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Medicine

Technik der Subnormothermic Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51419
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 1,2
1Multi Organ Transplant Program, Toronto General Hospital, 2Department of Surgery, Toronto General Hospital, 3Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Rand Transplantate, wie Fettleber, Transplantate von älteren Spendern oder Lebern nach Herztod (DCD) abgerufen tolerieren herkömmlichen, Kälte statische Speicher nur schlecht. Wir entwickelten ein neuartiges Modell der subnormothermic ex vivo Perfusion der Leber für die Erhaltung, Bewertung und Instandsetzung von Randlebertransplantationen vor der Transplantation.

Abstract

Der Erfolg der Lebertransplantation hat in einem dramatischen Organmangel geführt. In den meisten Regionen Transplantation 20-30% der Patienten auf der Warteliste für eine Lebertransplantation sterben, ohne eine Organtransplantation oder für den Krankheitsverlauf ausgelistet. Eine Strategie, um den Spenderpool zu erhöhen, ist der Einsatz von Grenz Transplantate, wie Fettleber, Transplantate von älteren Spendern oder Spende nach Herztod (DCD). Die aktuelle Konservierungstechnik von Kalt statische Speicher nur schlecht durch marginale Leber was zu erheblichen Organschäden toleriert. Darüber hinaus bedeutet kalt statischen Speicherorgan nicht erlauben Transplantat Bewertung oder Reparatur vor der Transplantation.

Diese Mängel der kalten statischen Erhaltung haben ein Interesse an warmen bluteten Organkonservierung ausgelöst, um kalte ischämische Verletzungen zu reduzieren, zu bewerten Lebertransplantate während der Konservierung, und erkunden Sie die Möglichkeit, Rand Lebern vor der Transplantation zu reparieren. Die optimalen presund Durchflussbedingungen die Perfusion Temperatur, Zusammensetzung der Perfusionslösung und die Notwendigkeit für einen Sauerstoffträger ist umstritten in der Vergangenheit.

Trotz der vielversprechenden Ergebnisse in mehreren Tierstudien haben die Komplexität und die Kosten eine breitere klinische Anwendung bisher verhindert. Kürzlich mit verbesserter Technologie und ein besseres Verständnis der Physiologie der Leber während der ex vivo Perfusion der Ausgang des warmen Leberperfusion wurde verbessert und durchweg gute Ergebnisse erzielt werden können.

Dieses Papier wird Informationen über Leber-Retrieval, Speichertechniken und isolierte Leberperfusion bei Schweinen. Wir veranschaulichen a) die Anforderungen, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des Organs zu gewährleisten, b) technische Überlegungen zur Perfusion Maschine und der Perfusionslösung und c) biochemischen Aspekte des isolierten Organen.

Introduction

Lebertransplantation ist die einzige Behandlungsoption für Patienten mit terminaler Lebererkrankungen oder fortgeschrittenem Leberzellkarzinom. In den letzten 25 Jahren hat sich die Anzahl der Warteliste Kandidaten nach und nach erhöht und überstieg die Zahl der verfügbaren Transplantate. Die Zahl der Herzschlag Spender hat sich in den letzten zehn Jahren zurückgegangen. Zur gleichen Zeit haben die Nummern der Rand Transplantate, wie Spende nach Herztod (DCD), sowie alte und Fettlebern 1,2 erhöht.

Rand Transplantate werden häufig für eine Lebertransplantation aufgrund der höheren Wahrscheinlichkeit von Primärimplantat nicht oder verzögerte Funktion zurück. In DCD Transplantate, ist ein besonderes Anliegen der Entwicklung von ischämischen Typ biliäre Strikturen (ITBS). Mit der herkömmlichen statischen kalten Konservierungstechnik, treten bei etwa 10-40% der DCD Transplantate ITBS. In der Mehrzahl der Patienten führt ITBS neu Transplantation oder Tod des Patienten. Vor allem längere warme und kalte ischämische Zeiten sind RisikoFaktoren für ITBS 3-7. Spenderalter, genetische Prädispositionen (wie CCR5 Delta 32), und die Wahl der Konservierungslösung wurden ebenfalls diskutiert, als zusätzliche Risikofaktoren 7-10. Teil Mikrothromben der peribiliären Schiffe wurde als möglicher Mechanismus für ITBS nach Lebertransplantation mit DCD Transplantate 11 vorgeschlagen worden.

