Summary
Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.
Abstract
la traducción del ARNm juega un papel central en la regulación de la expresión génica y representa el proceso que consume energía más en células de mamífero. En consecuencia, la desregulación de la traducción del mRNA se considera que desempeñan un papel importante en una variedad de estados patológicos incluyendo cáncer. Los ribosomas también alojan chaperonas, que facilitan el plegado de polipéptidos nacientes, la función y la estabilidad de los polipéptidos recién sintetizados modulando de esta manera. Además, los datos emergentes indican que los ribosomas sirven como una plataforma para un repertorio de moléculas de señalización, que están implicados en una variedad de modificaciones post-traduccionales de polipéptidos recién sintetizados a medida que emergen del ribosoma, y / o componentes de maquinaria de traducción. En la presente memoria, se describe un método bien establecido de fraccionamiento ribosoma usando centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. En combinación con el algoritmo desarrollado "Anota" in-house este método permite la determinación directa de diferencial traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Por otra parte, este protocolo versátil se puede utilizar para una variedad de estudios bioquímicos destinados a diseccionar la función de los complejos de proteínas de ribosomas asociados, incluyendo los que juegan un papel central en el plegamiento y la degradación de los polipéptidos recién sintetizados.
Introduction
Las redes reguladoras que controlan la expresión de genes han sido ampliamente estudiados en las dos últimas décadas. La gran mayoría de estos esfuerzos de investigación centrados en la regulación transcripcional, por el que se utilizaron los cambios en los niveles de mRNA en el estado estacionario en un genoma de gran escala para determinar los llamados perfiles "de la expresión génica". Estudios recientes revelan que los niveles de mRNA en estado estacionario sólo corresponden en términos generales a la composición del proteoma 1,2, lo que indica que los mecanismos de post-transcripcionales, incluyendo la traducción del ARNm, juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica 3,4. De hecho, se ha estimado que ~ 50% de los niveles de proteína se determina en el nivel de la traducción del mRNA en fibroblastos de ratón inmortalizadas 5.
la traducción del mRNA es un proceso altamente regulado durante el cual los ARNm se traducen en proteínas a través de la acción orquestada de los ribosomas, ARN de transferencia (ARNt) y factores accesorios commonly referido como factores de conversión (TFS) 6. La síntesis de proteínas es el proceso de consumo de energía más en células de mamífero 7 y por lo tanto las tarifas de traducción de ARNm globales se ajustan para adaptarse a la disponibilidad de nutrientes y las tasas de proliferación celular 8. Además de las alteraciones en las tasas globales de traducción de ARNm, varios estímulos extracelulares (por ejemplo, hormonas y factores de crecimiento), las señales intracelulares (por ejemplo, los niveles de aminoácidos) y diferentes tipos de estrés (por ejemplo, ER-estrés) inducir cambios selectivos en las piscinas de mRNAs que son ser traducido (translatome) 6. Dependiendo del tipo de estímulo, la actividad de traducción de algunos, pero no todos los mRNAs se ven afectados drásticamente, lo que resulta en cambios en el proteoma que se requieren para montar una rápida respuesta celular 6. Se cree que estos cambios cualitativos y cuantitativos en el translatome estar mediado por la interacción entre los factores que actúan en trans (por ejemplo, 6,9. Por ejemplo, los cambios en los niveles y / o actividad de iniciación de la traducción que limita la velocidad factores eIF4E y eIF2 modulan selectivamente la traducción de las transcripciones en base a las características específicas 5'UTR 6. eIF4E y eIF2 se requieren para la contratación de mRNA y tRNA iniciador al ribosoma, respectivamente 6. Un aumento en la actividad de eIF4E refuerza selectivamente la traducción de mRNAs que albergan 5'UTRs largas y altamente estructurados incluyendo aquellos proliferación y la supervivencia de codificación de proteínas, incluyendo la estimulación de las ciclinas, c-Myc y Bcl-XL 10. A su vez, la inactivación de eIF2 conduce a la síntesis de una proteína de apagado mundial, mientras que selectivamente la regulación hasta la traducción de mRNAs que contienen tramas cortas inhibitorios aguas arriba de lectura abierta (uORFs) en sus 5'UTRs, tales como los que codifican Master Treguladores ranscriptional de la respuesta de la proteína desplegada (por ejemplo ATF4). En respuesta a diversos estímulos incluyendo nutrientes, factores de crecimiento y hormonas, el objetivo mecanicista / de mamífero de la rapamicina (mTOR) vía estimula la actividad de eIF4E mediante la inactivación de la proteína de unión 4E (4E-BP) de la familia de los supresores de traducción, mientras que la vía MAPK fosforila directamente eIF4E 6,11. A su vez, eIF2α quinasas (es decir PERK, PKR, HRI y GCN2) inhiben eIF2 fosforilando su subunidad reguladora eIF2α en respuesta a la privación de nutrientes, ER-estrés y la infección por el virus de 6,12. Las alteraciones en la actividad y / o expresión de TFS, otros componentes de la maquinaria de traducción y factores reguladores incluyendo miRNAs se han observado en varios estados patológicos incluyendo cáncer, síndromes metabólicos, trastornos neurológicos y psiquiátricos, y las enfermedades renales y cardiovasculares 13-19. Colectivamente, estos datos indican que el Me traslacionalcanismos desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular y que su abrogación juega un papel central en la etiología de diversas enfermedades humanas.
En la presente memoria, se describe un protocolo para fraccionamiento de polisomas por la densidad de centrifugación en gradiente de sacarosa en células de mamífero, que se utiliza para separar los polisomas de monosomas, subunidades ribosómicas y las partículas de ribonucleoproteína mensajero (mRNPs). Esto permite la discriminación entre traducida de manera eficiente (asociado con polisomas pesados) de mal traducidos (asociado con polisomas luz) mRNAs. En este ensayo, los ribosomas se inmovilizan en el ARNm usando inhibidores de elongación de la traducción tales como cicloheximida 20 y extractos citosólicos se separan en 5-50% de sacarosa lineal gradientes de densidad por ultracentrifugación. Fraccionamiento subsiguiente de gradientes de sacarosa permite el aislamiento de ARNm de acuerdo con el número de ribosomas que se unen a. ARN extraído de cada fracción se puede entonces utilizar para determinarcambios en las distribuciones de los ARNm de todo el gradiente entre diferentes condiciones, por lo que aumenta la eficiencia de traducción de la parte superior a la parte inferior del gradiente. Transferencia Northern o la transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QRT-PCR) se utilizan para determinar los niveles de ARNm en cada fracción.
Alternativamente, las fracciones que contienen polisomas pesados (por lo general más de 3 ribosomas) se reúnen y los niveles de mRNA polisomas asociados a todo el genoma se determinan utilizando microarrays o profunda-secuenciación. Es de suma importancia destacar que los niveles de ARNm polisoma asociada son, además de la traducción, afectado por mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales que influyen en los niveles de ARNm citosólicas 21. Por lo tanto, para determinar las diferencias en la traducción a partir de datos de todo el genoma de mRNA polisomas asociados, es necesario corregir los efectos de los pasos en la vía de la expresión de genes que se encuentran aguas arriba de traslaciónción 21. Para permitir una corrección tal, ARN citosólica se prepara en paralelo con ARN de polisomas-asociada de cada muestra y los niveles de mRNA en estado estacionario en todo el genoma se determinó 21. Actualmente, la llamada (TE) marca "traducción-eficiencia" (es decir, el log-ratio entre los datos de ARNm polisoma asociada y los datos de ARNm citosólicas) se emplea a menudo para corregir los efectos de los cambios en los niveles de mRNA citosólicas sobre la eficiencia de traducción de un dado ARNm 22. Sin embargo, el uso de puntuaciones de TE para identificar traducción diferencial se asocia con un número importante de resultados positivos falsos y negativos falsos debido a una propiedad matemática de las puntuaciones TE comúnmente se hace referencia como correlación espuria 27. De hecho, un estudio de series de datos procedentes de múltiples laboratorios indicaron que tales correlaciones espurias parecen ser inevitables cuando se analizan los cambios en las translatomes 23. Esto impulsó el desarrollo del "análisis del diferencial de tr anslation "(Anota) algoritmo, que no adolezca de los inconvenientes antes mencionados 23. Durante Anota-análisis de un modelo de regresión se utiliza para derivar medidas de la actividad de traducción independientes de los niveles de ARN citosólicos. Tales medidas se comparan entonces entre las condiciones y las estadísticas se calcula. El usuario tiene la opción de aplicar un método de varianza contracción, lo que mejora la potencia estadística y reduce la aparición de resultados falsos positivos en los estudios con pocas repeticiones 24. Significativamente, se ha demostrado recientemente que las perturbaciones en la translatome capturados por Anota, pero los resultados no TE, se correlacionan con los cambios en el proteoma 25. Por lo tanto, se recomienda aplicar el análisis Anota para la identificación de los cambios en la traducción en un genoma de gran escala. Si bien los fundamentos teóricos del algoritmo Anota se discutieron en detalle previamente 21,23,26, aquí se centra en la manera de aplicarlo en la práctica.
