Summary
该协议提供了一套便捷的方法，使极为快速，简便，无创，可靠，成本低，分子性别鉴定鸟类和它们的无创，快速，安全，易于辨认孵化后不久标记。仅限雏鸡的处理是必需的。的方法，这种方便的工具箱完全符合RRR-指引。
Abstract
许多实验需要及早确定后代的性别以及早期新生儿标记为个人的认可。根据动物福利指导方针，非侵入性技术，应首选（倘适用）。在我们的团队，我们工作在不同的曲种鸟类在实验室和现场，而我们成功地应用非侵入性的方法，以性别和单独标记小鸡。本文提出了一种综合性的非侵入性的工具盒。绝育鸟类之前第二性性状的表达需要DNA的轴承材料用于PCR的集合。我们通过提取来自口腔拭子DNA建立了一个快速简便的方法对任何年龄（孵化后）的性鸟类。结果可以在3小时内获得。对于个别标志着小鸡羽绒羽毛被修剪的具体模式允许孵化秩序内快速识别。这套方法是简单地适用于配备标准实验室和特别适合干活在该领域，因为没有专用设备克所需的采样和存储。处理雏鸡的最小化和标记和性别鉴定技术是无创性，从而支持动物福利指导方针的存款准备金率原则。
Introduction
个体识别，性别鉴定和基因分型是在各种实验研究的基本先决条件。获得的DNA轴承材料和标识对象明确（即使在早期的年龄）应该有生理，行为和生存的影响微乎其微。只要有可能，侵入性操作应根据存款准备金率原则1是可以避免的。
非侵入性的方法不仅有利于动物，但也可能会提高所获得的数据作为动物较少受到处理。
在鸟类中，DNA绝育可以对一些非侵入性地获得的材料如粪便2，羽毛3,4或口腔拭子3,5,9进行。无论拍摄对象的状况和年龄口腔拭子是禽流性别鉴定方法的选择，因为它们很容易进行，很少不和处理是短暂的。
到目前为止，从口腔拭子DNA用市售试剂盒3,6或耗时标准的DNA提取方案3,6-8中任一萃取。工具包不仅是相当昂贵的，但他们的协议可以并处挑战野外作业。一些程序细节， 如干燥和样品的培养，是不实际的领域。特别是在实验方案需要性取决于治疗从早在几分钟后的阴影的设定，有督促进行快速，非侵入性，可靠和容易的方法得到的结果。
在整个禽流类群相当工具箱标志着个人已经发展10。可用技术的广泛约占各种研究目标，物种和预算。然而，标志着小雏鸟已面临研究人员更多的挑战。在一些物种（ 如燕雀）雏鸟太小，适用腿带和需要替代方法，这不改变亲子行为。由于意识和改善动物福利和实地和实验室研究技术的兴趣不断增长，使用非侵入性技术被大力鼓励和首选。
该协议提供了一种非侵入性，快速，易于辨认和持久的方法运用腿带之前，单独标记非常年轻的雏鸟是可行的。此标记方法介绍了一个最重要的禽流感的实验室模型的物种，斑胸草雀（Taeniopygia弄蝶 ）11-13。该协议符合所有的个人标记技术对10先前公布的目标，并已经被成功地应用于14,15。
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Protocol
所有的程序均符合动物保护（TierSchG）德国法律执行。
试剂和消耗品的1。准备
- 准备在分子级水5％（W / W）CHELEX-100的解决方案。准备200μl，以标准的1.5毫升的反应管等分。由于CHELEX树脂沉淀快起停牌，有必要重新同质化的不断暂停等分试样的制备过程中。这是可取的制备50毫升或多个在一个批次中，并保持该悬浮液用磁力搅拌器均质化。该CHELEX溶液可保存几年在环境条件下。
- 切的Whatman滤纸片，其宽度比鸟要测试的喙宽度小。纸张的长度取决于该方法采取该示例：
- 使用镊子，将片应该足够长，以使样品收集而不被插入到鸟喙的钳子。作为粗略估计，为0.5厘米的长喙一张纸用1厘米的长度应该罚款。
- 如果不使用镊子，这块一定要长，但片的刚度还是应该让上皮细胞取样。