Vor der klinischen Einführung der Lebertransplantation, Leber Perfusionen ex vivo verwendet worden, um den Leberstoffwechsel und Physiologie 12,13 studieren. Nach Lebertransplantation fand seinen Weg in der klinischen Einstellung in den 1960er Jahren wurden unzählige Versuche unternommen worden, ex vivo Perfusion der Leber als Konservierungsverfahren durch die Nachahmung von physiologischen Ernährung und Sauerstoffversorgung Bedingungen. Sein Nutzen für die Erhaltung der Grenz Transplantate hat in den letzten zehn Jahren untersucht worden, aber es hat nicht zu erreichen Standard der klinischen Versorgung. Wir haben vor kurzem beschrieben eine Reduktion der Gallengang Verletzungen in DCD Lebertransplantation durch ex vivo perfundierten Erhaltung 14. Verschiedene Ansätze zur Perfusionslösung wurden. Die Auswahl reicht von Mobillösungen wie Vollblut aus dem Spendertier oder gepackte rote Zellen in Kombination mit Humanplasma zu azellulären Ansätze wie Maschinen University of Wisconsin-Lösung, IGL Lösung oder Steen Lösung 14-19.

Die Temperatur liegt im Bereich von 4-37ºC 20. Die Nomenklatur in Hypothermie, subnormothermic und normotherme ist sehr variabel und inkonsistent. Alle verschiedenen Techniken, Lösungen und Temperatureinstellungen zielen auf 1) stabil Perfusionsbedingungen, 2) eine ausreichende Sauerstoffversorgung, und 3) Wiederherstellung der Organfunktion. Eine verbesserte Erhaltung Kapazität sowie die Fähigkeit der Orgel Beurteilung und Behandlung während normotherme und subnormothermic Perfusion Gesichter höhere technische Komplexität und Kosten im Vergleich zu hypothermen Perfusion 20,21.

Wir haben eine subnormothermic ex vivo Perfusion Leber-System in den letzten 4 Jahren entwickelt. Das System kann bis 1) verwendet "wieder aufzuladen", den hepatischen Energiegehalt werden, 2) die Qualität des Transplantats zu bewerten und zu 3) reparieren marginalen Lebern vor der Transplantation. Das folgende Protokoll enthält alle Informationen für eine stabile Leberdurchblutung.

Protocol

Eine schematische Übersicht über das Protokoll ist in 1 dargestellt.

Figur 1
Abbildung 1. Studienprotokoll. Schweinestudiendesign von Leberschäden ist auf eine Spende nach Herztod (DCD)-Modell. Nach der Sektion aller Lebergefäße, ist Herztod induziert durch 45 min warmer Ischämie gefolgt Transplantat. Um ein Pfropf Transport zwischen den Donor-und Empfänger Krankenhäusern in einer klinischen Umgebung zu simulieren, wird das Transplantat auf Eis für 4 Stunden nach dem Kalt, Zwei-Mengen gespeichert. Nach kalte Lagerung, ist das Organ subnormothermic perfundierten für 6 Stunden, um die Durchblutung Stabilität zu beurteilen. In einem Transplantationsmodell konnte die Durchblutung Zeit, um die Energiespeicher wieder aufzuladen und die Organe lebensfähig zu bewerten kürzer sein. Bitte klicken erwieder um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Tiere

HINWEIS: Männlich Yorkshire Schweine, 30-35 kg, wurden für diese Studie verwendet. Alle Tiere erhielten humane Pflege in Übereinstimmung mit den 'Grundlagen der Versuchstierpflege "" von der Nationalen Gesellschaft für Medizinische Forschung und dem' Leitfaden für die Pflege von Labortieren '' von den National Institutes of Health formuliert. Das Animal Care Committee der Toronto General Research Institute stimmten allen Studien.