ve_content "> Además de estudiar los cambios en la actividad de la traducción del ARNm en la célula, este protocolo de fraccionamiento ribosoma se puede utilizar para aislar y caracterizar bioquímicamente y funcionalmente ribosoma y complejos de proteínas polisomas-asociado. Este enfoque ha sido desplegado con éxito en el pasado para identificar complejos que regulan la estabilidad de los polipéptidos recién sintetizados 27 y / o están involucradas en la fosforilación de los componentes de la maquinaria de traducción. también se discutirán brevemente Esta aplicación del método de fraccionamiento de polisomas.Protocol
1. Preparación de sacarosa gradiente
- Preparar 100 ml de 60% (w / v) de solución de sacarosa en ddH 2 O. Solución debe ser filtrada a través de un filtro de 0,22 micras para evitar la obstrucción de la tubería durante la etapa de fraccionamiento (paso 3.5).
- Preparar 5 ml de 10x tampón de gradiente de sacarosa: 200 mM de HEPES (pH 7,6), 1 M de KCl, 50 mM de MgCl 2, 100 mg / ml de cicloheximida, 1x cóctel inhibidor de proteasa (sin EDTA), 100 unidades / ml de inhibidor de RNasa.
- Uso de la solución de 60% preparada como se describe en el paso 1.1, hacer 40 ml de 5% y soluciones de sacarosa 50% en tampón 1x gradiente de sacarosa.
- Utilice el bloque de Marker se suministra con el fabricante de gradiente para marcar el punto medio llena en cada tubo de ultracentrifugación polialómero para todas las ocasiones (6 tubos de ultracentrifugación en total). Utilizando el dispositivo de capas proporcionado con el fabricante de gradiente, añadir solución de sacarosa al 5% hasta que alcanza el punto medio completo. A continuación, añadir la solución de sacarosa al 50% desde el fondo hasta la interfas entre las dos soluciones alcanza el punto medio llena. Especial cuidado se debe tomar durante este paso para que los gradientes son tan similares como sea posible, ya que esto es esencial para obtener una alta reproducibilidad (véase más adelante).
- Selle tubos con tapas zonales de tasas proporcionadas con el fabricante de la pendiente y la transferencia de los tubos sellados para el soporte del tubo de la máquina de gradiente.
- Ejecutar el fabricante de gradiente para obtener un 5% a 50% de gradiente lineal. Se formarán 6 degradados lineales en pocos minutos por la rotación a alta ángulo de inclinación.
Nota: los gradientes de sacarosa se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C durante 6 meses.
