Summary
このプロトコルは、孵化直後にマーキング極めて迅速、簡単、非侵襲的、信頼性の高い鳥の低コスト、分子性決定とそれらの非侵襲的、迅速、安全かつ容易に認識可能にする方法の便利なセットを提供します。雛の限られた処理が必要となります。メソッドのこの便利なツールボックスは、RRR-ガイドラインに完全に準拠しています。
Abstract
多くの実験は、初期の子孫の性別を決定するだけでなく、初期の個体識別のための新生児のマーキングが必要です。該当するときはいつでも、動物福祉のガイドラインによれば、非侵襲的な技術が優先されるべき。私たちのグループでは、研究室で、現場での曲の鳥の異なる種で動作し、我々が正常なセックスに非侵襲的方法を適用し、個別に雛をマーク。本論文では、総合的な非侵襲的なツールボックスが表示されます。鳥を雌雄鑑別することは前に第二次性徴形質発現をPCRのためのDNA含有物質の収集を必要とします。私たちは、口腔スワブからDNAを抽出することにより、あらゆる年齢（ポスト孵化）の性鳥への迅速かつ簡単な方法を確立した。結果は、3時間以内に得ることができる。のための個々のマーキングひよこのダウン羽が孵化順序内での高速同定を可能にする特定のパターンでトリムされます。メソッドのセットは、標準装備の研究室でも容易に適用され、働いに特に適し特別な機器などの分野でのGはサンプリングと保存のために必要とされている。雛の取扱いを最小限にし、マーキングおよび性判別技術は、非侵襲的、それによって動物福祉ガイドラインのRRR原理を支援しています。
Introduction
個人認識、性判別およびジェノタイピングは、実験的研究の様々な基本的な前提条件である。 DNAの軸受材料を得て、（でも早い年齢で）明確に被写体をマーキング生理、行動、生存への影響を最小限に抑える必要があります。可能な限り、侵襲的処置はRRR原理1によれば避けるべきである。
非侵襲的な方法だけでなく、動物のために有益であるだけでなく、動物が少ない治療法の影響を受けているようにして得られたデータを向上することがあります。
鳥類では、DNAの性判別が糞2、羽毛3,4または口腔スワブ3,5,9などの非侵襲的に得られる材料の数に基づいて行うことができる。彼らは実行が容易であるために関係なく、患者の状態や年齢頬スワブの鳥類の雌雄鑑別のための選択の方法はほとんど失敗しないと取り扱いが短い、、である。
口腔スワブからこれまでのところ、DNAいずれかの市販のキット3,6又は時間3,6-8標準的なDNA抽出プロトコールを消費で抽出した。キットだけでなく、かなり高価ですが、彼らのプロトコルは、フィールドワークのための課題を課すことができる。いくつかの手続きの詳細、 例えば乾燥およびサンプルのインキュベーションは、フィールドには実用的ではない。特に実験プロトコルは、早ければ数分後孵化などからセックス依存の治療を必要とする設定で、結果を得るために、迅速な非侵襲的、信頼性が高く、簡単な方法のために促すとされている。
鳥類の分類群間でマーキング個人のためのかなりのツールボックスは、10を開発してきた。利用可能な技術の広い配列は、研究目的、種や予算のさまざまなを占めています。しかし、小さな雛をマークすると、新たな課題を研究者に直面しています。いくつかの種（ 例えばスズメ目）のヒヨコは、レッグバンドを適用するには小さすぎる、代替方法を必要とする親の子孫の動作を変更しないでください。フィールドと実験室での研究で動物福祉や技術の改善に意識や関心が高まっているように、非侵襲性の技術を使用することを強く奨励して好ましい。
このプロトコルは、個々に、レッグバンドを適用する前に、非常に若い雛をマークするために非侵襲的、迅速かつ容易に認識永続方法を提供することは可能である。このマーキング方法は、最も重要な鳥類の実験室モデルの種の一つ、ゼブラフィンチ（Taeniopygia滴状 ）11月13日に導入されている。プロトコルは、個々のマーキング技術10のための以前に発表され目標のすべてに準拠しており、すでに正常14,15を適用されている。
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Protocol