2. Organentnahme

  1. Haus männlichen Yorkshire Schweine in Forschungseinrichtungen für 1 Woche vor Perfusion / Transplantation das Niveau von Stress zu reduzieren und um die Tiere zu den Wohnbedingungen zu gewöhnen. Weniger als 2 Tage von Wohnungen in der Anlage zu einer Stress-induzierten physikalische Reaktion, die die Durchblutung des Ergebnisses 22,23 verändern kann führen.
  2. Betäuben Schweinedurch eine intramuskuläre (im) Injektion einer Mischung aus Ketamin (25 mg / kg), Atropin (0,04 mg / kg) und Midazolam (0,15 mg / kg).
  3. Vor der Intubation sicher das Schwein spontan atmet 2 l O 2 mit 5% Isofluran verabreicht. Sprühen Sie die Stimmbänder mit 2% Lidocain 2 min vor der Intubation zu Stimmbandkrämpfe zu vermeiden. Beispielsweise für einen 35 kg Schweine mit einem 6,5 fr. Trachealtubus. Sperrung der Trachealtubus mit 3-5 ml Raumluft.
  4. Nach der Intubation Kapnometrie verwenden, um die korrekte Intubation bestätigen. Senken Sie die Isofluran-Gas bis 2%. Stellen Sie den Ventilator auf 14-16 Atemzüge / min und einem Atemvolumen von 10 ml / kg Körpergewicht.
  5. Legen Sie eine 20 G intravenöse (iv) Katheter nach einem der Ohrvenen Infusion von Ringer-Laktat-Lösung (200 ml pro Stunde) zu ermöglichen. Dann reiben Sie das Schwein und bedecken Sie es mit sterilen Tüchern.
  6. Machen Sie eine Mittellinienschnitt, gefolgt von einer linken seitlichen Erweiterung. Verwenden Sie ein Handtuch, um große und kleine Darm decken und verschieben Sie sie auf der linken Seite.
  7. Separate InFElegene Hohlvene (IVC) und die distale Aorta voneinander; Ligat Aorta verzweigt in den Rücken; isolieren und kostenlos Nierenarterien von anhaftendem Gewebe.
  8. Teilen Sie die falciforme Band und den dreieckigen Ligament mit Kauter.
  9. Lassen Sie die Pfortader durch einen Einschnitt des Bauchfells zwischen Pankreas und Pfortader. Abbinden Venen aus der Bauchspeicheldrüse in die Pfortader.
  10. Präparieren Sie die Zöliakie-Stamm unter der Pfortader und folgen ihm nach hinten, um die Aorta. Umgeben die A. mesenterica mit einem 2-0 Krawatte; umgeben die Milz und die linke Magenarterien, die Niederlassung nach hinten auf die Zöliakie-Stamm. Präparieren Sie die Zöliakie-Stamm aus der Pfortader.
  11. Ligieren die Lymphgefäße im Ligamentum hepatoduodenale lymphatischen Auslaufen zu verhindern. Teilen Sie die richtige Magenarterie zwischen Krawatten. Ligieren kleineren Adern. Trennen Sie den Gallengang von der Band und teilen sie distal nach Ligation.
