna ek olarak, otomatik bir floresan stereomikroskop kullanılarak bir tek bir deney sırasında birden fazla alanlardan görüntü toplamak mümkün ve fonksiyonel kan ve lenf damarları tarafından desteklenen cildin fizyolojik bağlamında meydana gelen nadir immünolojik ve re görülmektedir. Stereomicroscopic lens bir göreceli olarak büyük, 2 cm, çalışma mesafesi vardır ve iki foton mikroskobik optik aksine, su altında buharlaşabilen gerektirmez, çünkü uzun süreli sadece görüntüleme flöresanlı bir stereomikroskop altında gerçekleştirildi. Intravital IF, normal derinin herhangi bir hücre dışı matris bileşeninin bağışıklık etiketleme ve tespit izin verdi. Bu tekniğin tasarımı zararlı etkilere immunotoksik 5 neden olmadan, canlı hücreleri ve cerrahi maruz kalan fare dermis doku matris elemanları için immun boyama kullanarak yenilikçi kavramına dayanmaktadır. Cerrahi prosedür kendisi dermis güvenlisadece bağımsız özerk kan ile beslenen ve ayrı lenfatik dolaşım tarafından drene, innerve kulakta iki cilt katmanlarının ayrılması dayanır gibi damarsal. Bizim deneysel kurulum sağlar, kan ve lenf damarları ve yara iyileşme süreçlerinin arasında lökosit kaçakçılığı olmak üzere en az 12 saat, aşırı önemli pato-fizyolojik olayların bir dizi görüntüleme. Orijinal yayında, biz intravital görüntüleme çeşitli alanlarında state-of-the-art standartlarına bizim teknik karşılaştırdık. Sonuç olarak, ilk lenf damarları 15 toplama yerine beklenen girerek bağışıklık hücrelerinin eşsiz görselleştirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli lökositlerin, kan ve lenf damarı ekstravazasyonu intravazasyon etkinlik gözlenmiştir. Ayrıca, diğer gruplar 9,18 tarafından yapılan gözlemler tamamlayan, biz vivo CCL21 toplayarak değil, sadece seyrek ilk lenfatiklerde güçlü, süreksiz mevduat oluşturmak mümkün olduğunu bulundu.
19 ile büyük ölçüde keşfedilmemiş olan bu tür tenaskin C matris moleküllerini içeren dinamik tümör mikro-, bağlamında görüntüleme, kanser hücresi yayılımını için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tümör fibriler matris, ikinci harmonik oluşumu ile tespit Ayrıca, yerel matris kasılması neden damar yeniden örneklerini tarif uzun tenaskin C. oluşan yeni biriken matris göre tümör mikro farklı yerleri işgal bulundu tümör hücreleri ve bazal membran kolajen IV boyunca tümör hücre göçü ile T-hücre etkileşimleri dönem (12 saat) görüntüleme. Aynı anda kan damarı pe gibi yerel fizyolojik parametreleri kayıt sırasında bu tür olaylar görüntülenebilirrmeability ve lenfatik drenaj.
Protocol
Hayvanlar üzerinde gerçekleştirilen tüm işlemler İsviçre Hayvanları Koruma Kanunu, hayvan koruma kararname ve hayvan deneyleri üzerine kararname ile tam uyum içinde idi. , Özellikle bu çalışmayı onayladı: Biz Komisyon de Surveillance de l'Etat de Vaud (2687 İzin Numarası) adlı bizim Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), onaylayın.
Kulak 1.. Tümör Aşılama
- DMEM +% 10 FBS ortamı kullanılarak 10 cm Petri kabındaki kültür B16-F10-GFP melanoma hücreleri.
- Hücreler% 80-90 konfluent olduğunda, PBS ile yıkayın ve tripsinizasyon onları ayırmak. , 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 x g'de hücreleri aşağı Spin 1 ml Ringer çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve pelet, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine aktarın. Tekrar Spin ve sadece pelet yukarıda kalır orta ince bir katman dışında tüm süpernatant kaldırmak. Kalın bir hücre bulamaç ile sonuna kadar hücreleri tekrar süspansiyon.
- Ket karışımı ile fare anestezisiamin / dorbene [medetomidin] (75mg/kg-1mg/kg) ve hayvan yeterince nazik bir ayak tutam yaparak anestezi onaylayın. Durumda hareketlerinde% 0.1 adımlarla izofluran konsantrasyonu artırmak (örneğin pençe çekme) gözlenir. Bütün işlem sırasında bir rektal termistör kontrollü bir ısıtma pedi (37 ° C) üzerinde fare tutmak ve uygun bir oftalmik merhem ile gözlerinizi korumak.
