Kolorimetrisk Papir-baseret detektion af<em> Escherichia coli</em><em> Salmonella</em> Spp. Og<em> Listeria monocytogenes</em> Fra store mængder af Agricultural Water
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Denne protokol beskriver hurtig kolorimetrisk påvisning af Escherichia coli, Salmonella spp. Og Listeria monocytogenes fra store mængder (10 L) på landbrugs-farvande. Her er vandet filtreret gennem steril Modified Moore Vatpinde (MMS), som består af et simpelt gaze filter indesluttet i en plastik patron, at koncentrere bakterier. Efter filtrering, er ikke-selektive eller selektive berigelser for målbakterierne udføres i MMS. For kolorimetrisk detektion af den pågældende bakterie, er berigelser derefter analyseret ved hjælp af papirbaserede analytiske enheder (μPADs) indlejret med bakteriefri vejledende substrater. Hver substrat reagerer med målrettede vejledende bakterielle enzymer, genererer farvede produkter, der kan påvises visuelt (kvalitativ detektion) på μPAD. Alternativt kan digitale billeder af de omsatte μPADs blive genereret med fælles scanning eller fotografisk udstyr og analyseret ved hjælp af ImageJ software, algende for mere objektiv og standardiseret fortolkning af resultaterne. Selv om de biokemiske screening procedurer er designet til at identificere de nævnte bakterielle patogener, kan i nogle tilfælde enzymer produceret af baggrunden mikrobiota eller nedbrydning af de kolorimetriske substrater producerer en falsk positiv. Derfor er der behov for bekræftelse ved hjælp af en mere diskriminerende diagnostisk. Ikke desto mindre er denne bakterie koncentration og afsløring platform er billig, følsom (0,1 CFU / ml detektionsgrænse), let at udføre, og hurtig (koncentration, berigelse, og detektion udføres inden for ca 24 timer), der begrunder dens anvendelse som en indledende screening metode for mikrobiologisk kvalitet af landbrugets vand.
Introduction
Det er vigtigt, at fødevarebårne smitstoffer opdages hurtigt og helst i felt-baserede indstillinger for at mindske byrden af fødevarebårne sygdomme. Fælles strategier for afdækning fødevarebårne bakterielle patogener omfatter biokemisk profilering, selektiv og differentieret dyrkning, immunologisk isolation og afsløring og molekylær påvisning. Men disse metoder hæmmet af sporadisk forurening, små prøver testede størrelser de ofte lave koncentrationer af de fødevarebårne sygdomsfremkaldende bakterier, kræver lange sagsbehandlingstider, og / eller gælder ikke for feltindstillingerne. Yderligere forbindelser i mange fødevarer matricer er hæmmende for opdagelse og diagnostiske applikationer. For at forbedre sandsynligheden for mikrobiel afsløring, har USA Food and Drug Administration foreslog at teste landbruget vand (såsom vaskevand og vand til kunstvanding), som enten kommer i kontakt med et stort areal af friske råvarer eller tjener som et køretøj for produce forurening er et levedygtigt alternativ til direkte test af fødevarer 1. Alligevel den ofte lave naturlige patogen-byrde kombineret med udvandingseffekt den repræsentative vandprøve landbruget gør prøveforberedelsesmetoder til patogen-koncentration afgørende. En sådan metode ville kræve prøvetagning store mængder vand (≥ 10 L), tilstrækkelig patogen-koncentration, og kompatibilitet med downstream strategier afsløring.
Modificeret Moore podninger (MMS) er billige, enkle og robuste enheder, der anvendes til at koncentrere bakterier fra store mængder (≥ 10 L) vand 2-4. MMS består af en plastik kassette fyldt med gaze, der tjener som et groft filter til store mængder vand pumpes gennem kassetten ved hjælp af en peristaltisk pumpe. MMS er en ikke-diskriminerende metode til bakteriel koncentration (≥ 10 gange koncentration), der fanger organisk og uorganisk partikulært materiale, herunder mikroorganismer i forarbejdede liquid prøver. Det er sandsynligt, at den fremragende effekt af koncentrationen af målmikroorganismer fra MMS kan forklares ved, at mikroorganismer forventes at blive knyttet til silt-lerfraktion eller organiske mikro-aggregater af de suspenderede stoffer 3. Den kraftige konstruktion af MMS mulighed for at overvinde de fleste mangler er forbundet med andre filtrerings metoder til opsamling og koncentration af bakterier fra vand, såsom tilstopning af filtre, manglende evne til at behandle store mængder, filtrer prøver med høj turbiditet, og høje omkostninger. Af disse grunde er FDA anbefaler, at mms er indarbejdes i de officielle procedurer for miljø og producere-relaterede prøve indsamling procedurer 5.
Her beskrives en fremgangsmåde til koncentration, berigelse, og afsløring af Escherichia coli, Salmonella spp. Og Listeria monocytogenes fra landbruget farvande. En MMS bruges til koncentration af bactEria, og fungerer også som et fartøj for selektiv eller ikke-selektiv bakteriel berigelse. Bakteriel detektion opnås biokemisk bruge papirbaserede analytiske enheder (μPADs) 6. μPADs kan fremstilles som fluidstyrede netværk eller stikprøvekontrol ved hjælp af forskellige metoder, herunder fotolitografi, inkjet print, stempling, og voks udskrivning 7-11. Eksempler på fluidstyrede design kan være dendritiske Kanalmønstre hvor prøven findes deponeret i midten og derefter strømme til distale reservoirer eller single Kanalmønstre hvor prøven eller underlaget er trukket fra de ydre reservoirer af kanalen ved kapillarvirkning i centrum 12.. Til denne protokol, har vi valgt at anvende for 7 mm diameter voks-papir spot arrays indlejret med kromogene substrater, som kan behandles ved hjælp af enzymer vejledende af de testede her mikroorganismer: Chlorphenol rød β-D-galactopyranosid (CPRG) og 5 – brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc)til påvisning af β-galactosidase og β-glucuronidase produceret af E. coli; 5-brom-6-chlor-3-indolyl caprylat (magenta caprylat), til påvisning af C8-esterase-produceret af Salmonella spp.; og 5-brom-4-chlor-3-indolyl-myo-inositol-phosphat (X-InP) til påvisning af phosphatidylinositol-specifik phospholipase C (PI-PLC), der produceres af L. monocytogenes 6. Således kan tilstedeværelsen af en særlig bakterie, iagttages visuelt uden behov for kompliceret udstyr eller ved fortolkningen af data. Specificitet og sensitivitet af enzym-baserede kolorimetrisk μPAD detektion af disse specifikke målbakterier er tidligere blevet udforsket 6. Desuden blev følsomheden af den integrerede koncentration-påvisningsmetode for disse målbakterier evalueret ved at tilsætte store mængder af vand med forudbestemte niveauer af mikroorganismer (upublicerede data og Bisha et al. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en integreret fremgangsmåde til påvisning af E. coli, Salmonella spp. og L. monocytogenes i landbrugets vand. Her MMS koncentrationen af bakterier fra store mængder (10 L) på landbrugs-vand, er koblet med bakteriel berigelse, og bakteriel-vejledende kolorimetrisk påvisning ved μPADs. MMS procedure kan klare højt indhold partikler i vandprøverne mens koncentrere bakterier 10-fold, er robust og enkel nok til marken ansøgninger minimalt uddannet personale, og kan ud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
