Summary

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonellen</em> Spp. Und<em> Listeria monocytogenes</em> Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

Published: June 09, 2014
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Summary

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt schnellen kolorimetrischen Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser. Hier wird das Wasser durch sterile Tupfer Modified Moore (MMS), die eine einfache Gewebefilter in einem geschlossenen Kunststoffpatrone aus filtriert, um Bakterien zu konzentrieren. Nach der Filtration sind nicht-selektive oder selektive Anreicherungen für die Ziel Bakterien in der MMS durchgeführt. Zum kolorimetrischen Nachweis der Target-Bakterien sind die Anreicherungen dann unter Verwendung von Papier-basierten Analysevorrichtungen (μPADs) mit Bakterien-Richt Substrate eingebettet getestet. Jedes Substrat reagiert mit dem Ziel anzeigenden bakteriellen Enzymen, die Erzeugung farbigen Produkte auf dem μPAD visuell (qualitativer Nachweis) detektiert werden kann. Alternativ können digitale Bilder der umgesetzten μPADs mit gemeinsamen Scannen oder fotografische Geräte erzeugt und mit ImageJ-Software, al analysiert werdengende für mehr objektive und standardisierte Interpretation der Ergebnisse. Obwohl die biochemischen Screening-Verfahren wurden entwickelt, um die oben genannten bakteriellen Krankheitserregern zu identifizieren, kann in einigen Fällen durch Enzyme Hintergrund Mikrobiota oder den Abbau der farbmetrischen Substraten ein falsch positives zu produzieren. Daher Bestätigung mit einem diskriminierender Diagnose erforderlich ist. Dennoch ist diese Bakterienkonzentration und Detektionsplattform preiswerte, empfindliche (0,1 CFU / ml Nachweisgrenze), leicht durchzuführen und eine schnelle (Konzentration, Anreicherung und Nachweis innerhalb von etwa 24 Stunden durchgeführt wird), rechtfertigen ihre Verwendung als ein Anfangsscreeningverfahren für die mikrobiologische Qualität der landwirtschaftlichen Wasser.

Introduction

Es ist wichtig, dass lebensmittelbedingten Krankheitserreger schnell und vorzugsweise im Bereich der Basis-Einstellungen, um die Belastung der Lebensmittelerkrankungen reduzieren erkannt. Gemeinsame Strategien, um lebensmittelbedingten bakteriellen Krankheitserregern erkennen sind biochemische Profiling, selektiven und differentiellen Kultivierung, Isolierung und immunologische Nachweis und molekulare Erkennung. Allerdings sind diese Methoden durch sporadische Kontamination behindert, getestet kleinen Stichproben, die oft geringen Konzentrationen der lebensmittelbedingten pathogenen Bakterien, lange Bearbeitungszeiten, und / oder sind nicht für Feldeinstellungen. Ferner können Verbindungen, in vielen Nahrungs Matrizen hemmend Erkennung und Diagnostik. Um die Wahrscheinlichkeit von mikrobiellen Erkennung verbessern, hat die US-amerikanischen Food and Drug Administration vorgeschlagen, dass die Prüfung der landwirtschaftlichen Wasser (wie z. B. Waschwasser und Bewässerung), die entweder in Kontakt mit einer großen Oberfläche von frischen Produkten oder dient als Vehikel produce Kontamination ist eine praktikable Alternative zur direkten Prüfung von Lebensmitteln ein. Auch so macht der oft geringen natürlichen Erreger-Belastung verbunden mit der Verdünnungseffekt des repräsentativen landwirtschaftlichen Wasserprobe Probenvorbereitungsverfahren für Erreger-Konzentration wesentlich. Ein solches Verfahren würde erfordern Abtasten großer Wassermengen (≥ 10 L), angemessene pathogen-Konzentration und Kompatibilität mit nachgeschalteter Nachweisstrategien.

Geändert Moore Tupfer (MMS) sind preiswert, einfach und robuste Geräte für die Konzentration von Bakterien große Mengen (≥ 10 l) Wasser 2-4 verwendet. Der MMS besteht aus einer Kunststoffkassette mit Gaze, die als Grobfilter für große Wassermengen durch die Kassette unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe gepumpt dient gefüllt. Die MMS ist eine nicht-diskriminierende Methode der Bakterienkonzentration (≥ 10 fache Konzentration), die organischen und anorganischen Partikelmaterial erfasst einschließlich Mikroorganismen in verarbeiteten liquid Proben. Es ist wahrscheinlich, dass die ausgezeichnete Wirksamkeit der Konzentration der Ziel-Mikroorganismen durch den MMS kann durch die Tatsache, dass Mikroorganismen sollen zu dem Schluff-Lehm-Fraktion oder organische Mikroaggregate der suspendierten Feststoffe 3 befestigt werden erläutert. Das robuste Design des MMS können für die Überwindung meisten Mängel mit anderen Filtrationsverfahren für die Erfassung und Konzentration von Bakterien aus Wasser, wie das Verstopfen von Filtern, die Unfähigkeit, große Mengen zu verarbeiten, Filterproben mit hoher Trübung und hohen Kosten verbunden. Aus diesen Gründen wird die FDA empfiehlt, dass die MMS in offiziellen Verfahren für Umwelt-und produzieren bezogenen Probensammelverfahren 5 eingearbeitet werden.