- Hamilton şırınga (33 G iğne, 10 ml şırınga hacmi) hazırlayın. Iğne ile uç kapağını çıkarın ve ucu odasının üstüne hücre bulamaç 20 ul yükleyin. 5 ml bulamaç şırınga içinde yüklenene kadar pistonu geri çekin. Uç odasından fazla bulamacı çıkarın ve uç kapağı kapatın.
- Yapışkan bant kullanılarak, bir parmağı ucunda kulak yakın kenar düzeltmek. 45 ° açı, yavaş yavaş dorsal dermis ve kıkırdak arasındaki Hamilton şırınga iğnesi takın. Bir kez içinde, yaklaşık 2-3 mm distale kulak proksimal nüfuz.
- 3 ul hücre bulamacı enjekte edilir ve yavaş yavaş kulaktan iğneyi geri çekin.Tümör hücreleri 7-9 gün boyunca, bir katı tümör formu ve flöresanlı bir stereomikroskop kullanılarak tümör büyümesini takip edelim.
- Alternatif olarak, doku matrisi ile tümör hücresi etkileşim erken adımları (adım 3.3 sonra) maruz kalan ve lekeli kulak dermis Ringer çözeltisi içinde süspansiyon haline 100,000 tümör hücreleri 50 ul uygulanır.
2.. Kulak Cerrahisi
- Üç gün önce deney, fare kafasını tıraş baş ve kulak (10-15 sn) çevresindeki tüyleri tüylerini ve su ile durulayın.
- Nemlendirilmiş oksijen ve izofluran (% 3-4 indüksiyon,% 1-2 bakım) bir karışımı ile fare anestezisi ve hayvan yeterince nazik bir ayak tutam yaparak anestezi onaylayın. Durumda hareketlerinde% 0.1 adımlarla izofluran konsantrasyonu artırmak (örneğin pençe çekme) gözlenir. Bütün işlem sırasında bir rektal termistör kontrollü bir ısıtma pedi (37 ° C) üzerinde fare tutmak ve bir ile gözlerinizi korumakUygun oftalmik merhem.
- 8 yapıştırılmış cam histoloji slaytlar yapılmış bir platform oluşturmak. Sırtında fare açın ve yavaşça cam slaytların yığını üzerinde tümör taşıyan kulak yerleştirin. Yığına kulağın ön ve arka kenarları yapıştırmak için yapışkan bant küçük çizgili kullanın.
- Bir neşter kullanılarak fare kulak kepçesi antiheliksin boyunca kulak ventral deri kesilir. Kavisli cımbız yardımı ile, yavaşça ventral dermis ve tümör aşılanmıştır dorsal dermis kıkırdak soyulabilir. Dorsal dermis açığa kavisli bir forseps ile ventral deri ve kıkırdak çekin. Not: kulağın büyük damar kesilir ya da kan dolaşımı 15 dakika içinde normal akışa döndürmez takdirde, kulak görüntüleme için kullanılamaz. Hep Ringer tampon kullanarak ıslak açılan kulak cildi korumak ve bir lamel kullanılarak nem korumak.
- Durumda kalıcı kanama formu tümör damarları 100 ul ekleyerek kanamayı durdurmak, vartrombin 5 dakika boyunca kulak üstüne Ringer tampon maddesi (102 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 28 mM sodyum laktat) (5 U / ml).
- Ringer tamponu, yaklaşık 5 ml ile iki kez yıkanır ve kulak steril mendil ile ilave sıvı boşaltılır. Derhal (herhangi bir noktada açık kulak kuru izin vermeyin!) Bir sonraki adıma geçin.
3.. İmmünofloresan Boyama
Kullanım Ringer tampon maddesi, insan serumu (01:10), insan IgG fare poliklonal ikincil antikor (1:50) ve 125 IU / ml (2.5 mg / ml), tüm boyama adımları için aprotinin (blokaj tamponu) ile takviye edilmiştir. Aprotinin ameliyat sonrası meydana ilk kanama sınırlamak plasmin teşvik pıhtılaşmayı engeller.
- Eminentia conchae içine açık dermis ile kulak kısmını katlayın ve steril mendil ile dış açılmamış kulak dermis kurulayın. Anterior ve posterior dorsal cerrahi yapıştırıcı 0.5 ul uygulayarak cam slayt yığını üzerinde kulak hareketsizl kenarlar. Sonra, yavaşça camın üzerine dorsal kulak dermis dümdüz.
