Summary

Kolorimetrisk Pappersbaserade Upptäckt av<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonella</em> Spp.., Och<em> Listeria monocytogenes</em> Från stora volymer av jordbruks Vatten

Published: June 09, 2014
doi:

Summary

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Abstract

Detta protokoll beskriver en snabb kolorimetrisk upptäckt av Escherichia coli, Salmonella spp.., Och Listeria monocytogenes från stora volymer (10 L) av jordbruks vatten. Här är vattnet filtreras genom steril Modifierade Moore Svabbproverna (MMS), vilka består av en enkel gasväv filter innesluten i en plastampull, att koncentrera bakterier. Efter filtrering, är icke-selektiva eller selektiva anrikningsgrad för målbakterien utförs i MMS. För kolorimetrisk detektion av mål-bakterierna är de anrik analyseras sedan med hjälp av pappersbaserade analytiska enheter (μPADs) inbäddade med bakterie vägledande underlag. Varje substrat reagerar med mål-vägledande bakteriella enzymer, generera färgade produkter som kan detekteras visuellt (kvalitativ detektion) på μPAD. Alternativt kan digitala bilder av de reagerade μPADs genereras med vanlig skanning eller fotografiska apparater och analyserades med ImageJ programvara, aljande för mer objektiv och standardiserad tolkning av resultat. Även om de biokemiska procedurer är utformade för att identifiera de ovannämnda bakteriella patogener, i vissa fall enzymer som produceras av bakgrundsfloran eller nedbrytningen av de kolorimetriska substrat kan ge ett falskt positivt. Därför behövs en bekräftelse med hjälp av en mer diskriminerande diagnostik. Ändå är denna bakteriekoncentration och upptäckt plattform billigt, känsligt (0,1 CFU / ml detektionsgränsen), lätt att utföra, och snabb (koncentration, anrikning, och detektion utförs inom cirka 24 timmar), motiverar dess användning som ett första screeningmetod för den mikrobiologiska kvaliteten på jordbruks vatten.

Introduction

Det är viktigt att agenter livsmedelsburna sjukdomen upptäcks snabbt och helst i fältbaserade inställningar för att minska bördan av livsmedelsburna sjukdomar. Gemensamma strategier för att upptäcka livsmedelsburna bakteriella patogener inkluderar biokemiska profilering, selektiv och differentierad odling, immunologisk isolering och detektion, och molekylär detektion. Men dessa metoder hindras av sporadisk kontamination, små provvolymer testade, de ofta låga koncentrationer av de livsmedelsburna sjukdomsframkallande bakterier, kräver långa handläggningstider, och / eller inte är tillämpliga för lokala inställningar. Vidare föreningar i många livsmedelsmatriser är hämmande för upptäckt och diagnostiska tillämpningar. För att förbättra sannolikheten för mikrobiell upptäckt, har den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration föreslog att testa jordbruks vatten (t.ex. tvättvatten och bevattningsvatten) som antingen kommer i kontakt med en stor yta av färskvaror eller fungerar som ett fordon för produce föroreningar är ett lönsamt alternativ till direkt testning av livsmedel 1. Trots detta gör provberedningsmetoder för patogen koncentration viktigt det ofta låg naturlig patogen-belastning i kombination med utspädningseffekten av den representativa jordbruks vattenprov. En sådan metod skulle kräva provtagning stora mängder vatten (≥ 10 L), adekvat patogen-koncentration, och kompatibilitet med efterföljande strategier upptäckt.

Modifierade Moore kloak (MMS) är billiga, enkla och robusta enheter som används för att koncentrera bakterier från stora volymer (≥ 10 L) vatten 2-4. MMS består av en plastkassett fylld med gasbinda, som fungerar som ett grovfilter för stora mängder vatten som pumpas genom kassetten med hjälp av en peristaltisk pump. MMS är ett icke-diskriminerande sätt för bakteriekoncentration (≥ 10 gånger koncentration) som fångar organiskt och oorganiskt partikulärt material inklusive mikroorganismer i bearbetad liquid prover. Det är troligt att den utmärkta effekten av koncentrationen av målmikroorganismer från MMS kan förklaras av det faktum att mikroorganismer förväntas vara fäst vid silt-lera fraktion eller organiska mikroaggregaten i det suspenderade fasta materialet 3. Den robusta designen av MMS gör för att övervinna de flesta brister i samband med andra filtreringsmetoder för avskiljning och koncentration av bakterier från vatten, såsom igensättning av filter, oförmåga att hantera stora volymer, filterprov med hög grumlighet, och höga kostnader. Av dessa skäl är FDA rekommenderar att MMS införlivas i officiella förfaranden för miljö och producera relaterade provtagningsförfaranden 5.

