Summary
Heterolog ekspression og oprensning af cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) er betydelige udfordringer og begrænsende faktorer i udviklingen af lægemiddelbehandlinger for cystisk fibrose. Denne protokol beskriver to metoder til isolering af milligram mængder af CFTR egnet til funktionelle og strukturelle studier.
Abstract
Fejl i cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR) protein forårsager cystisk fibrose (CF), en autosomal recessiv sygdom, der i øjeblikket begrænser den gennemsnitlige levealder for syge til <40 år. Udviklingen af nye narkotika molekyler til at genoprette aktiviteten af CFTR er et vigtigt mål i behandlingen CF, og isolering af funktionelt aktivt CFTR er et nyttigt skridt i retning af at nå dette mål.
Vi beskriver to fremgangsmåder til oprensning af CFTR fra en eukaryot heterologt ekspressionssystem S. cerevisiae. Ligesom prokaryote systemer, S. cerevisiae hurtigt kan dyrkes i laboratoriet til en lav pris, men kan også trafik og posttranslationelt ændre store membranproteiner. Udvælgelsen af vaskemidler til solubilisering og rensning er et afgørende skridt i oprensningen af enhver membran protein. Efter at have screenet for opløseligheden af CFTR i flere vaskemidler, har vi valgt to contrasting detergenter til anvendelse i oprensning, der tillader den endelige CFTR præparat skal skræddersys til de efterfølgende planlagte eksperimenter.
I denne fremgangsmåde giver vi sammenligning af oprensningen af CFTR i dodecyl-β-D-maltoside (DDM) og 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Protein renset i DDM ved denne metode viser ATPase aktivitet i funktionelle assays. Protein oprenset i LPG-14 viser høj renhed og udbytte, kan anvendes til at studere post-translationelle modifikationer, og kan anvendes til strukturelle metoder såsom små-vinkel røntgenspredning og elektronmikroskopi. Det udviser imidlertid betydeligt lavere ATPase-aktivitet.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er den mest almindelige genetiske lidelse i Europa og Nordamerika med en incidens på omkring 1 i 2.500 levendefødte. CF forekommer, når mutationer i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) protein forårsage tab af dets funktion på plasmamembranen af epitelceller 1. Den mest alvorlige konsekvens af denne defekt er irreversibel lungeskade, hvilket forkorter den forventede levetid for syge til <40 år 2,3.
CFTR er en ATP-bindende kassette (ABC) transporter, der har udviklet sig til en ionkanal 1,4. Trods sin helt ændret funktion i plasmamembranen i celler, er det stadig bevarer signifikant sekvenshomologi med andre ABC transportører. Interessant de specialiserede dele af CFTR (dvs. dets regulatoriske region og dets N-og C-terminalerne) deler ingen signifikant sekvens lighed med andre metazoan ABC transportører, og derfor er der ingen fingerpeg til the oprindelsen af disse sekvenser i CFTR. På grundlag af sin primære struktur er CFTR klassificeret som en C-familie medlem af ABC transportør familien, men der er ingen stærke beviser for en residual funktionel kobling til denne sub-familie. Der har været nogle rapporter om glutathion transport aktivitet for CFTR 5-7, hvilket ville være i overensstemmelse med de roller, andre C-familiemedlemmer 8,9, selv om andre rapporter tyder på, at reduceret glutathion kan hæmme CFTR ATPaseaktivitet, snarere end at vise den substrat-induceret stimulering, der kendetegner ABC transportører 10. Måling af ion-ledningsevne er tilstrækkelig følsom til at muliggøre kanalen aktivitet af CFTR-molekyler at blive undersøgt 1 og CFTR kanal egenskaber er blevet overvåget som en funktion af tid, temperatur, ATP-koncentration, membranpotentiale og phosphorylering tilstand, såvel som i tilstedeværelsen af et væld af små molekyle inhibitorer, potentiatorer, og modifikatorer. Disseundersøgelser har også tilføjet betydeligt til vores viden om, hvordan ABC transportører fungere. Ikke desto mindre har udtryk af CFTR i betydelige mængder og dens efterfølgende oprensning vist sig at være særligt udfordrende og succes har været begrænset til nogle få laboratorier 10-13.