  12. Präparieren Sie die Aorta hinter der Membran zwischen Herz und Zöliakie trunk; legen Sie eine Krawatte um 2-0 der Aorta.
  13. Lassen Sie die Leber aus dem unteren Cava auf der rechten Seite mit Elektrokauter; mit einer Schere für den oberen Teil zwischen Sekt und Leber.
  14. Entfernen der Gallenblase und der Gallenblase aus kauterisieren Bluter Bett.
  15. Iv verabreichen 1.000 IE / kg Spendergewicht von Heparin. Für eine DCD-Modell, Herzstillstand herbei durch intra Injektion von 40 mval KCl 3 Minuten nach Heparingabe. Set Herzstillstand als Ausgangspunkt der warmen Ischämie.
  16. Für die Durchblutung, sammeln 1,6 l Schweineblut in CPDA Beutel (Citrat, Phosphat, Dextrose, Adenosin) unmittelbar nach Herztod. Führen Sie einen Soft-Spin (2.000 × g ohne Bremse). Entfernen Sie das Plasma und die Buffy-Coat unter sterilen Bedingungen (Biosicherheitswerkbank Klasse II) und speichern die Erythrozyten in CPDA Taschen für die Transfusion.
  17. Kanülieren Pfortader und Aorta mit Orgel bündig Linien. Binden Sie die zuvor eingestellte Krawatten um Oberschenkel, Nieren, Milz, mesenterialen und linken Magen-Kunstdeckungen sowie der oberen Aorta. Für einen Herzschlag Spender (HBD) Modell, führen Sie die Kanülierung der Aorta und Pfortader unter Herz schlagen Bedingungen.
  18. Nach 45 min warme Ischämie, spülen Sie die Leber mit der University of Wisconsin (UW)-Lösung mit Dual-Perfusion über Aorta (Drucksack) und Pfortader (Schwerkraft angetrieben).
  19. Schneiden Sie die Leber aus dem Schwein, lange verlassen alle verbleibenden Schiffe.
  20. Während der Rück Tabelle Vorbereitung, klemmen die oberen IVC mit einem Satinsky klemmen und spülen der Leber ein zweites Mal mit etwa 0,5 l UW-Lösung retrograd über niedrigere IVC, bis die Pfortader Abfluss ist klar.
  21. Binden Sie alle Arterienäste aus der Aorta und Truncus. Führen Sie einen arteriellen Druck zurück-Tabelle Perfusion mit etwa 0,5 l UW-Lösung.
  22. Spülen Sie den Gallengang mit UW-Lösung.
  23. Kanülieren die oberen und unteren Teile des IVC mit 2.1 "x 8.3" Minderer mit Luer-Lock; kanülieren die Pfortader und Leberarterie mit 8.3 "; x 4.1 "und 4.1" x 8.3 "Minderer mit Luer-Lock. Verwenden Sie die obere und untere Hohlvene als venöse Drainage.
  24. Legen Sie die Leber in einem Organ Tasche, schließen Sie die Orgel Tasche, und speichern Sie die Leber auf Eis, bis die Durchblutung hat begonnen.