Här beskrivs en metod för koncentrationen, anrikning, och upptäckt av Escherichia coli, Salmonella spp.., Och Listeria monocytogenes från jordbruket vatten. En MMS används för koncentration av bactEria, och även fungerar som en behållare för selektiv eller icke-selektiv bakterie anrikning. Bakteriell detektion uppnås biokemiskt använda pappersbaserade analytiska enheter (μPADs) 6. μPADs kan tillverkas som fluidic nät eller fläckprov med hjälp av olika metoder inklusive fotolitografi, bläckstråleutskrift, prägling, och vax printing 7-11. Exempel på fluidiska konstruktioner kan vara dendritiska kanalmönster där provet deponeras i centrum och därefter strömmar till distala reservoarer eller enstaka kanalmönster där provet eller substrat dras från de yttre reservoarer av kanalen genom kapillärkraften in i centrum 12. För detta protokoll, har vi valt att använda för 7 mm tjocka vax-papper spot arrayer inbäddade med kromogena substrat som kan bearbetas av enzymer som indikerar de testade här mikroorganismerna: klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG) och 5 – brom-4-klor-3-indolyl-β-D-glukuronid (X-Gluc)för detektion av β-galaktosidas och β-glukuronidas som produceras av E. coli; 5-brom-6-klor-3-indolyl kaprylat (magenta kaprylat) för detektion av C8-esteras produceras av Salmonella spp..; och 5-brom-4-klor-3-indolyl-myo-inositol-fosfat (X-InP) för detektering av fosfatidylinositol-specifikt fosfolipas C (PI-PLC) som produceras av L. monocytogenes 6. Således kan konstateras att förekomsten av en viss bakterie visuellt utan behov av komplicerad utrustning eller tolkning av data. Den specificitet och sensitivitet av enzymet baserade kolorimetrisk μPAD detektion av dessa specifika mål bakterier har tidigare undersökt 6. Dessutom var känsligheten hos den integrerade metoden för dessa målbakterier koncentration-detektion utvärderas genom spetsning av stora volymer vatten med förutbestämda nivåer av mikroorganismer (opublicerade data och Bisha et al. 13).

Protocol

1. Koncentration av bakterier från stora volymer av jordbruks Vatten Använda MMS MMS Framställning Skär ett rektangulärt 4-lagers cheesecloth som mäter 40 x 12 cm. Vik cheesecloth längs båda axlarna för att få en rektangel på 20 x 6 cm. Rulla cheesecloth tätt utmed dess längdaxel för att bilda en cylindrisk svabb av ungefär 6 cm lång och 3 cm i diameter. Autoklavera cheesecloth pinnen i aluminiumfolie, inte autoklaveras kassetten. Dekontaminera kassetten …

Representative Results

Som beskrivs i detta protokoll, kan utföras koncentration av bakterier med hjälp av MMS (figur 1) i ca 15-20 min. MMS i byggda från akrylonitrilbutadienstyren (ABS) i två separata delar; ett lock och en patron både med en integrerad tapp församling i vilken en cylindrisk cheesecloth pinne sätts in (Figur 1A). Båda komponenterna är sedan skruvas ihop bildar de MMS (Figur 1B). MMS-baserad behandling drivs av en batteridriven peristaltisk pump, vilket möjliggör …

Discussion

Detta protokoll beskriver en integrerad metod för att detektera E. coli, Salmonella spp.., och L. monocytogenes i jordbruks vatten. Här, MMS koncentration av bakterier från stora volymer (10 L) av jordbruks vatten, kopplas med bakterie anrikning, och bakterie vägledande kolorimetrisk upptäckt med hjälp μPADs. MMS Förfarandet kan klara av hög partikelhalt i vattenproverna samtidigt koncentrera bakterier 10 gånger, är robust och enkel nog för fältapplikationer med minimalt utbildad personal,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.

Materials

Agricultural water Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing Wilmar BN-CVT1005  1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge  Lumiere Diagnostics 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth Chesapeake Wiper & Supply, Inc. CC90 Grade #90, 44 × 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach Various Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate Mallinckrodt Baker Inc 8100-04
Manifold Built in-house Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump Micron Meters RPP1300 Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette Various Disposable, 10ml
Universal preenrichment broth Difco 223510
Buffered peptone water Difco 218105
Salmonella supplement Biomérieux Industry 42650 http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth Biomérieux Industry 410848 http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin Sigma-Aldrich 861987 http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid Various Drummond DP-110 used here
Shaking incubator Various Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette  Various 10 μl, 1 ml
Micropipette tips Various Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase- free
Probe sonicator Q Sonica LLC XL-2000 series
µPADs Avant  Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] Sigma-Aldrich H3375
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) Sigma-Aldrich B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)  Sigma-Aldrich 53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)  Sigma-Aldrich 38896
Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm Various Sterile
Flat bed scanner Various Xerox USB scanner
ImageJ software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/

References

  1. . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
  4. McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
  5. . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
  6. Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
  9. Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
  10. Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
  11. Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
  12. Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
  13. Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).

Play Video

Cite This Article
Bisha, B., Adkins, J. A., Jokerst, J. C., Chandler, J. C., Pérez-Méndez, A., Coleman, S. M., Sbodio, A. O., Suslow, T. V., Danyluk, M. D., Henry, C. S., Goodridge, L. D. Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water. J. Vis. Exp. (88), e51414, doi:10.3791/51414 (2014).

View Video