Behovet for at udvikle mere effektive lægemidler er knap, men denne proces er blevet hæmmet af manglen på renset CFTR til screening små molekyler. Løsning CFTR ekspression og oprensning problem ville gøre det muligt for high-throughput medikamentscreeningsanalyse sigte mod at korrigere den primære defekt i CF og vil også åbne op for en rute til høj opløsning strukturelle studier til at informere rationelt drug design. Desuden forbliver selv relativt basale biokemiske egenskaber af proteinet, såsom dens funktionelle oligomere tilstand interagerende proteiner og ATPase-aktivitet dårligt karakteriseret. Vi har tidligere rapporteret om en protokol for storstilet udtryk for GFP-og His-mærkede murine CFTRi S. cerevisiae 14 og nu yderligere beskrive protokoller til rensning af CFTR. Vi har brugt disse metoder til at rense fem orthologues af CFTR og præsentere data til rensning af kylling CFTR som et eksempel. Udvælgelsen af vaskemidler til solubilisering og rensning er et afgørende skridt i oprensningen af enhver membran protein. Have screenet for opløseligheden af CFTR i flere detergenter, har vi valgt to modsatrettede rengøringsmidler til anvendelse i oprensning. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) er en ikke-ionisk detergent, der har været flittigt brugt til både strukturelle og funktionelle studier af membranproteiner 15-21. Den ionisk detergent 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) er yderst effektive i solubilisering af CFTR og er tidligere blevet anvendt i oprensningen af funktionelle membranproteiner 10, 22,23, herunder oprensning af CFTR fra S. cerevisiae 24. </ P>
Protocol
1. Fremstilling af buffere
- For at gøre det 100x bestand af proteasehæmmer (PI) cocktail opløse 96 mg AEBSF, 3,5 mg chymostatin, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptin, 16,5 mg pepstatin, 348 mg PMSF og 4 mg bestatin i 20 ml DMSO. Lav 1 ml portioner og opbevares ved -20 ° C. For at gøre en 100x bestand af benzamidin opløses 720 mg i 20 ml ultrarent vand (Hedeselskabet 2 O) og opbevares i 1 ml portioner ved -20 ° C. Denne mængde er tilstrækkelig til en rensning. I alle buffere, er PI og benzamidin lagre anvendes i en 1:100 fortynding.
- Forbered 'mPIB (0,3 M Tris pH 8, 0,3 M saccharose, 2 mM DTT) og "CFTR (50 mM Tris, pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 mM DTT) buffere og chill til 4 ° C . Før brug tilsættes 1:100 af den proteasehæmmer cocktail og 1:100 benzamidin i henhold til mængden af mPIB bruges til resuspender cellepelleten (brug f.eks 3,5 ml PI og 3,5 ml benzamidin i et samlet volumen på 350 ml mPIB).
- Forbered solubilization buffere. Lyso-phosphatidylglycerol-14 (LPG) solubiliseringsbuffer (50 mM Tris, pH 8, 10% (v / v) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, proteasehæmmere (PI'er) og 4% (w / v) LPG) og dodecylmaltosid (DDM) solubiliseringsbuffer (50 mM Tris, pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, proteasehæmmere, 4% (w / v) DDM). Buffer kan sonicated i en sonikatorbad (35 W, 40 kHz) til at hjælpe med spredning af vaskemiddel, men undgå vortex blandingen, da det skaber bobler. Chill til 4 ° C før brug.
- CFTR oprensningspuffer for LPG-rensning er 50 mM Tris, 10% (v / v) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) LPG-14 og proteaseinhibitorer. Forbered 350 ml af denne puffer, og 150 ml af den samme buffer plus 1 M imidazol. Juster pH begge buffere til 8.
- Bufferen til oprensning i DDM består af 50 mM Tris, pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Forbered 350 ml af denne puffer, og 150 ml af den samme buffer plus 1 M imidazole. Juster pH begge buffere til 8.
- Til gelpermeationskromatografi (GPC) puffer indeholdende LPG, fremstilling af 50 mM Tris, pH 8, 10% (v / v) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w / v) LPG-14. Til GPC ved hjælp af DDM udarbejde en puffer af 50 mM Tris, pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Alle buffere og ddH2O anvendes på GPC kolonne skal filtreres (0,2 um filter) og afgasset før brug.