- Maruz kulağa bloke edici tampon 100 ul toplam hacim içinde 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda, hücre dışı matris molekülleri hedef birincil antikor uygulayın. Kulak kenarları üzerinde kurumaya boyama çözeltisi önlemek için bir kayar kapak ile kulak örtün. 15 dakika boyunca inkübe edin. Ringer tamponu, yaklaşık 5 ml ile iki kez kulak yıkayın.
- Maruz kulağa bloke edici tampon 100 ul toplam hacim içinde 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda uygun bir ikincil antikor ya da streptavidin eşleniklerini (örneğin 594 nm veya 647 nm bir dalga boyuna sahip, yüksek uyarım fluorophores intravital görüntüleme için uygun olan) uygulanır. Bir kapak kayma ile kulak örtün ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Ringer tamponu, yaklaşık 5 ml ile iki kez kulak yıkayın.
In situ olarak tümör hücreleri ile kan yoluyla bulaşan Aktif splenosit 4. Etkileşim
- 7 gün sonra, inoculation konjenik fare arka cilt üzerinde GFP-B16-F10 melanom, hayvan euthanize ve dalak toplamak. 70 mikron hücre süzgecinden dalak mekanik aksaklık splenositlerin izole.
- Red CMTPX hücre sitoplazmaları leke (PBS içinde 1 uM) ile 37 ° C'de 8 dakika boyunca Etiket splenositler, 4 ° C'de, 15 ml 4 kez yıkayın ve hemen kulakları olan fare kuyruk venine 200 ul serum içermeyen ortam ile enjekte 7 gün önce, B16-F10-GFP ile aşılandı.
Stereomikroskopta 5. Intravital Görüntüleme
- Kısa süreli görüntüleme (kadar 2 saat) için, 7.5 (askorbat-Ringer tampon final bir pH'ta 140 mM sodyum askorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCI, 5 mM CaCl2 ihtiva eden taze hazırlanmış steril askorbat-Ringer tampon eklemek hareketsizleştirilmiş kulak üstünde ozmolaritesi 320 mOsM'den). Bir lamel ile kulak örtün ve 2X lens ile bir floresan stereomikroskopta kullanarak görüntüleme başlayabilirsiniz.
- Uzun vadeli görüntüleme için(En fazla 2 saat), yaklaşık 0.5 cm uzaklıkta kulaktan, lamel altında (askorbat-Ringer tampon ihtiva eden bir rezervuara birleştirilmiş) bir iğnenin çıkış yerleştirin. Sürekli lamel altında odacığına askorbat-Ringer tampon sunmak için 1 ul / dk 'lık bir hızda bir peristaltik pompa kullanın.
- 1X lens 2X lens (çalışma mesafe 6 cm) (çalışma mesafesi 2 cm) değiştirin. Toplama yazılımı açın ve floresan stereomikroskopta ayarlarını yapılandırın. Kamera ayarları, görüntü renk derinliği olarak 12 bit seçin ve% 5.1 (maksimum)% 0 (minimum) gri-skala değerleri kamera aralığını ayarlamak ve gama düzeltmesi 2'ye ayarlanır.
- Set edinimi 1 (asgari), 1.000 floresan yoğunluğu (maksimum), büyütme 280X-320X ayarlanır ve (pozlama süresi az 1 saniye olmalıdır) üzerinde veya altında kalmaktan kaçınarak pozlama süresini ayarlamak için kazanç. Görüntüleme alanlarına (20 genellikle 10), alıcı çevrimi için zaman aralığının sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır2 dakika için 1 arasını. Kısaltmak katı ağartma ve fototoksisite neden olabilir.
- Tümör hücrelerinin yanı sıra, (örneğin, Şekil 3 'de olduğu gibi) lekeli ECM proteinlerini içeren çeşitli alanları seçin. Motorlu sahne kullanılarak, bir süre (örneğin, her 2 dakika) ile (örneğin, GFP ve Şekil 3'te florofor 647 gibi), uygun flüoresan kanalları görüntü kazanır.
- Deneyden sonra, kurumsal hayvan kurallarına göre fare euthanize. Bu durumda, deney sonunda, bunlar, kanları tümüyle (intrakardiyak perfüzyon) takip servikal dislokasyon ile anestezi uygulanmış fare euthanize.