2. El aislamiento y la sedimentación de polisomas
- Dependiendo del tipo de célula, las células de semillas en 1-5 15-cm de platos de Petri (~ 15 x 10 6 células) por lo menos un día antes de la lisis. En el día de los experimentos las células deben ser ~ 80% de confluencia. Nota: confluencia óptima es crítica porque las tasas de traducción y de proliferación son directamenteproporcionales 8, y por lo tanto deben ser analizados polisomas en células en proliferación activa (es decir, las tarifas de traducción se reducirá significativamente en más células confluentes mientras que bajo la confluencia de las células puede no proporcionar suficiente material para su posterior análisis). Las excepciones de esta regla se pueden hacer si, por ejemplo, el experimentador está interesado en estudiar el efecto de la inhibición por contacto sobre la traducción. Sin embargo, las células no deben ser mantenidos bajo sobre condiciones confluyentes durante demasiado tiempo, ya que esto puede tener efectos involuntarios en la translatome.
Si se requiere la transfección, la mayoría de los kits disponibles comercialmente no afectan a los niveles de polisomas. Debido a que en el día de la transfección las células debe ser de 80-90% de confluencia, se recomienda para propagar las células 24 horas después de la transfección y aislar polisomas 48 horas después de la transfección de células de ~ 80% de confluencia. - Se incuban las células con cicloheximida a una concentración final de 100 g / ml en medio de crecimiento durante 5 min a 37 ° C y 5% De CO 2; y lavar las células dos veces con 10 ml de helado 1x PBS que contenía 100 mg / ml de cicloheximida. La cicloheximida es un inhibidor de la elongación de la traducción que "congela" ribosomas en el ARNm, evitando de ese modo ribosoma escurra 20.
- Raspar suavemente las células en 5 ml de helado de PBS 1x conteniendo 100 mg / ml de cicloheximida y recogerlas en un tubo de 50 ml. Es importante que este paso se lleva a cabo razonablemente rápido como dejando a las células en hielo durante un período prolongado de tiempo disminuirá drásticamente la calidad de la preparación de polisomas.
- Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Desechar las células sobrenadante y resuspender en 425 l de tampón hipotónico [(5 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM de MgCl 2, 1,5 mM de KCl y 1x cóctel inhibidor de proteasa (EDTA libre)], añadir 5 l de 10 mg / CHX ml, 1 l de DTT 1 M, 100 unidades de inhibidor de RNAsa y agitar durante 5 segundos seguido de la adición de 25 l de 10% Triton X-100 (concentración final 0,5%) y 25 l de 10% desoxicolato de sodio (concentración final 0,5%) y agitar durante 5 seg. Debido a la hinchazón de células, el tampón hipotónico interrumpirá la membrana plasmática, mientras que las condiciones detergente suave se utilizan para solubilizar citosólica y ribosomas del retículo endoplasmático asociada sin interrumpir la envoltura nuclear.
- Lisados centrifugar a 16.000 xg durante 7 min a 4 ° C y el sobrenadante de transferencia (~ 500 l) a un tubo nuevo previamente enfriado 1,5 ml. Medir la DO a 260 nm para cada muestra usando un espectrofotómetro y mantener el 10% del lisado como entrada que se utilizará para determinar los niveles de mRNA en estado estacionario citosólicas. Diluir la entrada a 750 l de ARNasa H 2 O gratis, añadir 750 l de Trizol y congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido.
- Transferir los tubos de ultracentrífuga que contienen gradientes de sacarosa en cubos del rotor pre-enfriados. Eliminar 500 l desde la parte superior de gradientes de sacarosa. Ajuste lisados de modo que contengan la misma OD (10-20 DO a 260 nm) en 500 l de tampón de lisis (descrito en el paso 2.5) y cargarlos en cada gradiente de sacarosa.
Nota: Es importante cargar inmediatamente lisados en los degradados, ya que esto mejorará críticamente la calidad de las preparaciones polisomas. - Pesar y equilibrar cada gradiente antes de la ultra-centrifugación.
- Centrifugar a 222.228 xg (36.000 rpm), durante 2 horas a 4 ° C utilizando rotor SW41Ti.
Nota: Con el fin de no perturbar gradientes de sacarosa, opción de freno "bajo" debe ser seleccionado.
3. Polisomas Fraccionamiento y Extracción de ARN
- Prepare el colector de fracciones mediante la limpieza con agua libre de ARNasa caliente que contiene RNasa ZAP (unos sprays). Repita este paso con conexión RNAsa sólo agua tibia. Cambie la lámpara UV y espere a que aparezca la luz verde.