- SDS-PAGE-prøvebuffer (2x koncentration bearbejdning): 50 mM Tris-HCI pH 7,6, 5% (v / v) glycerol, 5 mM EDTA, 0,02% (w / v) bromphenolblåt. Lav 700 ul portioner og opbevares ved -20 ° C. Før brug tilsættes 200 pi 20% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS) og 100 pi frisk 0,5 M DTT. Der inkuberes i mindst 10 minutter med prøve ved stuetemperatur, inden du lægger på gel. Må ikke opvarmes; dette vil denaturere GFP og kan forårsage CFTR at sammenlægge.
- For at gøre lipid lagre til rekonstitution opløses 4:1 (w / w) blanding af E. coli lipider end kolesterol i chloroform og methanol (2:1 v / v) og tørres i et hætteglas under N2-gas i 2 timer til dannelse af en lipidfilm. Tilføj GPC puffer (uden NaCl) til en lipidkoncentration på 40 mg / ml og bruge gentagen hvirvelbehandling og lydbehandling (35 W, 40 kHz) for at præcisere opløsningen.
- For ATPase assay forberede 100x lagre af ATPase-inhibitorer ved at opløse SCH28080 til 1 mM i DMSO, NaSCN til 1 M i ddH2O og oligomycin til 2,5 mM i 100% (v / v) ethanol. Opbevares i alikvoter ved -20 ° C. Lav 100 ml ATPase-puffer med 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NH4CI, 5 mM MgSO4 og 0,02% (w / v) NaN3. Dette kan opbevares ved stuetemperatur og anvendes til flere analyser. Forbered en 5 mM ATP bestand umiddelbart før brug og holde på is. (NB Brug Na 2 ATP for at forhindre overdreven baggrund signal fra fosfat i analysen). Forbered SDS stop-løsning (12% (w / v) SDS i Hedeselskabet 2 O).
- For Chifflet afsløring forberede buffer A (3% (w/ V) ascorbat, 0,5% (w / v) ammoniummolybdat, 0,5 M HCI) umiddelbart før brug, og buffer B (2% (w / v) natriumcitrat, 2% (w / v) natrium-meta-arsenit, 2% (v / v) eddikesyre).
2.. Isolering af Gær Mikrosomer
- S. cerevisiae udtrykker kylling CFTR dyrkes som beskrevet i O'Ryan et al. (2012) 14. Opbevar materiale fra en 20 L fermentering i to portioner ved -80 ° C i op til 6 måneder.
- Optøning en alikvot af celler hurtigt og resuspenderes i 3 ml kølet mPIB per gram celler.
- Forstyrre celler i en kuglemølle under anvendelse af glasperler 425-600 um diameter. Brug fem 1 min perioder cellesprængning adskilt af 1 min hvileperioder. (De hvileperioder er afgørende for at sikre, at cellerne ikke er opvarmede i forstyrrelser.)
- Overvåg cellesprængning ved centrifugering af en 1 ml prøve af cellelysat fra kuglemølle. Centrifugeres (12.000 xg, 4 ° C, 5 min) i en bænk top centrifuge. Fortyndes supernatanten til 1:50 med mPIB i en kuvette og måle A 380. Hvis A 380> 0,1, eller er holdt op med stigende på trods af flere gentagne perle-beating cykler, gå videre til næste trin. Hvis ikke, gentages 2,3-2,4.
- Centrifuger samlede cellelysat (12.000 x g, 4 ° C, 20 min.) Behold supernatanten. Kassér pellet (indeholdende ubrudte celler og mitokondrier), men hvis der er nogen tvivl om effektiviteten af cellebrud (se 2.4), og derefter fastholde pellet også.
- Centrifugeres supernatanten fra det foregående trin (200.000 x g, 4 ° C, 1,5 timer). Supernatanten fjernes, og resuspender pelleterede mikrosomale membraner i CFTR buffer. Hvis mikrosomer er beregnet til rensning under anvendelse af DDM supplere CFTR puffer med 1 M NaCl.
- Gentag centrifugering af fraktionen resuspenderet membran (100.000 x g, 4 ° C, 1 time) og kassér supernatanten.
- Resuspendere de pelleterede mikrosomerne ien mindste mængde CFTR buffer (endelig volumen 5-15 ml, total mikrosomalt protein 70-200 mg). En Bradford assay kan anvendes til at bestemme den samlede koncentration af mikrosomale proteiner 25. Desuden bør måles fluorescensemissionsspektret af membraner (excitation = 485 nm, emission = 500-600 nm), og bør have en tydelig GFP-fluorescens peak (maksimum ved 512 nm). CFTR kan påvises specifikt på en SDS-PAGE-gel, som scannes under GFP fluorescens betingelser (figur 1).