Bir multiphoton Mikroskop kullanarak 6. Intravital Görüntüleme
- Silikon yağı kullanarak, kulak tabanında başlayan, yaklaşık 2 cm çapında ve kulak yaklaşık 2-3 mm yüksekliğinde bir dairesel duvar inşa. Emin hiçbir sızıntı noktaları vardır olun. Askorbat-Ringer tamponu ile daire doldurun.
- Yeri faresahnede ve ısıtma yastık bağlayın (37 ° C).
- Açık toplama yazılım ve multiphoton mikroskop ayarlarını yapılandırın.
- Tümör hücreleri ve (örneğin Şekil 3 gibi) lekeli ECM proteinleri içeren dört farklı alanlara kadar seçin. Bu örnekte, uyum içinde GFP için 850 nm Ti-Safir lazer flüorofor 647 boyama için bir sonraki tek bir foton 647 sinyal ve SHG ile fibriler kollagenleri görselleştirmek. 1.00 NA lens ve 2 mm çalışma mesafesi suya daldırma HCX APO 20X ile (örneğin, GFP ve Şekil 3'te florofor 647 gibi), uygun flüoresan kanalları görüntü ve zaman içinde, ikinci harmonik üretiminin, örneğin her 2 dakikada, elde edin.
- Deneyden sonra, kansızlaştırma (intrakardiyak perfüzyon) izledi servikal dislokasyon ile anestezi fare euthanize.
Representative Results
Bugüne kadar, canlı dokuda immüno-boyama tipik olarak yüksek bir arka plan ve İmmünotoksisite 20 yol açan immün komplekslerin oluşumu için kullanılmaz. Bu nedenle daha sonraki dolaylı güçlü immünoboyamayla bu hücreleri "kör", doku makrofajlar üzerinde Fcy reseptörleri öncesi bloke ederek üstesinden oldu. Etiketleme dışı olduğu gibi, fototoksisite ve fluorofor ağartıcı, doğal bir antioksidan, tamponlu, isosmotic askorbik asit (Şekil 1) 'de doku içine daldırma ile kontrol edilebilir. Photobleaching şimdi inhibe ama tamamen (Şekil 1B) önlenebilir değil, böylece bu yöntemin 5 bizim ilk tanımlanmasından bu yana, biz anti-beyazlatma ve anti-fototoksik tekniği geliştirdi. Bu, kulak hareketsizleştirildiği oda içindeki antioksidan (100 ul) büyük bir hacimde kulak gömerek yapılır. Resim zaman 300 saniye sabit görüntüleme zamanı görüntüleme 10 saate karşılık unutmayın500 msn her dakika (ortalama görüntüleme ayarları) için toplandı.
Şekil 1. Photobleaching ve fototoksisite Ringer tampon maddesi içinde ascorbateyle klorür yerine ve solüsyon 100 ul hacim içinde maruz kulak gömme durdurulmuştur. (A) Doku kolajen IV, bazal membran bileşenine karşı bir biyotinlenmiş antikor ile ilk boyandı. Boyama daha sonra streptavidin-647 (kırmızı) ile tespit edilir ve daha sonra sürekli normal Ringer tampon maddesi (üst panel) veya askorbat-Ringer (alt panel) ya da 300 saniye boyunca görüntülenmiştir. Pictures 500 msn her dakika (her zamanki görüntüleme ayarları) için toplandığı zaman 300 saniye sabit görüntüleme zamanı görüntüleme 10 saate karşılık geldiğini unutmayın. Pi parlak 25%xel yoğunluk değerleri yeşil renklidir. Immünofloresan çürüme (B) miktarının (Ringer vs içinde% 50 askorbat-Ringer olarak% 0). Değerler başlangıç floresans normalleştirildi. Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. A Ölçeği bar, 100 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Tümör hücreleri ve metastatik tümör stroma arasındaki etkileşimi araştıran tümör hücre göçü ve tümör dokunulmazlık sürecini anlamak için çok önemlidir. Tümör-stroma ilişkili tümör kütlesinin% 90 kadar aktif oluşturan ve tümör büyümesi ve metastaz yayılması 21 düzenler olmasıdır. Ancak, lenfatik veya kan damarlarının ya doğru matris sürücüler tümör hücresi göçü 22 eksik nasıl içine mekanik anlayış. Bu durum, kısmen bağlı olduğu intravital immatris proteinlerinin yaşlanma iki foton mikroskopi 23 ikinci harmonik nesil kullanarak fibriler kolajenlerin olgunlaşmış liflerin görselleştirilmesi ile sınırlıdır. Bu nedenle, hücre dışı matriks bileşenlerinin doğrudan görselleştirme dahil kan ve lenf damarları, perisitlerden, sinirler, kas ve adipositlere dahil doku mikroçevresinin görselleştirme için bizim yöntemi uyarlanmış. Birçok yapıları, kolajen IV veya perlekan (Şekil 2A), ancak, belirli bir hücre yüzey belirteçleri için doğrudan boyanması, örneğin Lyve1 (Şekil 2B ve C) ve podoplanin gibi bazal membran bileşenleri için immün sonra morfolojiye göre ayırt edilebilir (Şekil .) - 2C), ayrıca ilk, kılcal lenfatiklerince lenfatik toplayıcıları (Lyve1 +) (Lyve1 ayırt sağlar. Deride matris bağlı CCL21 için boyama, lenfatik toplayıcıları ide bazal membran bu kemokinin depolanmalarıperlekan için boyama, heparan sülfat proteoglikan (Şekil 2D) ile ntified.