3. Ex-vivo-Perfusion Leber

  1. Bereiten Sie die Perfusionslösung mit 2000 ml Steen Lösung gewaschen, 400 ml Erythrozyten, 550 mg Natriumpyruvat, Aminosäuren 100 ml Säurelösung (10% Travasol), 10 mg Calcium-Gluconat, 1.000 IE schnell wirkenden Insulin, 1 g Cefazolin, 500 mg Metronidazol, und 10.000 IE Heparin. Andere Moleküle für die Gefäßerweiterung, Immunsuppression, Abfangen von reaktiven Sauerstoffspezies oder Leberzell-Therapie bezogen auf den jeweiligen Studienprotokoll.
  2. Für die Dialyse-Komponente, verwenden Standard-Dialysat, das 3,5 mM Kalium, 25 mM Natriumbicarbonat, 27 mM Glucose, sowie 275 mg / l Pyruvat.
  3. Einrichten der Perfusionskreislauf (Schema siehe Abbildung 2).
    Figur 2
    Abbildung 2. Stromkreis einrichten. Aus dem Hauptreservoir als Ausgangspunkt und Ende wird die Perfusionslösung mit einer Kreiselpumpe durch einen Oxygenator angetrieben. Gleich nach Oxygenierung der Lösung teilt sich die Schaltung in einem kleineren Linie, um einen Dialysator Einheit für Elektrolyt-Homöostase und einer größeren Leitung zu einer Leukozyten-Filter zur Reduktion der Rest der weißen Blutzellen (WBC) läuft. Die Lösung, die durch den Dialysator führt zurück zum Hauptbehälter. Nach der Leukozyten-Filter, teilt die Schaltung wieder in 2 gleiche Zeilen. Eine Linie verläuft bei hohem Druck (ca. 60 mmHg) direkt in die Aorta, um die Leberarterie durchströmen. Die andere Linie läuft in einem zweiten Behälter. Aus diesem Reservoir der Pfortader perfundiert. Der Druck des Portals Perfusion hängt von der Höhe der Energiepegel der Lösung des Reservoirs (etwa 2-6 mm Hg). Alle Flüssigkeiten sind drüber die Infrastruktur und überLeberVenen zurück in das Hauptreservoir ained. Für Schwerkraftreduzierung und homogene Perfusion wird die Leber in einem Pool mit Wassertemperatur geregelt gefüllt war. Es ist aus dem Wasser durch eine undurchlässige Membran getrennt, und es in einer Perfusion Suspension schwimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
    1. Sammeln Sie alle Flüssigkeiten aus dem Kreislauf in einem 3 L Behälter (Hauptbehälter) und klemmen den Abfluss.
    2. Verbinden der Abfluss zu einer Kreiselpumpe, gefolgt von einer kommerziellen Oxygenator.
    3. Hinter dem Oxygenator, aufgeteilt den Schlauch in 2 Zeilen. Schließen Sie eine Leitung an einem Dialysegerät und lassen sie zurück in das Hauptreservoir. Schließen Sie die zweite Linie zu einer Reduktion der Leukozyten-Filter.
    4. Split die Linie nach der Leukozytenreduktion Filter in einer arteriellen Linie, die Durchblutung Lösung der Leberarterie versorgt, und ein Portal vgene Linie liefern Perfusionslösung zu einem zweiten Reservoir, das in die Pfortader durch die Schwerkraft Abfluss entwässert. Spannen Sie den Zustrom Portal.
    5. Schließen Sie den arteriellen Linie zu einer Hohlvene Linie Entwässerung in das Hauptreservoir für die Fluid Erinnerung.
    6. Zum Sammeln der Aszites oder Leckage der Perfusionslösung aus der Leber, bereiten eine Saugleitung zu dem Hauptspeicher verbunden.
  4. Lassen Sie den Abfluss Klemme von dem Hauptbehälter und füllen Sie die Schaltung mit der Perfusionslösung. Starten Sie die Kreiselpumpe bei 1.500 U / min. Die Perfusion Lösung wird durch die arterielle Leitung in die Hohlvene line zurück in das Hauptreservoir zu fahren. Stellen Sie sicher, dass alle Luft aus der Schaltung angetrieben.
  5. Schalten Sie die Gaszufuhr zu dem Oxygenator.
  6. Nehmen Sie die Leber aus dem Eis. Spülen, die UW-Lösung mit Kochsalzlösung.
  7. Platzieren der Leber, mit ihrer konvexen Seite nach unten, um den Zugriff zu den Behältern zu erleichtern, idealerweise in einer schwerelosen Umgebung zu vermeiden,Organ Kompression an der Kontaktfläche. Verwenden Sie eine Wärme und kühlbaren Wasserbad. Stellen Sie die Starttemperatur der Schaltung und Wasserbad auf 20 ° C. Decken Sie die Wasser-Bad mit einer undurchlässigen Membran und setzen Sie die Leber auf dieser Membran. Reduzieren Sie die Schwerkraft angetrieben Kompression durch Eintauchen der Leber mit Perfusion Lösung.