- Flash-indefryse resuspenderede mikrosomer ved kaste sig flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C, eller fortsætte til Trin 3.
3.. Solubilisering af Mikrosomer
- Hvis de frosne optø mikrosomer umiddelbart før anvendelse i et vandbad indstillet til 10 ° C.
- Til solubilisering af membraner, fortynde mikrosomer med et tilsvarende volumen af det pågældende solubiliseringsbuffer (trin 1.3) til opnåelse af en endelig detergentkoncentration af2% (w / v) og en mikrosomal proteinkoncentration på 5 mg / ml. Inkuber blandingen i 1 time ved 4 ° C med omrøring (rør rotator). Behold 200 ul til analyse.
- Centrifuger blandingen (100.000 x g, 4 ° C, 45 min.) Fjern supernatanten indeholdende de solubiliserede membranproteiner, passerer det gennem et 0,45 um sprøjtefilter og opbevare på is. Måle fluorescens af supernatanten (som i trin 2.8).
- Resuspender den uopløselige fraktion i 1% (w / v) SDS-opløsning til et volumen svarende til den opløselige fraktion. Mål fluorescens i denne fraktion og fastholde en portion af 50 pi til SDS-PAGE-analyse.
4. Nikkel-affinitetsoprensning af CFTR
- Link to 5 ml nikkel sepharosesøjler i serie. Vask med 2 søjlevolumener (CV) 20% (v / v) ethanol efterfulgt af 2 CV ddH2O, derefter vaskes søjlen med 2 CV af solubiliseringsbuffer (Trin 1,4-1,5) indeholdende 1 M imidazol. Gentag med 2 CV solubilization buffer mangler imidazol.
- Tilføj imidazol til en endelig koncentration på 5 mM til det solubiliserede materiale (trin 2.8) og manuelt indlæse materiale på kolonne eller i en prøvesløjfe, hvis anvendelse af en automatiseret væskekromatografi enhed.
- Indlæse det solubiliserede materiale på søjlen ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min, og vaskes med 2 CV imidazol-mangler puffer ved samme strømningshastighed for at fjerne ubundet materiale. Saml fraktioner i 50 ml Falcon rør.
- For den første vask, anvender 3 CV oprensning buffer med 40 mM imidazol ved en strømningshastighed på 1 ml / min. Saml 2 ml fraktioner.
- For den anden vask, brug 3 CV oprensningspuffer med 100 mM imidazol. Saml 2 ml fraktioner.
- Elute CFTR fra HisTrap søjlen med 3 CV oprensning buffer med 400 mM imidazol. Saml 2 ml fraktioner.
- Overvåg fluorescens i eluerede fraktioner (trin 2.8).
- Bevar portioner af topfraktioner til SDS-PAGE-analyse. Flash fryse resterende peak f-fraktion prøver og opbevares ved -80 ° C, eller fortsætte til næste rensning skridt.
5.. Gelpermeationskromatografi (GPC) Oprensning af CFTR
- Ækvilibrer søjlen (Superose 6 10/300 GL) med 1,2 CV ddH2O efterfulgt af 1,2 CV GPC buffer.
- I trin 5.1 koncentrere Ni-affinitetsoprensede fraktioner med den højeste GFP-fluorescens under anvendelse af en 100.000 MWCO centrifugal filter ved 4 ° C. Hvis rensning i DDM, undgå at koncentrere prøven over et protein koncentration på 0,3 mg / ml protein, da dette vil medføre et betydeligt tab prøve. Fjern retentatet fra koncentratoren og centrifugeres ved 100.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C for at pelletere store partikler.
- Injiceres prøven på søjlen og elueres med en isokratisk gradient på 1,2 CV GPC buffer. Opsaml fraktioner på 0,5 ml.
- Mål GFP-fluorescens som i afsnit 2.8 for at identificere de fraktioner, der indeholder CFTR. Fastholde et lille volumen (fx </ Em> 50 ul) af hver til analyse ved SDS-PAGE.