すべての手順は、動物保護（TierSchG）のためのドイツの法律を遵守して実施された。
試薬および消耗品の1。準備
- 分子グレードの水中5％（w / w）のキレックス-100溶液を調製する。標準1.5ミリリットルの反応管に200μLのアリコートを準備します。キレックス樹脂はサスペンションからの高速沈殿するように、一定分量の調製中絶えず再均質化するサスペンションが必要である。それは1つのバッチを50 ml以上を準備し、マグネチックスターラーを用いて均質化した懸濁液を維持することをお勧めです。キレックス溶液を周囲条件で年間保存することができる。
- 試験対象の鳥のくちばしの幅よりも狭い幅のワットマン紙の部分をカット。用紙の長さは、サンプルを取るための方法によって異なります。
- 鉗子を使用して、作品は鳥のくちばしに挿入される鉗子ずにサンプル採取を可能にするのに十分な長さでなければなりません。として概算は、0.5cmのくちばしの長さ1cmの長さの一枚の紙は、問題ないはずです。
- 鉗子を使用していない場合は、作品は長くなければなりませんが、一枚の剛性は、まだ上皮細胞の採取を可能にするはずである。
- 分析しようとするそれぞれのサンプルについて、PCRプレミックスの1アリコートを準備します。混合液25の全体積0.18のdNTPを含有する、2mMのMgCl 2、70mMのトリス-HCl、17.25 mMの硫酸アンモニウム、0.1％のTween-20、0.32μMのP2プライマー（TCTGCATCGCTAAATCCTTT）におけるPCR、0.32μMP8用プライマー（CTCCCAAGGATGAGRAAYTG）16および2単位のTaqポリメラーゼ。自家製のTaqポリメラーゼ17を使用することができる。 DNA溶液の最大量の添加を可能にするために、6μlのプレミックスは、数週間のために調製し、-20℃で保存することができる。
2。サンプルの採取
PCRプライマーなどの鳥類の性決定がヒトDNAにアニーリングすることはできませんのために手袋を身に着けていることは必須ではない。のために他のジェノタイピングの目的は、それが賢明かもしれません。
- 興味のある鳥を捕獲し、そっと「リンゲルグリップ「18と1手などでそれを保持。鳥を圧迫しないようにしてください。
- 鉗子でワットマン紙を持って、頬の内側、舌と後鼻孔を渡ってそれを数回強打。通常、サンプルは、30秒未満以内に得られる。
- 成体動物：種によって、そのくちばしを開くために鳥を得ることは困難かもしれません。通常、くちばしの側面に触れ、穏やかな圧力を適用すると、動作します。
- 雛：孵化やヒナからのサンプリングがその物乞い行動はくちばしの内部への容易なアクセスを提供するので、この技術を用いて、特に簡単です。そのnestboxが開かれたとき、彼らはすぐに例を請うようにそれも、すべてでそれらを処理せずにサンプルを得ることができるかもしれません。
- 直ちに調製した反応管contaiに用紙を格納5％（w / w）のキレックス-100溶液200μlを寧。
あなたも/予定の場合はセクション6で説明したようにここで行い、雛をマークする必要があります。
DNA抽出前のサンプルの3。ストレージ
- -20℃での研究室で働いている場合は、サンプルの保存これは、周囲温度で保存サンプル（フィールド内など ）が可能かは難しいことではありません場合。
- 試料を室温から-20℃の範囲の温度で3年以上保存することができる
4。DNA抽出
- 試料が凍結している場合、室温で解凍。
- 一枚の紙がキレックス-100溶液に沈め管の底にあることを確認します。
- 56℃で15分間、サンプルをインキュベート
- 簡単にボルテックスチューブの内容をスピンダウン。
- 100℃で8分間のサンプルをインキュベート
- 3分間15,000×gでサンプルをスピン。
- Sを使用してくださいその後の遺伝子型判定のためupernatant。
5。分子性決定
- サンプルあたり6μlのプレミックスプラス2の負のための追加のチューブ（必須）および陽性コントロール（オプション）を1 PCRチューブを準備します。ルーチンの性決定のポジティブコントロールとして、最後に成功した雌雄鑑別からのサンプルが含まれています。