- 制备PCR预混物的一个等份对每个样品进行分析。对于PCR中的25的总体积微升的混合物含有0.18毫的dNTPs，2毫摩尔MgCl 2，70 mM的Tris-盐酸，17.25毫硫酸铵，0.1％吐温-20，0.32μMP2引物（TCTGCATCGCTAAATCCTTT），0.32μMP8底漆（CTCCCAAGGATGAGRAAYTG）16和2个单位的Taq聚合酶。自制Taq聚合酶17都可以使用。以允许另外的DNA的溶液的最大量的，6微升预混物可以制备并储存于-20℃下几个星期。
2，样品采集
戴手套是不是鸟类性别决定的PCR引物不能退火到人类的DNA是必不可少的。为其它基因分型的目的可能是可取的。
- 捕获感兴趣的鸟，轻轻地握在一只手如用'铃声的抓地力'18。请务必不要挤鸟。
- 持有一张Whatman滤纸用钳子和刷几次穿过颊，舌片和后鼻孔的内侧。一般样品少于30秒内获得的。
- 成年动物：根据种类的不同，可能很难拿到鸟来打开它的嘴。平时接触喙的侧面和应用温和的压力会奏效。
- 雏鸟：从刚孵化的雏鸟或采样是特别容易使用这种技术，因为他们的乞讨行为提供了方便地访问到嘴的内部。它甚至有可能得到的样品没有处理它们，因为它们很容易乞求例如 ，当他们的巢箱被打开。
- 紧随纸张存放在一个准备好的反应管里包含宁200微升的5％（W / W）CHELEX-100溶液。
如果您还打算/需要标记的小鸡，现在这样做是在第6节。
3，储存样本的DNA提取前
- 如果在实验室工作，店内样品于-20°C。如果这是不可能的或困难的（ 例如，在现场）店内样品在环境温度下。
- 样品可在温度范围从室温到-20℃下存放3年以上
4，DNA的提取
- 如果样品被冻结，解冻它在室温下。
- 确保纸是在浸没在CHELEX-100溶液的试管底部。
- 孵育样品15分钟，在56℃下
- 短暂涡旋后短暂离心管的内容。
- 孵育样品为8分钟，在100℃下
- 旋转样品以15,000 xg离心3分钟。
- 使用supernatant为后续的基因分型。
5。分子性别鉴定
- 准备一台PCR管，每样6微升预混料加为负（强制性）和阳性对照（可选）两个额外的管子。对于常规的性别决定包括从最后一次成功的绝育作为阳性对照样品。
- 从提取DNA加19微升上清到PCR预混物。确保从溶液的表面到吸管以避免CHELEX珠残留。这是至关重要的，因为CHELEX是阳离子交换，从而严重地抑制所有的酶促反应。
- 运行以下的PCR程序：培养在94℃，3分钟，每45个循环，30秒熔化工序94℃，接着是30秒的退火步骤，在55℃，接着在72℃45秒延伸步骤C.在最后的追关闭步骤中，反应在72℃下温育5分钟
- 准备一个2％的标准TBE或TAE琼胶本身凝胶来分离PCR产物。
- 运行适当的电压设置的琼脂糖凝胶。
- 可视化的乐队在紫外光下，拍摄一张照片。确保从始发女性样本中的两个频段是完全分离。
- 由一个（男）或两个（女）乐队的存在从女性样本区分男性。
6。标记雏鸟
- 检查巢刚孵出的小鸡按计划适当的品种/学习（ 如日常检查，在早晨被告知因为大多数小鸡孵化即可）。
- 剪下每个鸡的羽毛巢内的不同特征的位置。在斑胸草雀起伏塔夫茨增长跨越雏鸟的身体（ 图4A）四个特征和不同的领域。为每个小鸡切一个区域（ 图4B）。如果有在一个巢四个以上的小鸡，独特的4'发型'可以组合使用。
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Representative Results
口腔拭子可以用来提取DNA进行性别鉴定中的各种小鸟的
，加那利群岛（Serinus加那利岛 ），孟加拉雀（ 白腰文鸟芨 ），南丁格尔（ 红点megarhynchos），大山雀（ 大山雀 ）和黑鹂（ 鸫 -样品采自斑胸草雀（5年Taeniopygia雀，99个人，年龄零天）收集merula）（所有其他物种：样本大小1-3，年龄不详）（ 图1）。
从斑胸草雀抽取的样本，成功率的项目完成报告率为100％。 PCR反应结果总是匹配前（成人）或更高版本（雏鸟）表型检查所确定的性别。带的强度并没有雏鸟或者成人表示类似金额的DNA轴承材料都是从各年龄段之间获得系统不同。
