Colorimetric Papir-basert gjenkjenning av<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonella</em> Spp.., Og<em> Listeria monocytogenes</em> Fra store mengder vann i landbruket
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Denne protokollen beskriver hurtig kolo påvisning av Escherichia coli, Salmonella spp.., Og Listeria monocytogenes fra store volumer (10 L) av landbruk farvann. Her blir vannet filtrert gjennom steril Modifiserte Moore Spinner (MMS), som består av et enkelt gasfilter innelukket i en plastpatron, å konsentrere bakteriene. Etter filtrering, er ikke-selektive eller selektive enrichments for målet bakterier utføres i MMS. For kolorimetrisk påvisning av mål-bakterier, blir de anrikninger og deretter analysert ved hjelp av papirbaserte analytiske enheter (μPADs) innebygd med bakterie indikative substrater. Hver underlaget reagerer med target-indikative bakterielle enzymer, genererer fargede produkter som kan oppdages visuelt (kvalitativ deteksjon) på μPAD. Alternativt kan digitale bilder av de reagerte μPADs bli generert med vanlig skanning eller fotografiske enheter og analysert ved hjelp ImageJ programvare, algende for mer objektiv og standardisert tolkning av resultatene. Selv om biokjemiske screeningprosedyrer er utformet for å identifisere de nevnte bakterielle patogener, kan det i noen tilfeller enzymer produsert av bakgrunns mikrobiota eller nedbrytning av de kolorimetriske substrater produsere en falsk positiv. Derfor er en bekreftelse ved å bruke en mer diskriminerende diagnostisk behov. Ikke desto mindre er denne bakteriekonsentrasjon og deteksjon plattform billig, sensitiv (0,1 CFU / ml deteksjonsgrense), lett å utføre, og hurtig (konsentrasjon, anrikning, og deteksjon utføres i løpet av omtrent 24 timer), rettferdiggjøre dens anvendelse som en innledende screening-metoden for den mikrobiologiske kvaliteten på landbruks vann.
Introduction
Det er viktig at matbåren sykdom agenter blir oppdaget raskt og helst i feltbaserte innstillinger for å redusere byrden av matbåren sykdom. Felles strategier for å oppdage matbårne bakterier inkluderer biokjemiske profilering, selektiv og differensial dyrking, immunologiske isolasjon og deteksjon, og molekylær påvisning. Imidlertid er disse metodene hemmet av sporadisk forurensning, små utvalgsstørrelser testet, de ofte lave konsentrasjoner av matbårne sykdomsfremkallende bakterier, krever lang saksbehandlingstid, og / eller er ikke aktuelt for feltet innstillinger. Videre forbindelser i mange matvarer matriser er hemmende for deteksjon og diagnostiske applikasjoner. For å øke sannsynligheten for mikrobiell påvisning, har United States Food and Drug Administration antydet at testing av landbruks vann (for eksempel som vaskevann og vanningsvann) som enten kommer i kontakt med en stor overflate av ferskvarer, eller tjener som en bærer for produce forurensning er et levedyktig alternativ til direkte testing av mat en. Likevel, den ofte lav naturlig patogen-byrden kombinert med utvanningseffekten av den representative landbruks vannprøve gjør prøveopparbeidelse metoder for patogen konsentrasjon avgjørende. En slik fremgangsmåte ville kreve prøvetaking av store mengder vann (≥ 10 L), tilstrekkelig patogen-konsentrasjon, og kompatibilitet med nedstrømsdeteksjons strategier.
Modifiserte Moore vattpinner (MMS) er rimelige, enkle og robuste enheter som brukes for å konsentrere seg bakterier fra store volumer (≥ 10 L) vann 2-4. MMS består av en plastkassett fylt med gas, som tjener som et grovfilter for store volumer av vann som pumpes inn i kassetten ved hjelp av en peristaltisk pumpe. MMS er en ikke-diskriminerende metode for bakterie-konsentrasjonen (≥ 10 ganger konsentrasjon) som fanger organisk og uorganisk partikkelformet materiale, inkludert mikroorganismer i bearbeidet liQuid prøver. Det er sannsynlig at den utmerkede effekten av konsentrasjonen av mål-mikroorganismer ved MMS kan forklares ved det faktum at mikroorganismer som er ventet å bli festet til silt-leirefraksjonen eller organiske mikro-aggregater av de suspenderte faste stoffer tre. Den robuste konstruksjon av MMS åpner for å overvinne de manglene assosiert med andre filtreringsmetoder for fangst og konsentrasjonen av bakterier fra vann, slik som tilstopping av filtre, manglende evne til å behandle store mengder, filtrer prøver med høy turbiditet og høye kostnader. For disse grunner, er det FDA anbefale at MMS er innarbeides i offisielle prosedyrer for miljø-og produsere relaterte prøvetakingsprosedyrer fem.
Her blir en fremgangsmåte beskrevet for konsentrasjon, anrikning, og påvisning av Escherichia coli, Salmonella spp.., Og Listeria monocytogenes fra landbruks farvann. En MMS brukes for konsentrasjon av bacteria, og fungerer også som et fartøy for selektiv eller ikke-selektive bakterie berikelse. Bakteriell deteksjon oppnås biokjemisk ved hjelp av papirbaserte analytiske enheter (μPADs) 6. μPADs kan produseres som fluidic nettverk eller stikkprøver ved hjelp av en rekke metoder, inkludert fotolitografi, blekkutskrifter, stempling, og voks utskrift 7-11. Eksempler på fluidic utførelser kan være dendrittiske kanalmønster, hvor prøven er avsatt i midten og deretter strømmer til distale reservoarer eller enkeltkanalmønster der prøven, eller substratet er trukket fra de ytre reservoarer av kanalen ved kapillærvirkning inn i sentrum 12.. For denne protokollen, har vi valgt å ansette for 7-mm-diameter voks-papir stikk arrays imbedded med kromogene substrater som kan behandles med enzymer som tyder på de mikroorganismer som ble testet her: klorfenol rød β-D-galaktopyranosid (CPRG) og 5 – brom-4-klor-3-indolyl-β-D-glukuronid (X-Gluc)for påvisning av β-galaktosidase og β-glucuronidase produsert av E. coli; 5-brom-6-klor-3-indolyl kaprylat (magenta kaprylat) for påvisning av C8-esterase som produseres av Salmonella spp.;. og 5-brom-4-klor-3-indolyl-myo-inositol-fosfat (X-INP) for deteksjon av fosfatidylinositol-spesifikk fosfolipase C (PI-PLC) produsert av L. monocytogenes seks. Således kan nærvær av en bestemt bakterie observeres visuelt uten bruk av komplisert utstyr eller data-tolkning. Den spesifisitet og sensitivitet av enzymbasert μPAD kolorimetriske deteksjon av disse spesifikke mål-bakterier er blitt tidligere utforsket 6.. I tillegg, ble sensitiviteten av den integrerte konsentrasjonen-deteksjonsmetode for disse mål-bakterier evaluert ved å tilsette store mengder vann sammen med forutbestemte nivåer av mikroorganismer (upubliserte data og Bisha et al. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en integrert fremgangsmåte for detektering av E. coli, Salmonella spp.., og L. monocytogenes i landbruket vann. Her, MMS konsentrasjonen av bakterier fra store mengder (10 l) av jordbruks-vann, er kombinert med bakteriell berikelse, og bakteriell-indikativ kolorimetrisk deteksjon ved hjelp μPADs. MMS-prosedyren kan takle høyt partikkelinnhold i vannprøver mens konsentrere bakterier 10-fold, er robust og enkel nok for feltbruk ved minimal opplært personell, og kan utfør…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