- DNA抽出からのPCRプレミックスに上清の19μLを加える。キレックスビーズのキャリーオーバーを避けるために、溶液の表面からピペットにしてください。キレックスは陽イオン交換体であるため、深刻なすべての酵素反応を阻害するので、これは非常に重要です。
- 3分間、72℃で45秒の伸長ステップ、続いて55℃で30秒のアニーリング工程、続いて30秒間溶融工程94°C、45サイクルの各94℃でインキュベーション：以下のPCRプログラムを実行するC.最終チェースオフ工程では、反応は72℃で5分間インキュベートする
- 2％標準TBEまたはTAE agaroを準備 PCR産物を分離するためのそれ自体のゲル。
- 適切な電圧設定でアガロースゲルを実行します。
- UV光下でバンドを可視化し、写真を撮る。メスから発信サンプル中の2バンドが十分に分離されていることを確認します。
- 1（男性）または2（メス）のバンドの存在によって、女性のサンプルの男性を区別する。
6。雛マーキング
- 種/研究のための適切なスケジュールで、新たに孵化した雛のための巣を確認します（ほとんどのヒナが孵化した後のように朝には例えば 、毎日のチェックがお勧めします）。
- 異なる特性の場所で巣内の各ひよこのダウン羽を切った。キンカチョウで浮き沈みの房は、雛の体全体で4つの特徴と異なる領域（ 図4A）で成長する。それぞれのひよこのための1の領域（ 図4B）をカット。つ以上の雛一ネスト内に存在する場合、固有の4 '髪型'は組み合わせることができる。
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Representative Results
口腔スワブは小鳥種々の性決定のためのDNAを得るために使用することができる
サンプルは、キンカチョウ（Taeniopygia滴状、99の個人、年齢0日- 5歳）から採取した、カナリア諸島（Serinusのカナリア ）、ベンガルフィンチ（Lonchura線条体 ）、ナイチンゲール（ サヨナキドリ ）、シジュウカラ（ シジュウカラ ）とブラックバーズ（ ツグミメールラ ）（他のすべての種について：サンプルサイズ1-3、年齢不明）（ 図1）。
キンカチョウから採取した試料については、PCRのための成功率は100％であった。 PCRの結果は、常に前に（成人で）以降（雛）で表現型の検査によって決定性別と一致しました。バンドの強度は、DNA含有物質の同様の量は、すべての年齢層から得ていることを示す雛、大人の間で体系的に差は認められなかった。
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図1。分子性判別。様々な鳥類の種から得られる口腔スワブからの雌雄鑑別結果の例。 2％アガロースゲルを臭化エチジウムで染色した。左から右へ：サイズマーカー、ゼブラフィンチの男性、ジュウシマツのメス、ブラックバード男性、シジュウカラのオス、ナイチンゲールの男性、カナリアオス、水管理、サイズマーカー。
これは、PCRにキレックスキャリーオーバー汚染を防止することが重要である
PCR反応においてキレックス樹脂汚染の効果を実証するために、我々は、PCR反応（ 図2）にキレックスビーズを少量含んでいた。 図2Aに見られるように、キレックスビーズのキャリーオーバーコンタミネーションは、さらに汚染された試料中のプライマーダイマー形成（の欠如によって示されているDNAの増幅が<防ぎ強い>図2B）。 図2Aレーン 2では、キレックス上で行うことなく、PCR用に同じサンプルを使用していました。通常汚染された試料は、アガロースゲル（ 図2B）のポケットに黒い斑点で簡単に認識可能である。
図2。キレックス汚染。 A）PCR反応にキレックスのキャリーオーバーは、DNAの増幅を阻害する。左から右へ：サイズマーカーは、ゼブラフィンチの男性、ゼブラフィンチメス、キレックスの意図的なキャリーオーバーと同じサンプルでは、水管理、サイズマーカーB）キレックスビーズキレックスずに残ったゲルのポケットの中の暗い染色（として容易に見える右キレックスで。キレックスの存在下でのPCR反応の重度の阻害はまた、欠落プライマーdによって示されている汚染されたサンプル中のIMER形成。