Normal bir fare kulakları canlı boyama 2. Örnekleri Şekil. (A) perlekan için boyandığında, bir bazal membran bileşeni, tüm kan ve lenf damarları, sinirleri, kas lifleri ve adipositleri gösteriyor. (B) Lyve1 boyama ilk lenfatik kılcal ağ işaretler. Lyve1 ve podoplanin, bir pan-lenfatik işaretleyici için (C) Co-boyama başlangıç ve toplama lenfatiklerden ağları gösteriyor. Dorsal kulak dermis kulak dermis olarak (optik kesit olmadan) klasik epifluorışıma mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir aksi görüntüleme alanını kapsayacak adipositlere düşük numarası vardır. (D) CCL21 stai perlekan (kırmızı) için boyanmış lenfatik bazal membran üzerine ning (yeşil). Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. A ve B Ölçek çubukları, 1 mm; C, 100 mikron ve D 50 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
En önemlisi, normal SHG, klasik matris saptama yöntemi 23 ile tespit edilemez yapısal proteinler, görselleştirilebilir. Örneğin, bu tenaskin C (Şekil 3A), kanser gelişimi sürecinde ifade edilen bir matris protein bulundu, yara iyileştirici ve iltihap 19 fibriler kolajenler (Şekil 3B), tümör stromanın farklı yerlerde yatırılır. Bu matris heterojenlik tümör hücre dağılımı ve metastaz (Şekil 3C) etkileyebilir.
t "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 3.. Dorsal kulak dermiş canlı çoklu foton mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir. Tümör B16-F10 tek bir alan. Tümör stroma tenaskin C antikor ile etiketlenmiştir ve boyama anti-keçi-594 eşek antikoru ile tespit edildi. Tenaskin C (kırmızı) immünofloresan ağ A'da gösterilen ve fibriler kollajen B'de ikinci harmonik oluşumu (SGH) ile tespit edilir. Bu iki ağlar (birleştirilmiş) C tümör hücreleri (mavi) ile bindirilmiş. Tenaskin C tarafından işaretlenen yeni tümör matris SHG (yeşil) ile tespit fibrillar kolajenlerin ile örtüşen değildir. 44, dört kez z adım 1,0 mikron ile z-bölümleri ortalama ile görüntü 16 bit renk derinliği modunda satın alındı. Iki foton mikroskop ile toplanan görüntüler. Ölçek çubuğu, 100 mikron.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Farklı tümör matris bileşenlerinin tümör matris (örneğin, tenaskin C ve kolajen IV) immunolabeling sonra biz olabilir tespit sınırlı ve tümör matris yönlü yeniden ani etkinlik (Video 1). Biz yaralar 11,24 iyileşme olması durumunda, daha önce gösterdiği gibi tümör mikro-Kuvvetler içinde geliştirmek tümör matris ve sonuç şekillenmesi ve benzer ölçüde tümör damar uzama genişleme ya da daralmaya neden olabilir.