  8. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit der Kreiselpumpe zu 1.000 U / min und legen Sie zwei Klammern an der Verbindung der arteriellen und Hohlvene Linien. Dann schneiden Sie den Schlauch zwischen den Klemmen. Mit einem 3-Wege-Stecker, verbinden beide Cava Abflüsse und verbinden Sie diese mit der Vena Cava Linie.
  9. Lösen Sie die Klemme von der arteriellen Linie, gießen Perfusionslösung in die arterielle Kanüle in der Luftblasen zu entfernen, und schließen Sie die Zeile mit der Kanüle. Erhöhen Sie die Kreiselpumpe zu 1.500 U / min. Lassen Sie die zweite Klemme von der Hohlvene Linie.
  10. Lösen Sie die Klemme von der Pfortader-Reservoir, um sie zu füllen. Lassen Perfusionslösung in das Portal Cannu gießenla und anschließen. Besondere Vorsicht stabiler Flüssigkeitsspiegel im Reservoir-Portal.
  11. Verbinden Druckleitungen zu den Luer Locks der arteriellen, portal, und Hohlvene Kanülen.
  12. Physiologischen Bedingungen zu imitieren, gelten Behandlungen in die richtige Schiff. Injizieren Glukose in die Pfortader und nicht in die arterielle Linie, um einen Farbverlauf imitiert eine erhöhte Pfortader-Glukose Gradienten und Induktion Glykogensynthese 24,25 etablieren.
  13. Nach dem Anschluss der Leber an der Rennstrecke und erhöhen die Temperatur auf 33 ° C innerhalb von 60 min.
  14. Ziel für eine arterielle Startstrom bei etwa 250 ml / min bei 40 mmHg. Dies kann 700 ml / min während der Perfusion zu erreichen, sobald der Druck auf 70 mmHg erhöht.
  15. Am Starttemperatur, Ziel für einen Pfortaderflusses von 500-600 ml / min bei 3-5 mmHg. Nach Erhöhung der Temperatur, die Überwachung der Pfortader-Flow, der bis 1100 ml / min bei 4-6 mmHg erhöhen wird bis. Nicht zu überschreiten Portal Druck über PhysiologicaL-Werte (etwa 8 mmHg), um sinusförmige Fensteranordnungen 26 zu schützen. Vermeiden Gesamtdurchfluss von mehr als über 2000 ml / min, um eine Beschädigung des Organs zu verhindern. Stellen Sie den Abfluss bis -2 mmHg durch Absenken der Hauptreservoir zu Leberüberlastung durch funktionelle Obstruktion zu verhindern.
  16. Hinzufügen des Dialyse Komponente an die Schaltung, um die Perfusionslösung auf vorbestimmte Werte 27 äquilibrieren. Stellen Sie die Dialysatfluss bis 500 ml / h. Besondere Aufmerksamkeit auf die Dialyse Abfluss einstellen, so dass die Durchblutung Lösung wird weder verdünnt noch konzentriert. Innerhalb der ersten Stunde der Durchblutung das Hauptreservoir muss sorgfältig beobachtet werden!
  17. Eine homogene Sauerstoffversorgung des Gewebes unter Verwendung einer Hauptkomponentengasgemisch von O 2 (95-98%) und CO 2 (2-5%) wiederherzustellen und zu erhalten Organfunktion. Verwenden variablen Gas während der Perfusion, da die Leber ändert seinen Stoffwechsel und sein pH-Nachfrage während der Perfusion.
  18. Halten Sie einen niedrigen pH-Wert während des Beginns derPerfusion, um das Organ zu schützen, die das Paradox pH Konzept 28 und vermeiden Sie schwere Gewebeschäden, die von schnellen Verbindungen nach physiologischen pH-Wert unter Reoxygenierung führen kann, da nach der Lagerung in UW-Lösung, hat die Orgel eine azidotische pH-Wert unter 7. Stellen Sie den Partialdruck von CO 2 kontinuierlich bis auf 25-30 mm Hg, so daß der pH-Wert eines physiologischen Niveau innerhalb von 1 h zu erreichen.
  19. Hinzufügen Natrium oder Kaliumbicarbonat zu der Schaltung, um eine physiologische Konzentration von Standard-Bicarbonat in der Perfusionslösung zu erzielen. Spritzen sie vorsichtig unter sich wiederholenden Blutgas und Elektrolytkontrolle.
  20. Überwachen Sie die Durchblutung durch periodische venöse und arterielle Blutgasanalysen und AST. Die venöse PO 2 bleibt über 175 mmHg während der Perfusion. Überwachen Gefäßstrom und Druck, und beachten Sie eine stabile Durchblutung durch einen konstanten Gefäßwiderstand.
  21. Halten Sie die Perfusion System für bis zu 8 Stunden stabil. Am Ende der Ex-vivo-Perfusion Zeitraum, coolauf der Perfusion System auf 20 ° C und nach dem Trennen Schlauch der Schaltung aus der Leber, spülen Sie die Perfusionslösung die Leber dual mit eiskaltem UW-Lösung. Bewahren Sie die Leber wieder auf Eis in einem sterilen Beutel gelegt Orgel.

