Kolorimetrisk Pappersbaserade Upptäckt av<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonella</em> Spp.., Och<em> Listeria monocytogenes</em> Från stora volymer av jordbruks Vatten
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Detta protokoll beskriver en snabb kolorimetrisk upptäckt av Escherichia coli, Salmonella spp.., Och Listeria monocytogenes från stora volymer (10 L) av jordbruks vatten. Här är vattnet filtreras genom steril Modifierade Moore Svabbproverna (MMS), vilka består av en enkel gasväv filter innesluten i en plastampull, att koncentrera bakterier. Efter filtrering, är icke-selektiva eller selektiva anrikningsgrad för målbakterien utförs i MMS. För kolorimetrisk detektion av mål-bakterierna är de anrik analyseras sedan med hjälp av pappersbaserade analytiska enheter (μPADs) inbäddade med bakterie vägledande underlag. Varje substrat reagerar med mål-vägledande bakteriella enzymer, generera färgade produkter som kan detekteras visuellt (kvalitativ detektion) på μPAD. Alternativt kan digitala bilder av de reagerade μPADs genereras med vanlig skanning eller fotografiska apparater och analyserades med ImageJ programvara, aljande för mer objektiv och standardiserad tolkning av resultat. Även om de biokemiska procedurer är utformade för att identifiera de ovannämnda bakteriella patogener, i vissa fall enzymer som produceras av bakgrundsfloran eller nedbrytningen av de kolorimetriska substrat kan ge ett falskt positivt. Därför behövs en bekräftelse med hjälp av en mer diskriminerande diagnostik. Ändå är denna bakteriekoncentration och upptäckt plattform billigt, känsligt (0,1 CFU / ml detektionsgränsen), lätt att utföra, och snabb (koncentration, anrikning, och detektion utförs inom cirka 24 timmar), motiverar dess användning som ett första screeningmetod för den mikrobiologiska kvaliteten på jordbruks vatten.
Introduction
Det är viktigt att agenter livsmedelsburna sjukdomen upptäcks snabbt och helst i fältbaserade inställningar för att minska bördan av livsmedelsburna sjukdomar. Gemensamma strategier för att upptäcka livsmedelsburna bakteriella patogener inkluderar biokemiska profilering, selektiv och differentierad odling, immunologisk isolering och detektion, och molekylär detektion. Men dessa metoder hindras av sporadisk kontamination, små provvolymer testade, de ofta låga koncentrationer av de livsmedelsburna sjukdomsframkallande bakterier, kräver långa handläggningstider, och / eller inte är tillämpliga för lokala inställningar. Vidare föreningar i många livsmedelsmatriser är hämmande för upptäckt och diagnostiska tillämpningar. För att förbättra sannolikheten för mikrobiell upptäckt, har den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration föreslog att testa jordbruks vatten (t.ex. tvättvatten och bevattningsvatten) som antingen kommer i kontakt med en stor yta av färskvaror eller fungerar som ett fordon för produce föroreningar är ett lönsamt alternativ till direkt testning av livsmedel 1. Trots detta gör provberedningsmetoder för patogen koncentration viktigt det ofta låg naturlig patogen-belastning i kombination med utspädningseffekten av den representativa jordbruks vattenprov. En sådan metod skulle kräva provtagning stora mängder vatten (≥ 10 L), adekvat patogen-koncentration, och kompatibilitet med efterföljande strategier upptäckt.
Modifierade Moore kloak (MMS) är billiga, enkla och robusta enheter som används för att koncentrera bakterier från stora volymer (≥ 10 L) vatten 2-4. MMS består av en plastkassett fylld med gasbinda, som fungerar som ett grovfilter för stora mängder vatten som pumpas genom kassetten med hjälp av en peristaltisk pump. MMS är ett icke-diskriminerande sätt för bakteriekoncentration (≥ 10 gånger koncentration) som fångar organiskt och oorganiskt partikulärt material inklusive mikroorganismer i bearbetad liquid prover. Det är troligt att den utmärkta effekten av koncentrationen av målmikroorganismer från MMS kan förklaras av det faktum att mikroorganismer förväntas vara fäst vid silt-lera fraktion eller organiska mikroaggregaten i det suspenderade fasta materialet 3. Den robusta designen av MMS gör för att övervinna de flesta brister i samband med andra filtreringsmetoder för avskiljning och koncentration av bakterier från vatten, såsom igensättning av filter, oförmåga att hantera stora volymer, filterprov med hög grumlighet, och höga kostnader. Av dessa skäl är FDA rekommenderar att MMS införlivas i officiella förfaranden för miljö och producera relaterade provtagningsförfaranden 5.
Här beskrivs en metod för koncentrationen, anrikning, och upptäckt av Escherichia coli, Salmonella spp.., Och Listeria monocytogenes från jordbruket vatten. En MMS används för koncentration av bactEria, och även fungerar som en behållare för selektiv eller icke-selektiv bakterie anrikning. Bakteriell detektion uppnås biokemiskt använda pappersbaserade analytiska enheter (μPADs) 6. μPADs kan tillverkas som fluidic nät eller fläckprov med hjälp av olika metoder inklusive fotolitografi, bläckstråleutskrift, prägling, och vax printing 7-11. Exempel på fluidiska konstruktioner kan vara dendritiska kanalmönster där provet deponeras i centrum och därefter strömmar till distala reservoarer eller enstaka kanalmönster där provet eller substrat dras från de yttre reservoarer av kanalen genom kapillärkraften in i centrum 12. För detta protokoll, har vi valt att använda för 7 mm tjocka vax-papper spot arrayer inbäddade med kromogena substrat som kan bearbetas av enzymer som indikerar de testade här mikroorganismerna: klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG) och 5 – brom-4-klor-3-indolyl-β-D-glukuronid (X-Gluc)för detektion av β-galaktosidas och β-glukuronidas som produceras av E. coli; 5-brom-6-klor-3-indolyl kaprylat (magenta kaprylat) för detektion av C8-esteras produceras av Salmonella spp..; och 5-brom-4-klor-3-indolyl-myo-inositol-fosfat (X-InP) för detektering av fosfatidylinositol-specifikt fosfolipas C (PI-PLC) som produceras av L. monocytogenes 6. Således kan konstateras att förekomsten av en viss bakterie visuellt utan behov av komplicerad utrustning eller tolkning av data. Den specificitet och sensitivitet av enzymet baserade kolorimetrisk μPAD detektion av dessa specifika mål bakterier har tidigare undersökt 6. Dessutom var känsligheten hos den integrerade metoden för dessa målbakterier koncentration-detektion utvärderas genom spetsning av stora volymer vatten med förutbestämda nivåer av mikroorganismer (opublicerade data och Bisha et al. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en integrerad metod för att detektera E. coli, Salmonella spp.., och L. monocytogenes i jordbruks vatten. Här, MMS koncentration av bakterier från stora volymer (10 L) av jordbruks vatten, kopplas med bakterie anrikning, och bakterie vägledande kolorimetrisk upptäckt med hjälp μPADs. MMS Förfarandet kan klara av hög partikelhalt i vattenproverna samtidigt koncentrera bakterier 10 gånger, är robust och enkel nog för fältapplikationer med minimalt utbildad personal,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