- Frys brøker i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
6.. Rekonstituering af CFTR
- Tilføj lipider (trin 1.8) for at den oprensede CFTR på lipid-til-protein-forhold 100:1 (vægt / vægt) og inkuberes ved 4 ° C i 1 time. Tilsvarende nedsat en lipid-kun kontrol, erstatte det oprensede protein med den samme mængde af GPC buffer.
- Fjern detergent fra protein / lipid-blanding under anvendelse af hydrofobe adsorberende perler. Vask adsorberende perler i 5 CV ddH2O, 5 CV 70% (v / v) ethanol, 5 CV ddH2O og 5 CV GPC puffer mangler detergent. Tilsæt 200 mg vaskede adsorberende perler pr ml renset protein og inkuberes ved 4 ° C natten over med forsigtig omrøring.
- Saml blandingskanylen prøve fra adsorbenspartiklerne perler ind i en frisk rør ved hjælp af en tynd-ended pipettespids.
7.. Måling af ATPase aktivitet
- Bestem antallet af CFTR-specifik ATPase-aktivitet ved anvendelse af en modificeret Chifflet assay 26,27 i en 96-brønds plade-format. Med natriumphosphat stamopløsning (0,65 mM) forberede 0-20 nmol phosphat i et slutvolumen på 50 pi som standarder. Brug en 1:1 blanding af CFTR buffer og ATPase-buffer til fortynding af phosphat lager.
- Inkuber både rekonstituerede CFTR og tomme liposomer med 1:100 (v / v) ATPase-inhibitorer (trin 1,9) på is i 10 min. Brug mindst 5 ug rekonstitueret CFTR.
- Tilføj ATP (trin 1.9) til en slutkoncentration på 2 mM, og der inkuberes ved 25 ° C i 1 time. Reaktionen standses ved tilsætning af 40 pi af 10% (w / v) SDS (trin 1,9) til hver brønd (herunder standarder).
- Tilsæt 100 pi af buffer A (trin 1.10) og inkuberes i 10 min. Tilsæt 100 ul puffer B (1,10) til hver brønd, og absorbansen måles ved en bølgelængde på 800 nm i en 96-brønds plade-kompatible UV / Vis spektrofotometer.
- Konverter absorbans ved 800 nm i en mængde af frigivet phosphat ved hjælp affosfat standarder. Beregn hastigheden af ATP hydrolyse efter fradrag baggrund signal (liposomassocieret kun brønde).
- For ikke-rekonstituerede CFTR følge den samme protokol hjælp CFTR buffer for baggrunden aflæsninger.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne protokol er et effektivt middel til at isolere CFTR-berigede mikrosomer, med næsten fuldstændig genopretning af CFTR under cellebrud og forberedelse af de rå mikrosomerne (figur 1). Andre cellebrud fremgangsmåder kan også anvendes effektivt. Vi har udnyttet en fransk trykcelle og andre high-pressure/cavitation enheder (også i kombination med påvirker mod en rubin mål) med lige effektivitet. For bekvemmelighed og lave indledende omkostningerne til udstyr, finder vi perle-bankende metode bedst.
Brug af LPG til solubilisere og oprense CFTR gav 80 ug protein / L kultur på> 90% renhed (figur 2). Det høje udbytte skyldes effektiv solubilisering af CFTR af LPG (sammenlign figur 2b, bane 2 og 4). Derudover kan effektiv og tæt binding til søjlen resulterede i minimalt tab af CFTR i den ubundne fraktion og fraværet af CFTR i vaske fraktioner (figur 2, bane 3, 5, og6). Det eluerede protein havde en renhed på> 90%, anslået af Coomassie-farvede SDS-PAGE-geler og ved hjælp af densitometri af CFTR og kontaminerende bånd. Gelpermeationschromatografi (GPC) adskilt LPG-oprenset CFTR fra lavmolekylære stoffer (figur 4, nederste panel).
Protokollen for CFTR-rensning under anvendelse af DDM giver renhed på omkring 60% og udbytte på omkring 50 ug / L (figur 3). Elektronmikroskopi (EM) af negativt farvede fraktioner fra GPC eluerer ved cirka 10 ml (Figur 4) viste, at DDM-oprenset CFTR indeholder aggregater af 20-30 nm i diameter samt mindre partikler af 10 nm i diameter (data ikke vist). Det er muligt, at små aggregater reversibelt kan forbinde og adskille ultrafiltrering med en 1 MDa cut-off filter undladt at fjerne EM-påviselige aggregater. LPG-renset materiale ikke adsorberes til en glød-afladet gitter, blev derfor undersøgt ved cryo-EM for ufarvede fraktioner. Dette viste,en meget homogen partikel population af en relativt lille størrelse (6-8 nm diameter, data ikke vist).