- Retire con cuidado los tubos desde el rotor y colocarlos en hielo. Encienda el ordenador, bomba, detector UV y colector de fracciones. Coloque la bomba en 3 ml / min y filL el tubo con la solución de persecución [60% (w / v) de sacarosa que contiene 0,02% (w / v) de azul de bromofenol] hasta que llega a la aguja. Asegúrese de ver al menos una gota que sale de la aguja, y cerciorarse de que no haya burbujas se introducen en la jeringa de la bomba o el tubo.
- Colocar tubos de 2 ml en un colector de fracciones. Inicie el programa de análisis y ajuste de sensibilidad a + / - 10 MeV. Ajuste "base de tiempo" a 100 seg.
- Coloque cada tubo de ultracentrifugación en el detector UV mientras se asegura de que la sonda está en la posición ortogonal. Perforar el tubo con la aguja girando la perilla debajo del soporte de tubo.
- Ajuste la bomba a 1,5 ml / min y recoger el ajuste del tiempo de 30 segundos en el colector de fracciones (esto se traducirá en ~ 750 l de cada fracción) fracciones. Ponga la bomba en la posición de "mando a distancia", inicie el colector de la bomba y de la fracción, y al mismo tiempo empezar a grabar usando el trazador DAQ. Esto iniciará un desplazamiento hacia arriba de la gra sacarosadient y una detección simultánea de absorbancia UV a 254 nm. No exijáis tan pronto como la primera gota de solución de persecución cae en unos 2 ml tubo de recogida.
- Guarde el trazado en formato csv y (una vez que se completa paso 3.7), en una aplicación de hoja de cálculo, haga lo siguiente para identificar la posición de cada fracción en el perfil de absorbancia UV.:
- Seleccione la columna que contiene los valores correspondientes a la absorbancia a 254 nm (canal 0).
- Crear un gráfico de dispersión suave línea de las absorbancias.
- Establecer la unidad principal del eje X a 300 (valor obtenido dividiendo el volumen del 5% -50% gradiente de sacarosa (~ 12 ml) por el tiempo de recogida de cada fracción (30 seg).
- Añadir 750 l de Trizol en cada fracción y flash congelar las fracciones en nitrógeno líquido.
- Aislar ARN de polisomas-asociado y citosólica (desde 2,6) utilizando el protocolo de Trizol según las instrucciones del fabricante. Para aumentar la producción de ARN, proceder con precisión de ARNrecer la precipitación a -80 ° C durante 30 min o -20 ° C durante la noche.
Nota: Debido a la cantidad de ARN se precipitó a partir de fracciones polysomal puede no ser claramente visibles, se recomienda añadir soporte. Añadir 1 l de soporte al tubo antes de la etapa de precipitación de ARN durante el protocolo de Trizol. - Determinar qué fracciones corresponden al ARNm asociado con> 3 ribosoma (utilizando el enfoque descrito 3.6) y piscina para estas fracciones. Utilice el kit de ARN de limpieza para realizar la limpieza de ARN polisomas asociados y citosólica combinado (de 2,6). Enviar las muestras a un centro para determinar los niveles de mRNA de todo el genoma utilizando microarrays o profunda-secuenciación.
Si la traducción de los ARNm específicos deben ser supervisados por RT-qPCR, se recomienda el uso de 500 ng de ARN (de las fracciones reunidas que contienen> 3 ribosomas o ARN total) para sintetizar ADNc.
Nota: los ARNm asociados con> 3 ribosomas se fija arbitrariamente para representar ARNm traducidas de manera eficiente y contener más de 80% de recién sintetizarpolipéptidos de tamaño 28,29. Incluyendo fracciones correspondientes a la luz (1-2), medio (2-3) y polisomas pesados (> 3) sería ventajoso, pero estos aumentar el número de las muestras por 2 veces (4 vs 2 por condición) y por lo tanto la coste del experimento. A pesar de que se anticipa que la disminución en el costo de análisis profundo-y secuenciación de microarrays en el futuro, debería favorecer el último enfoque, se aconseja que durante la validación, la distribución de ARNm individuales se controla en cada fracción.