图1“FO：内容宽度=”6英寸“FO：SRC =”/ files/ftp_upload/51429/51429fig1highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/51429/51429fig1.jpg“/>
图1：分子性别鉴定。从各种鸟类物种得到口腔拭子性别鉴定结果的例子。 2％琼脂糖凝胶溴化乙锭染色。从左至右依次为：大小标记，斑胸草雀男，孟加拉雀女，黑鸟男性，大山雀男性，南丁格尔男，加那利雄，水控，大小标记。
重要的是要防止CHELEX遗留污染的项目完成报告是很重要的
为了演示在PCR反应中CHELEX树脂污染的影响，我们包括少量的CHELEX珠在PCR反应中（ 图2）。如在图2A中可以看出，CHELEX珠遗留污染防止DNA的扩增是由缺乏引物二聚体形成的含有杂质的试样中（进一步说明<STRONG>图2B）。在图2A泳道2我们用于PCR相同的样品不进行过度CHELEX。通常污染的样品很容易辨认通过在琼脂糖凝胶（ 图2B）的口袋黑斑。
图2。CHELEX污染。 A）CHELEX结转到PCR反应抑制DNA的扩增。从左至右依次为：大小标记，斑胸草雀男，斑胸草雀女性，CHELEX故意携带相同的样品，水控，大小标记B）CHELEX珠是暗染色凝胶的口袋（左CHELEX不容易看见，正确CHELEX。在CHELEX的存在下进行PCR反应的严重抑制还示出由缺失引物DIMER形成污染的样本。
样本可以在室温下保存的DNA提取之前对超过三年
为了调查是否成功提取仍然可以长期储存后进行，样本来自同一只鸟反复拍摄并存储在实验室环境温度下的最大三年。将样品储存靠近窗口与天然暴露于光，热从太阳。三年后提取DNA和性别鉴定的PCR进行。结果相匹配的一个来执行三年前（采样之后），并没有显示存储的任何影响（ 图3）。
图3。CHELEX允许长期贮存的样品befo重和DNA提取后，样品2的动物（雄性左，女右）分别存储在不同条件下如表中所示。信号是从所有样品获得成功。
图4。雏鸡的标记。 A）示意图和羽绒羽毛生长在斑胸草雀幼鸟的四个不同领域的术语：雏鸟的=头，B =背面，C =翅膀（两者），D =侧翼（两者）B）示例图片，任何一方收取有关'理发'（AD）或无'理发'（E）中的一个。
提取的DNA可以在4℃下可保存三年以上
从第一个实验斑胸草雀标本保存三年在标准实验室周五DGE，在4℃，并成功地重新测试。所有的样品后，如直接提取DNA（ 图3），得到相同的PCR结果。
幼体可通过微调其羽绒羽毛，使个人识别从孵化上标明
通过削减他们的羽绒羽毛孵化后立即标记个体雏鸟使他们很容易辨认（ 图4，5，6）。羽毛具有蓬松外观的倒钩不接合在一起，形成一个光滑的叶片。他们仍然可以在10 posthatch日在发展中国家的羽毛，此时它盖在身上（ 图5）的提示确认。他们没有在不同的位置，使识别容易，有时即使不处理雏鸟（ 图6）。应用这些所谓的'理发'是一个优雅的技术，它成功填补了时间的差距从孵化，直到雏鸟斑马FINC的机身尺寸HES使腿带的应用是可行的。
图5。标记斑马雀在雏鸟孵化后第10天。图片显示雏鸟无论是与（剪刀）或无（箭头）标记。一个箭头指向的兴趣根据羽绒'理发'各自命名的位置：A =头，B =回，C =翅膀，D =侧翼。
标志着雏鸟根据命名图6。识别（平均年龄= 10天）的本命巢内。A =头，容易被发现，由于他的突出的羽绒羽毛，这是唯一缺少的头。B =回来，羽绒羽毛可见在所有位置，但就回来了。C =翅膀，需要一个细心的观察者，因为两翼齐失踪羽绒羽毛，但偎依的姿势使得从头部向下羽毛覆盖右翼D =两翼，只能通过排除法确认为它的侧面都看不出来。它能够可靠地确定为D，因为它显示了明显的下降羽毛生长在头部，背部和翅膀，E =的'发型'头（A）和背面（B）的组合，很容易就跌区分羽毛头部和背部缺少F =的“发型”A（头）和D（侧面），这只能通过排除其他选项，它的头标记来区分的组合是显而易见的，没有其他身份不明的雏鸟呈现头标记。 G =没收到任何标记，是很多比它更小的兄弟姐妹，因为它是最后一个孵化。另外G是一个很好的例子，它不表达羽绒羽毛所有地点的雏鸟。