Kollajen IV (kırmızı) ve tenaskin C (camgöbeği), kan damarları (ok) uzayacağı ve pasif üç tümör hücreleri (yeşil) translocate ile etiketlenmiş tümör matriks Video 1. Genişleme. Teascin C-zengin tümör matris translocate kan damarı (kırmızı yatay odaklı structur lokalize daralmae) görüntüleme 12 saat boyunca yaklaşık 100 mikron ile. Immünfloresans steriomikroskop toplanan Görüntüler. Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Bu deneylerde kullanılan foton akısı oksidasyon hızlı bir şekilde 25 korunmazsınız floresan boyalar ağartılması gibi florofor etiketi ile birlikte çoklu foton mikroskopi kullanılarak sorunludur. Burada biz aynı anda hatta (Video 2) yüksek foton yoğunluğu iki-foton mikroskopi Flüoroforlann minimal photobleaching imüno tenaskin C matrisi görüntüleme ederken biz iki-foton time-lapse mikroskobu gerçekleştirebilirsiniz olduğunu göstermektedir.
Iki-foton mikroskopi sırasında tenaskin C immünofloresans (kırmızı) Video 2. Düşük seviyeli photobleaching. B16-F10-GFP tümör hücreleri (mavi) 9 gün aşılamadan sonra açık dorsal kulak görüntülendi. Flüoresan sinyali, askorbat-uygulanması ile korunduGörüntülenmiş doku üzerine Ringer tamponu. Ikinci harmonik üretimi (yeşil) dört kez z aşamalı 1.9 um ile z-ortalama bölümleri 11, 15 dakika boyunca satın alınmıştır C. 16 bit renk derinliği görseli tenaskin temsil yeni matris ile üst üste değildir. Görüntüler toplanan 6 z-düzlemleri içinde her 1 dakika 5 saniye toplanmıştır. Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Ayrıca, metastatik tümör hücreleri ile bağışıklık-hücre etkileşimleri görüntülenmiş. 8 saat iv transfüzyon sonrası tümör-ilişkili kan damarlarından damar dışına bir tümör taşıyan fareden CMTPX etiketli splenositler, tümörün işgal matris ve aktif bir uzun süreli temas hücre (Video 2) oluşturulması ile tümör hücreleri ile etkileşim. Flüoroforla 647-etiketli kolajen IV yapıları görüntüleme 12 saat boyunca Photobleaching dirençli idi.
Tümörden CMTPX etiketli splenositler (B16-F10)-b Video 3. Etkileşimbireysel tümör hücreleri (GFP-B16-F10) ile fare küpe. Splenositler kollajen IV için doku boyama sonra transfüzyonu iv idi. Kollajen IV-yeşil (647) Splenositler-kırmızı (CMTPX), B16-F10 siyan (GFP). Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. Video süresi 12 saat. Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Yeni izole edilmiş tümör hücrelerinin maruz kulak dermiş kolajen IV için önceden lekelenmiş üzerinde kaplanmıştır. Biz dokuya yapışan sonra hücrelerin bazı gruplar, kan damarları ve adipositin bazal membran boyunca toplu göç başladı görülmektedir olabilir.
Video 4. Tümör hücreleri bazal membran boyunca göç ederler. Normal kulak derisi taze geçişli B16-F10-GFP hücreleri ile örtüldü ve 5 saat süre ile görüntülendi (kırmızı 647) kolajen IV için boyandı. Dokuya yapışık bazı tümör hücrelerinin birlikte ortak göç başladıkan damarları ve adipositlerin bazal membran. Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. Video süresi:. 5 saat Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Kulak dermis neredeyse iki boyutlu olduğu için Ayrıca, biz kolayca yerine daha yavaş ve daha pahalı confocal veya multiphoton mikroskobu, hızlı, floresan stereomikroskobi kullanarak veri geniş hacimli toplamak olabilir. Ancak, bizim intravital ile söz konusu tarama mikroskobu yöntemlerden herhangi birini kullanmak da mümkündür IF preparatları (Şekil 3, Video 1).
Discussion
Önem
Burada yüksek çözünürlük ve lifimsi yanı sıra örgü benzeri matriks proteinleri dahil olmak üzere farklı doku mikroçevresinin bileşenleri, dinamik görselleştirme sağlayan bir roman intravital mikroskopi yaklaşım sunmak. (I) intravital flüoresan görüntüleme kan veya lenf eriyik sızıntı izlemek için, örneğin, mikrodolaşım çalışmalarda kullanılmıştır, ancak imüno kombine değil: Bu yöntem, mevcut intravital görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığı zaman pek çok avantajı vardır. (Ii) genetiği değiştirilmiş muhabiri farelerin kullanılması yansıması için özel hücre türleri için izin verir, ama onların durumunu (veya yenilerini oluşturmak için büyük çaba) gerektirir ve okudu olabilir hücre tiplerini etkileşim sayısını sınırlar. (Iii) Hücre dışı matriks ikinci harmonik kuşak kullanılarak in vivo görüntülü olabilir, ancak bu teknik sadece önemli hücre bileşenleri, çok sayıda bırakarak elyaflı kolajenleri algılayabilirbazal membranların, fibronektinler, tenascins, büyüme faktörleri, kemokin ve güncel araştırma için ulaşamayacağı doku glikozaminoglikanların gibi. Bizim yöntem bu kısıtlamaların üstesinden, ve standart görüntüleme teknikleri büyüme faktörleri (örn. VEGF 26) ve kemokinleri (CCL21 5,18 ve Şek. 2B bağlayıcı diğer hücre tipleri, doku yapıları, heparin sülfat mevduat için immunostainings ile birleşmiş ve daha fazla kombine edilmesini sağlar ), ya da hücre dışı matris proteinleri, aynı zamanda kan ve / veya lenf akışı izleme sırasında.