4. Análisis de todo el genoma de mRNA Traducción
- Instale R, bioconductor y el paquete Anota:
- Instale R (descarga desde r-project.org) y comenzar un R-sesión.
Nota: R es disponible para todos los sistemas operativos y Anota se ejecutará en todos ellos. - Instale bioconductor (bioconductor.org). Código R se interpreta a través de la (por ejemplo, la consola de R R-terminal en Windows - que se puso en marcha por double clic en el acceso directo de R). Bioconductor se instala escribiendo (en el R-terminal):
fuente ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite () - Instale el paquete bioconductor Anota (y del paquete qvalue que Anota requiere) escribiendo (en el R-terminal):
fuente ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite (c ("Anota", "qvalue")) - Prueba de que el paquete se ha instalado correctamente y abrir el manual Anota escribiendo (en el R-terminal):
biblioteca ("Anota")
viñeta ("Anota") - Nota: La ayuda adicional para todas las funciones que se utilizan en el paquete Anota se puede encontrar ya sea en la página web Anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) o mediante el uso de la función de ayuda en R. Por ejemplo, para obtener ayuda sobre la función anotaPerformQc ir a la R-terminal y tipo (tenga en cuenta que esto sólo funciona cuando el paquete Anota se ha cargado):
biblioteca ("Anota") # carga el paquete Anota
? AnotaPerformQc # abre la ayuda para esta función
- Instale R (descarga desde r-project.org) y comenzar un R-sesión.
- Importar datos a R:
- Preparar los datos de expresión para el análisis. Los datos deben ser pre-procesados (por ejemplo, normalizado y de calidad controlada) con respecto a la técnica que se utilizó para medir los niveles de mRNA. Los valores de entrada deben conectarse transformaron, más común es log2. Compilar una tabla con los datos de todas las muestras de ARN polisoma asociada y una para todas las muestras de ARN citosólicos. La primera columna debe contener el gen de identificadores seguidas de una columna de datos por muestra; la primera fila debe incluir los nombres de las muestras. Es fundamental que las tablas tienen orden de la muestra idénticos y orden de genes idénticos. Guarde los archivos como archivos de texto delimitados por tabuladores llamados "myPolysomeData.txt" y "myCytosolicData.txt".
- En este ejemplo dos clases de muestra se utilizan (de control o enfermo) con 3 réplicas por clase, generando de ese modo 6 muestras con este fin: C1, C2, C3, D1, D2, D3 en ambos los archivos myCytosolicData.txt y myPolysomeData.txt. Anota requiere al menos 3 réplicas por condición cuando hay dos clases de prueba. Estos deben ser réplicas biológicas independientes.
- Cree un directorio que contiene los archivos de entrada de datos (myPolysomeData.txt y myCytosolicData.txt). Abrir R desde este directorio. En Windows / Mac esto se puede hacer copiando un R-atajo en este directorio y el lanzamiento de R utilizando este método abreviado (el trabajo directo también se puede cambiar utilizando los menús desplegables).
- Cree un archivo denominado myCode.R dentro del directorio recién creado y abrirlo con un programa de edición de texto. Escribir el código en este archivo.
- Para cargar los datos en R escribir el siguiente código al archivo myCode.R (recuerde que debe volver a guardar el archivo después de cada adición de código). Abajo hay una s paso atep explicación del código, pero todo el código también se podría escribir desde la fuente y la función de fuente (que se ejecuta el código, ver más abajo) se utiliza sólo una vez:
# # Esto carga la biblioteca Anota
biblioteca (Anota)
# # Esto carga los datos de entrada en R
dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", header = TRUE, row.names = 1, sep = " t"))
dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", header = TRUE, row.names = 1, sep = " t")) - Ejecute el código en R escribiendo directamente en el terminal R:
fuente ("myCode.R") - Compruebe que los datos se han cargado correctamente escribiendo (en el R-terminal):
cabeza (dataCyto) # mostrará la parte superior de la tabla dataCyto
cabeza (dataPoly)
- Identificación de genes diferencialmente traducidos:
- Generar un vector que describelas categorías de la muestra (un vector es un tipo de objeto en R). Este vector debe reflejar el orden de la muestra en el myPolysomeData.txt y myCytosolicData.txt de manera que todos los tres objetos tienen un orden idéntico de las muestras. El vector se utilizará cuando se den instrucciones Anota sobre los que las muestras para comparar. Agregue lo siguiente al archivo myCode.R:
# # Tenga en cuenta que las muestras replicadas tienen clase muestra idéntica
# # Descripciones (por ejemplo, "C" o "D") en este vector.
myPhenotypes <- C ("C", "C", "C", "D", "D", "D") - Realizar el control de calidad del conjunto de datos. Hay una serie de medidas de calidad que necesitan ser evaluado antes de Anota se puede utilizar para el análisis. Estos se discuten en detalle en el manual Anota. Agregue este código al myCode.R archivo y guardarlo:
anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)
anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) - Ejecute el código escribiendo en R-terminal:
fuente ("myCode.R")
Esto va a generar una serie de archivos de salida, que puede ser examinada como se indica en el manual Anota. - Identificar genes diferencialmente traducidos. Las muestras se compararán según el orden alfabético de los nombres suministrados al parámetro "phenoVec" (es decir, el "myPhenotypes" vector) a menos que sean especificados por el usuario (con el parámetro "contrastes"). Agregue el código siguiente para myCode.R archivo y acabado mediante el comando "source" dentro de la R-terminal como se describe más arriba:
anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) - Utilice la ayuda para anotaGetSigGenes para entender cómo el output se formatea y ver cómo elegir las categorías de muestras para comparar escribiendo (en el R-terminal):
? anotaGetSigGenes - Genes del filtro y de la trama que se traducen diferencialmente. Existen múltiples umbrales que se pueden aplicar dentro de la función y el uso de anotaPlotSigGenes ayuda será simplificar una combinación personalizada de dichos umbrales. Para seleccionar los genes analizados de forma fiable aplicar el minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) y (0.01) slopeP ajustes.
Nota: Además, los ajustes se aplican a RVM 23,26,30 tasa de falsos descubrimiento (FDR) (0,15) y retire los cambios (log2 [1,5]) puede por ejemplo utilizarse para identificar genes diferencialmente traducidos. Otros filtros tales como "selDeltaPT" pueden ser útiles para un filtrado más estricta (por ejemplo establecer selDeltaPT con el log2 [1,5]). También es necesario precisar que la comparación debe ser filtrada (utilizando el argumento selCont). Aplicar los ajustes descritos añadiendo la siguiente línea a la myCode.Rarchivo:
anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) - Efectuar el análisis mediante el uso de la función de fuente de la R-terminal como se ha descrito anteriormente. Esto también va a generar una salida gráfica. El examen de esta salida es un buen punto de partida para evaluar el desempeño de los análisis e identificar los cambios necesarios en la configuración.
- Generar una tabla de salida. Agregue el código siguiente al archivo myCode.R:
write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = "MySignificantGenes.txt", sep = " t") - Ejecute el código utilizando la función de fuente en el R-terminal. Las columnas de la tabla resultante se explican en la ayuda para la función anotaPlotSigGenes.