サンプルは、3年以上のDNA抽出前に室温で保存することができる
成功した抽出はまだ長い貯蔵後に行うことができるかどうかを調べるために、試料を同一の鳥から繰り返し採取し、最大三年間周囲温度で実験室に格納されている。サンプルは、太陽からの光や熱に自然暴露してウィンドウを閉じるに保存した。 3年後にDNAを抽出し、PCR雌雄鑑別を行った。結果は1（右サンプリング後）3年前に行われ、ストレージの影響（ 図3）を示すものではありませんでしたマッチ。
図3は、キレックスbefo試料の長期保存を可能にする表に示すように2匹の動物（オス、左、女性右）の再およびDNA抽出後。サンプルは、異なる条件下で保存した。信号はすべてのサンプルから正常に得られた。
図4。雛のマーキング。キンカチョウの雛における羽毛の成長の4つの領域のA）の模式図および命名：A =頭部、B =バック、C =翼（両方）、D =脇腹（両方）b）のいずれかの雛の例の写真それぞれの「ヘアカット」（AD）の1または全く「ヘアカット」（E）を受けた。
抽出したDNAを4℃で3年以上保存することができる
最初の実験からキンカチョウサンプルは、標準的な実験室の金で3年間保存した4℃でDGEし、正常に再テスト。全てのサンプルは、直接DNA抽出（ 図3）後の同じPCRの結果が得られた。
孵化は上の孵化から個々の認識を可能にするために、その下に羽をトリミングしてマークすることができます
右の羽を自分の伐採により孵化後、個々の雛をマークする（ 図4、図5、図6）、それらを容易に認識しました。彼らのとげがスムーズに羽根を形成するために一緒に参加していないようにダウン羽がふわふわな外観を持っている。それらは、それでも体内（ 図5）を覆う現像羽の先端に孵化後10日目で認識することができる。明確な場所で彼らの不在は、時には雛（ 図6）を処理することなく、認識が容易になります。これらのいわゆる `ヘアカット」を適用すると、成功したゼブラFINCを寄り添うのボディサイズになるまで孵化からの時間のためのギャップを埋め、エレガント技術であるHESのは、レッグバンドの適用が可能となる。
図5。孵化後10日目でゼブラフィンチの雛を迎えました。写真は（ハサミ）または（矢印）の印の有無にかかわらず雛を示しています。 A =頭部、B =バック、C =翼、D =脇腹：羽毛「ヘアカット」のそれぞれの命名法に従って、目的の場所にある矢印をポイントします。
図6。マークされた雛の認識は、命名法に従ってナタール巣内（10日間=平均年齢）。両翼が欠落しているように頭部のみ含まれていないため、彼の著名なダウンの羽毛に見つけるのは簡単=頭、、。、B =バック、ダウンの羽毛認識できるすべての場所ではなく、バック。、C =翼には、注意深い観測者を必要とします羽ダウン、しかしの寄り添う姿勢は頭部からダウンの羽毛は右サイドをカバーすることができます。その両サイドを見ることができないように、D =フランクのみ消去法によって認識することができる。それが頭を見下ろし明確な羽の成長を示しているように、それが確実にDと認識することができ、背中と羽は、Eが戻って、（B）「ヘアカット」の頭（A）との組み合わせを=、上のようなダウンの羽毛を区別することは容易である頭と背中不足しています。Fは 「ヘアカット」（頭）の組み合わせを=とだけマーキングの頭のような他のオプションを排除することによって区別することができ、D（脇腹）は、明白であり、他の正体不明の雛は、マーキングヘッドを示さない。 Gは =しませんでした任意のマーキングを受け取り、それが孵化するの最後にあったように、その兄弟よりもずっと小さい。さらにGは、すべての場所で羽を下に発現していない雛のための良い例です。
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Discussion
キレックスを用いた口腔スワブから雌雄鑑別は非常に高い成功率を示した。脚バンディングが可能になるまで切削雛のダウンの羽毛は、雛の間で差別化を可能にしました。