Endelig blev ATPase-aktivitet af de oprensede proteiner målt (figur 5). Som medlem af ABC-proteinfamilien, CFTR har to nukleotid-bindende domæner (NBDs) er i stand til binding og / eller hydrolyse af ATP. Dataene viser, at det oprensede protein var ikke i stand til at hydrolysere ATP i LPG-opløseliggjorte tilstand og viste svag ATPase-aktivitet i nærvær af DDM (fig. 5, ikke udfyldte søjler). Efter tilsætning af lipider og vaskemiddel fjernelse var ATPase-aktivitet 4 gange højere for prøver, der var blevet oprenset i DDM (13 nmol ATP / min / mg protein). Tilsætningen af lipider og fjernelse af LPG tilsvarende gendannet aktivitet CFTR, der var blevet isoleret ved anvendelse af LPG, men med en endelig lavere (1,5 nmol ATP / min / mg protein) end DDM-oprenset og rekonstitueret materiale.
Fig. 1. Overvågning niveauer af kylling CFTR i cellelysat (CL), supernatanter (S) og pellets (P) under forskellige centrifugeringstrin anvendes til mikrosom isolering og vask. SDS-PAGE-geler blev visualiseret ved hjælp af i-gel-fluorescens af GFP tag. Supernatanten efter cellebrud og centrifugering ved 14.000 xg indeholder næsten alle CFTR (herunder nedbrydningsprodukter). Ultracentrifugering ved 200.000 xg sedimenter alle fuld længde CFTR forlader nogle fragmenter i supernatanten. Ultracentrifugering ved 100.000 xg af salt vasket Mikrosomer piller næsten hele CFTR med fjernelse af yderligere nogle fragmenter.
Figur 2. Oprensning af kylling CFTR LPG ved immobiliseret metalion-affinitetskromatografi. Fraktioner blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie-farvning (øverste panel) og fluorescens-påvisning af GFP tag (nederste panel). Tracks: (1) Mikrosomer. (2) LPG-opløst mikrosomer. (3) Ubundet materiale. (4) Uopløseligt materiale. (5) & (6) 40 og 100 mM imidazol-vaske. (7) Materiale elueret med 400 mM imidazol.
Fig. 3. Oprensning af kylling CFTR i DDM ved immobiliseret metalion-affinitetskromatografi. Fraktioner blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie-farvning. Den venstre hånd panel viser fraktioner før eluering. Flere på hinanden følgende elueringsfraktionerne er vist i højre panel med CFTR iangives med pilen. Senere fraktioner beriget med en 40 kDa forurenende, som er blevet identificeret ved massespektrometri som ribosomprotein L3.
Fig. 4. Oprensning af kylling CFTR ved gelpermeationskromatografi. CFTR oprenset ved Ni-affinitetskromatografi blev koncentreret og påført på en GPC kolonne. Elueringsprofilen for CFTR (øverste panel) oprenset i buffer indeholdende LPG-14 (fuldt optrukket linie), eller DDM (stiplet linie) er overlejret. SDS-PAGE (nederste panel) viste, at CFTR elueret mellem 8 og 11 ml.
Figur 5. ATPase Aktivitety af oprensede kylling CFTR fraktioner. Protein oprenset i DDM eller LPG blev analyseret under anvendelse af en modificeret Chifflet assay 26 i nærvær af en cocktail af ATPase-inhibitorer for at eliminere enhver baggrund ATPase-aktivitet fra F-, P-og V-type ATPaser (udfyldte søjler ). Satsen for ATP hydrolyse blev også målt efter rengøringsmiddel fjernelse og lipid tilføjelse (fyldte søjler). Plottet viser middelværdi og standardafvigelse (n = 3). Forskelle mellem middelværdier for ATPase-aktivitet i nærvær og fravær af lipid, og forskellen mellem aktivitet i DDM og LPG er væsentlige til p <0,05.