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Discussion
使用CHELEX口腔拭子性别鉴定表现出非常高的成功率。切割幼体羽绒羽毛启用雏鸟之间的差异，直到腿带是可能的。
从口腔拭子CHELEX-DNA的提取产生足够的DNA，成功地进行分子性别鉴定。性别决定是100％正确的，因为验证的性别二态性的羽毛。这里报道的成功率明显高于报道的前两个研究7,9率较高。该DNA提取与CHELEX最大限度地减少它的原料可能会丢失移液和沉淀步骤。然而，这些研究验证了我们的协议在不同的物种之一（ 天燕座APU的 ）仍实现89％9成功率较低，即使这已经明显高于报道华宇等 82％以上。7。
可能是什么原因？最关键的部分是用心跟随普罗特OCOL，包括部分为怎样取样品（轻轻滑动组织多次在嘴），并防止CHELEX珠结转到PCR反应。作为CHELEX是阳离子交换它严重地抑制了PCR反应扩增防止污染的样品中。污染的样品可以通过有孔玻璃珠在琼脂糖凝胶中的口袋和缺乏引物二聚体的可见光容易地确认。
对于故障的可能性较小的原因，成功性的样品也可能是由于种属差异或使用不同的技术来检测频带差异的女性样本中。
切割的幼体斑胸草雀的羽毛是一种安全的方式来单独标记科目。这些'理发'是很容易辨认，直到雏鸟长大接收编号的腿带（ 例如在斑胸草雀10日）。这种标记技术可容易地调节，以满足不同experim威威廉斯需求; 如用于录像的标记可以被限制在小鸡的头。可应用于削减在两个位置的组合，如果巢是超过五雏鸟大。保持一个预定义的顺序申请'理发'（ 例如，在一个巢第一幼体总是收到“理发A”，第二总是收到“理发B'等），使整个雏鸟阶段的孵化顺序内快速识别。这使得快速识别，从而可以减少甚至防止处理的小鸡。在斑胸草雀，缺乏起伏的四个地点之一可能是由于自然波动。因此，可能并不总是可能粘到一个预定义的标记序列。
即使是没有经验的人在处理雏鸟它是一个快速学习，安全，易于标记技术切割下来的羽毛。然而，随着雏鸟的先天张开响应包括头部运动，有些人觉得它更难以到位三月国王的头。易出错的识别依赖于精确的标记。它是著名的重要性，以彻底切断了整个羽绒羽毛在给定的点，作为不完善的标记/单左淘汰下来的羽毛以后可能会混淆身份。
这一套方法能够非常快速，简便，无创，可靠和低成本，性别决定的鸟类和它们的无创，快速，安全，易于辨认孵化后几分钟之内标志。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
非常感谢西尔克咸鱼，莎拉·基弗，迈克尔·韦斯的Conny BARTSCH和西尔克福格特 - Heucke在现场热烈的样本采集，以Janett比肯费尔德为继续提供援助，以乌拉Kobalz为美丽的凝胶和托比亚斯克劳斯的道义上的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman 3MM Chromatography paper | e.g. Fisher Scientific | No.:3030-153 | |
| Chelex 100 Resin | Biorad | #143-2832 | |
| Taq polymerase | addgene | http://www.addgene.org/25712/ | |
| leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm) | Horst Stengel Sohn |
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