Hier wird ein Verfahren zur Konzentration, Anreicherung und den Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus landwirtschaftlichen Wasser beschrieben. Eine MMS ist für die Konzentration von bact verwendetEria, und dient auch als Behälter für die selektive oder nicht selektive Bakterienanreicherung. Nachweis von Bakterien biochemisch mit Papier-basierten Analysegeräte (μPADs) 6 gelöst. μPADs als fluidische Netzwerke oder Spot-Tests mit einer Vielzahl von Verfahren der Photolithographie, Tintenstrahldruck, Stanz-, und Wachsdruck 7-11 hergestellt werden. Beispiele von Fluid Motive können dendritische Kanalmuster, wo die Probe in der Mitte abgeschieden und fließt anschließend zu dem distalen Reservoirs oder Einzelkanalmuster in der die Probe oder das Substrat von der äußeren Reservoirs der Kanal durch Kapillarwirkung in der Mitte 12 herausgezogen werden. Aus diesem Protokoll, die wir gewählt haben, um für 7-mm-Durchmesser Wachs-Papier-Spot-Arrays mit chromogenen Substraten eingebettet, die durch Enzyme, die auf den hier getesteten Mikroorganismen verarbeitet werden können, beschäftigen: Chlorphenolrot β-D-galactopyranosid (CPRG) und 5 – Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc)für den Nachweis von β-Galactosidase und β-Glucuronidase von E. hergestellt coli; 5-Brom-6-chlor-3-indolyl Caprylat (magenta Caprylat) zum Nachweis von C8-Esterase von Salmonella spp. und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-myo-inositol-phosphat (X-InP) für die Detektion von Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) von L. hergestellt monocytogenes-6. Somit kann das Vorhandensein eines bestimmten Bakteriums visuell ohne die Notwendigkeit für komplexe Anlagen oder die Interpretation der Daten zu beobachten. Die Spezifität und Sensitivität der Enzymbasis μPAD kolorimetrischen Detektion dieser spezifischen Zielbakterien zuvor erforscht worden 6. Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit der integrierten Konzentrationsnachweisverfahren für diese Zielbakterien durch Aufstocken von großen Volumina von Wasser mit vorbestimmten Mengen an Mikroorganismen (unveröffentlichte Daten und Bisha et al. 13) ausgewertet.

Protocol

1. Konzentration der Bakterien aus großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser Mit MMS MMS Vorbereitung Schneiden Sie einen rechteckigen Querschnitt von 4-lagige Gaze 40 x 12 cm. Falten Sie die Gaze an beiden Achsen, um ein Rechteck von 20 x 6 cm erhalten. Rollen Sie die Gaze dicht entlang seiner Längsachse um einen zylindrischen Tupfer von ca. 6 cm hoch und 3 cm im Durchmesser bilden. Autoklavieren die Gaze Tupfer in Aluminium-Folie, nicht die Kassette im Autoklaven….

Representative Results

Wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die Konzentration der Bakterien unter Verwendung der MMS (Fig. 1) innerhalb von ca. 15-20 Minuten durchgeführt werden. Die MMS aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) in zwei getrennten Komponenten aufgebaut ist; einen Deckel und eine Kassette sowohl mit einem integrierten Zapfhahnanordnung in die ein zylindrischer Gaze Tupfer eingeführt wird (Fig. 1A). Beide Komponenten werden dann zusammengeschraubt, welche die MMS (Abbildung 1B).</str…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein integriertes Verfahren zur Detektion von E. coli, Salmonella spp., und L. monocytogenes in landwirtschaftlichen Wasser. Hier MMS Bakterienkonzentration aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser wird mit Bakterienanreicherung gekoppelt und gegen Bakterien anzeigt colorimetrische Detektion mit μPADs. Der MMS-Verfahren mit hoher Partikelgehalt in den Wasserproben zu bewältigen, während die Konzentration der Bakterien 10-fach, ist robust und einfach genu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.

Materials

Agricultural water Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing Wilmar BN-CVT1005  1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge  Lumiere Diagnostics 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth Chesapeake Wiper & Supply, Inc. CC90 Grade #90, 44 × 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach Various Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate Mallinckrodt Baker Inc 8100-04
Manifold Built in-house Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump Micron Meters RPP1300 Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette Various Disposable, 10ml
Universal preenrichment broth Difco 223510
Buffered peptone water Difco 218105
Salmonella supplement Biomérieux Industry 42650 http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth Biomérieux Industry 410848 http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin Sigma-Aldrich 861987 http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid Various Drummond DP-110 used here
Shaking incubator Various Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette  Various 10 μl, 1 ml
Micropipette tips Various Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase- free
Probe sonicator Q Sonica LLC XL-2000 series
µPADs Avant  Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] Sigma-Aldrich H3375
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) Sigma-Aldrich B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)  Sigma-Aldrich 53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)  Sigma-Aldrich 38896
Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm Various Sterile
Flat bed scanner Various Xerox USB scanner
ImageJ software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/

References

  1. . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
  4. McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
  5. . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
  6. Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
  9. Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
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  13. Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).

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Bisha, B., Adkins, J. A., Jokerst, J. C., Chandler, J. C., Pérez-Méndez, A., Coleman, S. M., Sbodio, A. O., Suslow, T. V., Danyluk, M. D., Henry, C. S., Goodridge, L. D. Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water. J. Vis. Exp. (88), e51414, doi:10.3791/51414 (2014).

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