Discussion
Vi har tidligere beskrevet en fremgangsmåde til overekspression af murine CFTR 14. Siden offentliggørelsen af denne protokol, har vi udtrykt og oprenset flere forskellige orthologer af CFTR bruger det samme system. Alle testede orthologer hidtil renses godt i LPG detergent, mens DDM oprensning viste mere variation på tværs af forskellige ortologer (data ikke vist). Denne fleksibilitet illustrerer styrken af gær tilgang: Det er muligt at screene mange konstruktioner med relativ hurtighed med henblik på at vælge en til et bestemt formål.
Vask gæren mikrosomer med buffer indeholdende 1 M NaCl før solubilization med DDM resulterer i en renere mikrosom forberedelse og reducerer forurenende stoffer på et senere tidspunkt. Dette trin er unødvendigt i LPG-protokollen som det endelige CFTR prøven er> 90% ren uden mikrosom vask. Endvidere oprensning i DDM kræver flere ændringer i bufferne for solubilisering ennd oprensning, nemlig tilsætning af ekstra glycerol og salt. Sammen disse tilføjelser steget betydeligt binding af DDM-opløseliggjorte protein til søjlen.
DDM oprensningsmetodik har mulighed for forbedringer, navnlig fjernelse af en 40 kDa store forurenende, at bedømt af massespektrometri, skyldes gær ribosomale subunit L3, som synes at have en forkærlighed for nikkel harpiks. Der er ikke nogen indlysende polyHis sekvens i L3 protein, men en undersøgelse af dens 3D-struktur når det er bundet til ribosomet (PDB = 1FFK) viser, at den foldede L3 underenheden har et potentiale polyHis klynge. At dette band er mindre problematisk i LPG-renset materiale kan skyldes den barskere LPG vaskemiddel.
Selvom rensning i DDM synes at være dårligere end i LPG, kan mildere rengøringsmidler såsom DDM være mere kompatible med funktionelle og strukturelle analyser og har allerede været brugt i flere røntgen crystallographic studier af membranproteiner 15-21. Desuden er vores resultater viste, at brugen af LPG fører til tab af ATPase funktion i CFTR i forhold til oprensning i DDM. Derfor vil vi anbefale LPG-baserede oprensningsprotokol til generering af CFTR hvor renhed er afgørende, for eksempel i applikationer såsom karakterisering af post-translationelle modifikationer, eller i genereringen af antistoffer, LPG-baseret protokol ville blive valgt . På den anden side i applikationer, hvor aktiviteten og fuldt native tilstand af proteinet er afgørende, foreslår vi DDM-baseret protokol som en bedre løsning.
Til slut, denne protokol beskriver en reproducerbar metode til isolering af CFTR i zwitterioniske detergent LPG-14 eller det ikke-ioniske detergent DDM. Som sådan er det indikerer en større vifte af rensning betingelser for CFTR end der tidligere har været rapporteret 10-13. Desuden milligram mængder af oprenset CFTR kan væreopnået ved anvendelse af disse procedurer, når det kombineres med en høj volumen gærvækst, såsom en 20 L fermentor og en høj kapacitet cellehøst, såsom en 6 L lav hastighed centrifugerotoren. CFTR opnås, har en spaltelig GFP tag som muliggør en nem overvågning af proteinet i forskellige biokemiske og biofysiske assays.
Beskrevet i dette manuskript (kylling CFTR-holdige plasmid eller frosne gærceller) reagens kan fås gennem cystisk fibrose Foundation (USA).
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre modstridende interesser med hensyn til dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af den amerikanske cystisk fibrose Foundation (CFF) gennem sin CFTR 3D Structure Consortium. TR blev finansieret af en britisk CF Trust studentship, og NC af en britisk BBSRC studentship. Vi anerkender vores kolleger i CFF CFTR 3D struktur konsortium for deres hjælp og rådgivning og for udformningen af codon-optimeret kylling CFTR sekvens og rensning tags.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 | |
| 2 ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 | |
| 50 ml sterile Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| Gel imaging system | BioRad | 170-808 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| E. coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Fisher | 65017 | |
| HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 | |
| Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| SCH28080 | Sigma-Aldrich | S4443 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 | |
| Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 | |
| Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 | |
| Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 | |
| Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |
References
- Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
- Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
- O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D.
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
- Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
- Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
- Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
- Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
- Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
- Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
- O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. , (2012).
- Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
- Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
- Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
- Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
- Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
- Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
- Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
- Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
- Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
- Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).