Sınırlamalar
Intravital IF epifluorışıma görüntüleme kalın hipodermiste (adipoz dokusu) yoksun ince cilt kapakları, sınırlıdır. Biz dorsal kulak dermis teknik kulak dermiş ile sınırlı değildir IF intravital ile kulak deri epifluoresan nispeten zararsız cerrahi maruz için en uygun olan ve potansiyel olarak örneğin uygulanabilir ki bulurkenayak parmakları veya yeni doğmuş fare arka derinin açıkta kalan cilt. Imünofloresansta hızlı antikor boyama (15 dakika) IF pasif difüzyon bağımlı değil ama fonksiyonel lenfatik drenajı ve interstisyel sıvı akışı gerektirir, lenf damarları 27 tıkalı ise dolayısıyla hiçbir lekelenme görülebilir. Bu doğrultuda, lenf damarları güçlü sonra sızan kan damarsal (yaralı gemiler, arteriol) 5. leke. Dorsal ve ventral kulak deri kanatların ayrılması hafif bir cerrahi prosedürdür ancak çeşitli doku hücrelerine bir kılcal ve hücre ölümüne yaralanmasına neden olmaktadır. Örneğin bir hücre sağkalım üzerine ilaçların hafif etkisi bakarak, tamamen sağlam dokuyu araştırmak gerektiğinde bu bir sorun olabilir. Ayrıca fototoksisite ve ağartmanın gelen cildi korumak için hizmet veren antioksidan uygulama doku oksidatif stres veya nitrik oksit biolog örneğin çalışma Intravital immünfloresans tekniğinin kullanılmasını hariçy.
Son olarak, bağışıklık kompleksleriyle doku yerleşik makrofaj kör, bu hücreler ve doku bağışıklık tepkisi ve dendritik hücre aktivasyonunun etkisi, örneğin çalışma aktive edebilir.
Değişiklikler ve sorun giderme
Doku oksidatif stres veya nitrik oksit biyoloji incelemek için, askorbat deneysel çıkışı ile karışmaz diğer doku uyumlu bir ortam ile değiştirilmesi gerekir. Çalışmanın amacı, işlevi ve bağışıklık yanıtı, doku ve dendritik hücre aktivasyonu ve göç aktivasyonu ise ilgili dermal bağışıklık hücreleri üzerinde bloke Fc reseptörleri kaçınılmalıdır. Bu, (F (ab ') 2 antikor fragmanları) veya algılama reaktifleri olarak biyotinile antikor ve fluoresan streptavidin kullanımı yarılır Fc fragmanı ile ikincil antikorun kullanılması ile yapılabilir.
Gelecek uygulamalar
Ayrıca yeni ve benzersiz bir intra mevcutönemli bir IF iki foton mikroskopi kullanılarak tespit SHG-fibriler ve olgunlaşmış kolajenlerin ile kombinasyon halinde transplante deri tümörlerde hücre dışı matrisin görüntü fibriler olmayan bileşenlere tekniği. Epifloresans görüntüleme fazla çoklu foton (veya konfokal) mikroskopi kullanılarak avantajlarından biri, z-istifleme olasılıktır ve sonuç olarak hücre-dışı matris içinde meydana gelen olaylar eş-lokalizasyonu uzamsal, lenf ya da kan damar içine, örneğin, tümör intravazasyon ki durumunda standart epifluorışıma mikroskopi sadece işgalci hücrenin morfolojik değişimler anlaşılabilir. Bu teknik, çok daha geniş bir potansiyele sahiptir. Lenfatik özgü fotodinamik terapi 27 lenfatik tıkanma mekanizmasını araştırmak için IF Örneğin, intravital kullandık. Bu yöntemin ilave potansiyel uygulamalar arasında, ancak nakli reddi veya kan ve lenf yöntemleri iltihabı, bağışıklık mekanizması sırasında cilt incelenmesi ile sınırlı değildir tümörigenez sırasında problemlerle damarı büyümesi.