Representative Results

Nachfolgend werden die Ergebnisse von 5 Versuchen mit Perfusion DCD-Transplantate nach 45 min Erwärmung und 4 Stunden einer kalten Ischämie vor Beginn des subnormothermic ex vivo Perfusion.

Das Hauptziel für eine ex vivo Leberperfusion ist, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des Organs sicherzustellen. Ischämie verursacht Vasokonstriktion, wodurch die Perfusion Beständigkeit. Erreichen konstanter Gefäßströme mit stabilen Druck ist ein guter Indikator für eine ausreichende Sauerstoffversorgung. Bei einer Induktionszeit von 1-2 Stunden die Perfusionslösung und das Organ sind bis zu 33 ° C, die den Gefäßwiderstand der Leber versterben erwärmt. Sobald die Zieltemperatur von 33 ° C erreicht wird, Level-Flusswerte bei einer konstanten, nahezu physiologischen Bereich für den Rest der Zeit 6 Stunden Perfusion (3A-3D).

Zur gleichen Zeit wird das Organ metabolisch aktiv. 4A zeigt den venösen pO <sub> 2, ein Marker des Sauerstoffverbrauchs. Innerhalb der ersten 2 Stunden der venösen pO 2 Rückgänge zu einem konstanten Plateau. An dieser metabolisch aktiven Zustand, der Leber beginnt mit der Produktion Galle (4B). Der Dialysator bietet eine ausgewogene Elektrolyt-Homöostase (4C-4D). Eine erste Hyperkaliämie schnell nivelliert. Online AST-Messung dient als Kontrolle der Leberzellschäden. Abbildung 5 zeigt nur eine flache lineare AST Anstieg über den gesamten Zeitraum Perfusion. H & E-Färbung nach 6 Stunden der Perfusion zeigt hepatischer Nekrose <5% mit einer intakten lobulären und sinusförmige Struktur (6). PAS-Färbung gleichzeitig Punkt zeigt wieder aufgefüllt zelluläre Glykogen-Speicher im Vergleich zu erschöpft Lagerung in kaltem erhalten DCD-Transplantate (Abbildung 7).

Figur 3
Abbildung 3. Perfusion Ströme und Druck (n = 5, Fehlerbalken zeigen Standardabweichung). (A, B) Leberarterie (HA) Durchfluss und Druck: Während der Erwärmungsphase in den ersten 1-2 Stunden, wird der Fluß erhöht bei stabilem Druck und danach konstant. Mit Blick auf die Abnahme der Pfortader (C), kann die Erhöhung der HA-Strömung in Richtung zum Ende der Perfusion eine autoregulatorische Reaktion der Leber. (C, D) in der Pfortader (PV) Strom steigt entsprechend dem HA Fluss während Die ersten 2 h Erwärmung. Die Drücke relativ stabil bleiben.

Figur 4
Abbildung 4. Überwachungsparameter (n = 5, Fehlerbalken zeigen Standardabweichung). (A) Die venöse pO 2 als Marker der Sauerstoffbedarf und die metabolische Aktivität in der Anfangsphase der Erwärmung abnimmt aufgrund aktiviert cellular Stoffwechsel; es bleibt danach stabil (B) Galleproduktion als Marker der metabolischen Aktivität beginnt bei Temperaturen um 30 ° C und damit zwischen der ersten und zweiten Stunde Perfusion (C, D) Der Dialysator sichert Elektrolyt-Homöostase.. eine erste Hyperkaliämie ist schnell ausgeglichen.

Figur 5
Abbildung 5. AST (n = 5, Fehlerbalken zeigen Standardabweichung) AST ist ein sensibler Marker für Leberzellschädigung. der flache Anstieg deutet darauf hin, keine signifikante Verletzungen während Ex-vivo-Perfusion.

Figur 6
Abbildung 6. H & E-Färbung (20-facher Vergrößerung). (A) Sham Leberprobe vor warme Ischämie, einem Vertreter Leberläppchens mit intakten architecture. (B) Leberprobe nach 45 min warmer Ischämie, 4 h kalt Ischämie und 6 h subnormothermic Perfusion intakt ohne Nekrose und nur minimale Zellschwellung der lobulären Architektur, die sinusförmigen Bereiche sind leicht im Vergleich zu den erweiterten Schein-Probe.

Discussion

In einem Schweinemodell, das DCD Lebertransplantation nachahmt, haben wir gezeigt, dass subnormothermic Leberperfusion mit einem zellulären Perfusionslösung zu stabilen Perfusionsparameter, minimale Leberzellschädigung und Leberstoffwechsel aktiv. Unsere subnormothermic Perfusion einzurichten hat sich ein Leberzell Homöostase und Stoffwechsel erholen. Glykogen-Speicher wiederhergestellt und Metaboliten werden verworfen.

Ex vivo Leberperfusion als Konservierungstechnik bietet erstmals die Möglichkeit, Markierungen von Transplantatfunktion und Schädigung während Organkonservierung und vor der Transplantation zu bewerten. Neben der makroskopischen Beurteilung der Transplantatdurchblutung Homogenität, Durchflusswerte bieten einen guten Indikator für die Lebensfähigkeit des Transplantats und das Ausmaß der ischämischen Verletzung es früher 29 erlitten hatte. Sauerstoffverbrauch und Galle Produktion sind Marker für metabolische Funktion. Leberenzymwerte wie AST kann als verwendet werdensess den Grad und die Dynamik der Leberzellschädigung 30. Diese gründliche Transplantat Beurteilung kann eine zuverlässige Unterscheidung zwischen transplantierbarer und nicht-transplantierbaren Rand Organe ermöglichen.