口腔スワブからのキレックス-DNA抽出に成功し、分子性判別を実行するための十分なDNAが得られた。性的二型羽によって検証としての性決定は正しい100％だった。ここで報告された成功率は2これまでの研究により報告された7,9率よりも著しく高くなっている。キレックスとDNA抽出は、材料が失われることが可能なピペット操作および沈殿ステップを最小限に抑えることができます。しかし、異なる種（ エイプスののAPU）で私たちのプロトコルを認証の研究の一つは、まだこれはすでに有馬らに報告された82パーセントよりも顕著に高かったにもかかわらず、89パーセント9の下側の成功率を達成しました。7。
何が原因だろうか？最も重要な部分は、注意深くPROTに従うことですocol、サンプルを採取する（そっと口の中にティッシュを数回スワイプ）し、PCR反応にキレックスビーズのキャリーオーバーを防ぐ方法のための部分を含む。キレックスは、陽イオン交換体であるので、それはひどく汚染された試料中の増幅を防止するPCR反応を阻害する。汚染された試料は、容易にアガロースゲルのポケットとプライマーダイマーの欠如に見えるビーズによって認識することができる。
失敗の可能性が低い理由は首尾セックスサンプルも種差または女性のサンプルのバンドの違いを検出するために様々な技術の使用が原因である可能性があります。
雛キンカチョウのダウン羽をカットする個別の科目をマークする安全な方法です。雛は、番号付きのレッグバンド（ 例えばキンカチョウでの10日目）を受信できる年齢になるまでこれらの「ヘアカット」は認識することが容易であった。このマーキング技術は、容易に異なるexperimを満たすように調整することができるental要求は、 例えば 、ビデオ録画のためのマーキングは雛の頭部に限定することができる。巣は、5つの雛よりも大きい場合、2つの位置でのカットの組み合わせを適用することができる。 （巣の中例えば最初の雛は、常に第二は、常になど「散髪B 'を受けて、「ヘアカットA'を受信すると）「ヘアカット」を適用する際に事前に定義された順序を維持雛相全体に孵化順序内での高速認識を可能にする。これは減らしたり、雛の取扱いを防止することができる、迅速な同定を可能にする。キンカチョウでは、4のいずれかの場所での浮き沈みがないことは、自然変動に発生する可能性があります。このように、常に定義済みのマーキングシーケンスに固執することはできないかもしれない。
でも、雛の取り扱いに不慣れな誰かのためにそれがダウンの羽をカットし、安全で簡単なマーキング技術を学ぶために迅速です。雛の生得ぽっかり応答が頭の動きが含まれてしかし、、一部の人々はそれがより困難に市場を置くことを見つける頭の上の王。エラーが発生しやすく識別は正確なマーキングに依存しています。不完全なマーキング/シングル左アウトダウンの羽毛は、後で身元を混乱させる可能性がある、それは、徹底的に与えられたスポットで羽を全体を削減する著名重要である。
メソッドのセットは、非常に高速、簡単、非侵襲的で信頼性の高い、低コスト、鳥の性決定とそれらの非侵襲的、迅速、安全かつ容易に認識孵化後数分以内にマーキングを可能にします。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
精神的な支援のための美しいジェル用とトビアス·クラウスのウラKobalzを引き続き支援するためJanettビルケンフェルトの分野で熱狂的なサンプル収集のためのジルケキッパー、サラ·キーファー、マイケル·ワイスコニーBartschのとジルケフォークト·Heuckeに感謝、、。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman 3MM Chromatography paper | e.g. Fisher Scientific | No.:3030-153 | |
| Chelex 100 Resin | Biorad | #143-2832 | |
| Taq polymerase | addgene | http://www.addgene.org/25712/ | |
| leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm) | Horst Stengel Sohn |
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