Prosedür kritik adım
Fizyolojik doku ortamda sürdürülmesi için kritik etkileri vardır en önemli adım dorsal dermis ventral deri ve kıkırdak bir cerrahi ayrılmasıdır. Kesme ya da majör arter veya ven kapatılmasıy tedavileri ve hücre hareketi 8 hücresel yanıtı etkileyecek olan, aşırı kanama ve lokal doku hipoksi yol açacaktır. Cerrahi yapıştırıcı ile kulağını hareketsizleştirir doku ortaya üzerine tutkal dökülüp olarak dikkatle yapılmalıdır kan damarlarının tıkanması ile dokuya kalıcı bir yaralanmaya neden olacaktır. Fare sıcaklığı 37 ° C 'de kontrol ve tutulmalıdır Gözler ve akciğerler düzgün deney sırasında nemlendirilmiş kalmak, böylece Ayrıca, nemlendirilmiş oksijen, izofluran anestezi için kullanılması gerekmektedir. Aynı zamanda, sodyum askorbat, taze hazırlanmalıdır ve pH kullanılmadan önce kontrol edilir.
Özet olarak ntent ">, bu intravital imüno-fare deri kompleks hücresel olayların moleküler görüntüleme ile fizyolojik fonksiyonun gerçek zamanlı, yerel ölçümler köprü oluşturur. kolayca sonrası gelişim, örneğin çalışma uygulanabilir Dahası, bu yöntem, büyük bir potansiyele sahip Kan ve lenf-anjiyogenez veya esneklik ve yüksek verim potansiyeline sahip. çeşitli patojenik ajanlarla cilt enfeksiyonu erken evrelerini görselleştirmek için mekanizmalar, bu intravital tekniği önemli ölçüde biyoloji birden alanlarına katkıda bulunabilir.Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar görüntü işleme konusunda yardım için Jeremy CM Teo ve S. Ryan Oliver katkılarından ve Jolanta Kilarska minnettarız. Biz iki-foton mikroskobu ile destek için EPFL'deki BIOP çekirdek tesis teşekkür
Bu çalışma, Avrupa Araştırma Komisyonu (DC-Lenf, 206653-2), Avrupa Çerçeve Projesi 7 (AngioScaff), İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31-135756) ve Sağlık US National Institutes hibe tarafından desteklenmiştir (NIH) / NIH Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) (RO1 HL096539). Ayrıca, Robert Wenner Ödülü (İsviçre Kanser Birliği) fonları alım Bu çalışmada kullanılan Leica stereomikroskopta izin verdi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice Strain | |||
| BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
| C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
| Cell Line | |||
| B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
| Anesthesia Maintenance | |||
| Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
| Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
| DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
| Stereomicroscope | |||
| Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 1X lens (linear system magnification from 7.5X to 160X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 2X lens (linear system magnification from 15.6X to 320X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| Multiphoton Microscopy | |||
| LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| HCX APO 20X/1.2 oil immersion | |||
| Chameleon Ultra Laser | |||
| Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
| Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
| Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
| Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
| Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
| Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
| Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
| LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
| CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
| Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
| CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
| Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
| Cell Culture Reagents | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
| Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
| PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |
References
- Martinez-Corral, I., et al. In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis. Proc Natl Acad Sci. , (2012).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels. Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis. PLoS ONE. 8, (2013).
- Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).
- Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).
- Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. 1-14 (2005).
- Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nat Med. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. 15, 657-664 (2009).
- Sahai, E., et al. Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy. BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).
- Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).
- Pinner, S., Sahai, E. Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo. J. Microsc. 231, 441-445 (2008).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions. Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).
- Giampieri, S., et al. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
- Weber, M., et al. Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients. Science. 339, 328-332 (2013).
- Midwood, K. S., Orend, G. The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis. Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. 340-341 (2006).
- Sund, M., Kalluri, R. Tumor stroma derived biomarkers in cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies. Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).
- Patterson, G. H., Piston, D. W. Photobleaching in two-photon excitation microscopy. Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).
- Jakobsson, L., et al. Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis. Dev Cell. 10, 625-634 (2006).
- Kilarski, W. W., et al. Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis. Angiogenesis. , (2013).