Wir wählten eine subnormothermic Temperatur von 33 ° C in unserem Perfusionssystem, da die Temperatur ausreichend ist, um den Stoffwechsel als auch ATP und Glykogen-Synthese zu ermöglichen. Gleichzeitig bietet sie eine verringerte Sauerstoffbedarf im Vergleich zur Normothermie Perfusion Einstellungen, die zusätzliche Sicherheit gegen ischämische Verletzungen bietet. Im allgemeinen Perfusion Temperaturen über 30 ° C haben sich als kalte ischämische Verletzung zu minimieren und eine ausreichende metabolische Aktivität 31.

Im Gegensatz zu anderen Gruppen, haben wir nicht genutzt Vollblut als Perfusat, aber ein normo-osmotischen Albuminlösung (Steen) mit gewaschen und filtriert roten Blutkörperchen. Unter Ausschluss der Plasmakomponenten sowie Thrombozyten und Leukozyten, die Perfusionslösung deunterzeichnet, um pro-inflammatorischen Signal während der Ex-vivo-Perfusion zu minimieren.

Neben dem Transplantat Bewertung, stabil Perfusionsbedingungen über mehrere Stunden ermöglichen Transplantat Behandlung. Zahlreiche Moleküle gezeigt, Reperfusionsverletzung unter experimentellen Bedingungen 32 zu dämpfen. Allerdings hat fast keine Behandlung Regime seinen Weg in die klinische Praxis, noch nicht. Ein Grund scheint der Mangel an Gelegenheit, diese Behandlungen während der kalten Lagerung anzuwenden. Eine stoffwechselaktiven Leber auf einer Ex-vivo-Perfusion System ist optimal für die Anwendung jeglicher Art von Behandlung. In diesem Zusammenhang nicht nur Behandlungen Reperfusion Bedingungen wie Dämpfung von Kupffer-Zell-Aktivität oder Abfangen von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu verbessern denkbar, sondern auch Anwendungen wie der Gentherapie, um das Transplantat, beispielsweise gegen Hepatitis C Rezidiv zu konditionieren. Andere mögliche Strategien könnten Ermäßigung auf Steatose während der Ex-vivo-Perfusion sindZeitraum 33.

Zusammenfassend ist die ex vivo Leberperfusion eine neue Strategie, um kalte ischämische Verletzung zu minimieren und die Randlebertransplantationen vor der Lebertransplantation zu bewerten. Die Ex-vivo-Perfusion Einstellung bietet die einmalige Gelegenheit, zu reparieren und Zustand Transplantate vor der Transplantation.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Studie wurde von Forschungsstipendien der Roche Organ Transplantation Research Foundation (ROTRF) und Astellas unterstützt. Markus Selzner wurde von einem ASTS Career Development Award unterstützt. Matthias Knaak wurde von der Astellas Forschungsstipendium unterstützt. Wir danken Uwe Mummenhoff und der Birmingham Familie für ihre großzügige Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
circuit Maquet (Hirrlingen, GER) custom made main reservoir (3 L, 3/8" outflow)
portal reservoir (1.5 L, 1/4", outflow)
centrifugal pump
oxygenator
lycocyte filter
Tubing (1/4" x 1/16") Raumedic (Helmbrechts, GER) MED7506
Tubing (3/8" x 3/32") Raumedic (Helmbrechts, GER) MED7536
Tubing connectors Raumedic (Helmbrechts, GER) various sizes
Dialysis filter, Optiflux F160NR Fresenius Medical Care (Waltham, MA) F160NR
STEEN solution XVIVO (Göteborg, SWE) 19004 2 L
Dialysis acid concentrate A Baxter (Mississauga, ON) D12188M 45 ml
Amino acid, Travasol 10% Baxter (Mississauga, ON) JB6760 100 ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P2256 1.1 g
Heparin Sandoz Canada Inc (Toronto, ON) 10750 40,000 iU
Calcium gluconate Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON) C31110 10 mg
Fast acting insulin various vendors 1,000 iU
Cefazoline various vendors 1 g
Metronidazole Baxter (Mississauga, ON) JB3401 500 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medizin Heft 90, Rand Transplantate DCD
Technik der Subnormothermic<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Leberperfusion für die Lagerung, Bewertung, Reparatur von Marginal Lebertransplantate
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Knaak, J. M., Spetzler, V. N.,… More

Knaak, J. M., Spetzler, V. N., Goldaracena, N., Louis, K. S., Selzner, N., Selzner, M. Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts. J. Vis. Exp. (90), e51419, doi:10.3791/51419 (2014).

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