- Generar un vector que describelas categorías de la muestra (un vector es un tipo de objeto en R). Este vector debe reflejar el orden de la muestra en el myPolysomeData.txt y myCytosolicData.txt de manera que todos los tres objetos tienen un orden idéntico de las muestras. El vector se utilizará cuando se den instrucciones Anota sobre los que las muestras para comparar. Agregue lo siguiente al archivo myCode.R:
Representative Results
mTOR es un importante nodo de la red celular que coordina las tasas globales de síntesis de proteínas con la disponibilidad de nutrientes 19. la traducción del ARNm está regulada principalmente en la etapa de iniciación limitante de la velocidad 6. La proporción de los ribosomas que participan en polisomas se correlaciona positivamente con las tasas de iniciación de la traducción 28. Se presenta un ejemplo de aplicación del método de fraccionamiento de polisomas para investigar el papel de la señalización de mTOR en la mediación de los efectos de la insulina sobre la traducción del ARNm. Para este fin, las células de cáncer de mama humano MCF7 se mantuvieron en suero bajo y luego se estimularon con insulina sola o en combinación con el inhibidor de mTOR-sitio activo Torin1. Las células no estimuladas que se mantuvieron continuamente en suero bajo, sirvieron como control. mRNPs, monosome (80S) y fracciones de polisomas se separaron usando el método de fraccionamiento de polisomas. Relativa a las células de control, la insulina inducida por un aumento en la absorbancia en fracciones de gradiente correspondientesa polisomas, acompañado por una disminución concomitante en la absorbancia en la fracción monosome (Figura 1). Estos hallazgos muestran que la proporción de los ribosomas que participan en polisomas se incrementa en la insulina tratado en comparación con las células de control, por lo tanto, lo que indica que, como se esperaba, la insulina estimula las tasas de iniciación de la traducción globales. Torin1 invirtió los efectos de la insulina sobre los perfiles de absorbancia (Figura 1), corroborando así los resultados que la señalización de mTOR desempeña un papel importante en la mediación de los efectos de la insulina sobre la maquinaria de traducción 19.
Sobre la base de un principio que las incongruencias en la preparación de gradiente no se pueden evitar, se han planteado dudas en cuanto a la reproducibilidad de los datos obtenidos mediante el método de fraccionamiento polysome 22. Para probar empíricamente esta cuestión potencialmente perjudicial, citosólicas y ARN polisomas asociados pesada (ARNm asociado con 4 o más ribosomas) fueron aislados a partir de células MCF7 tratados con insulina sola o en combinación con la insulina Torin1 de 4 réplicas biológicas independientes (Figura 2). Los efectos de la insulina y Torin1 sobre la composición de citosólica y pesado mRNA polisomas asociados en cada repetición se determinó en un genoma de gran escala utilizando un enfoque de microarrays. Para determinar la reproducibilidad del método de fraccionamiento polisomas se aplicó el análisis de componentes principales (ACP). Este análisis mostró que las muestras que pertenecen a cada condición fueron fuertemente posicionados dentro de los dos primeros componentes, mientras que las diferentes condiciones fueron bien separados (Figura 2). Estos resultados muestran que el método de fraccionamiento polysome como se describe aquí es altamente reproducible y, por tanto, adecuado para estudiar los cambios cuantitativos y cualitativos en la traducción a nivel de todo el genoma.
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Figura 1. Perfiles polysomal que muestran los efectos de la privación de suero, la insulina y la señalización de mTOR en la traducción global en células MCF7. Células MCF7 fueron privados de nutrientes (mantenido en 0,1% de FBS) durante 16 horas y se trataron con 5 nM de insulina (Ins) solo o en combinación con 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) durante 4 horas. Las células no tratadas que fueron privadas de forma continua de nutrientes (0,1% de FBS) se utilizaron como control. Los extractos citosólicos correspondientes se sedimentaron por centrifugación en gradientes de sacarosa 5-50%. Subunidades ribosomales Gratis (años 40 y 60), monosomas (80S) y el número de ribosomas en las fracciones polisomas se indican.
Figura 2. Datos pangenómicos obtenidos utilizando polysome de perfiles es altamente reproducible. células MCF7 fueron tratados como en la Figura 1. citosólica y polisomas asociados a ARN (> 3 ribosomas) se extrajo a partir de 4 réplicas biológicas independientes y sus niveles de mRNA de todo el genoma se determinaron utilizando matrices GeneTitan (Affymetrix). PCA se utilizó para evaluar la reproducibilidad de los datos resultantes. Se muestran los dos primeros componentes de la PCA para todos los tratamientos (T1 = Torin 1; ctrl = control; Ins = insulina), origen del ARN (C = citosólica; P = polisomas asociados) y se replica. Las muestras de la misma condición y origen ARN están estrechamente posicionadas que indica una alta reproducibilidad.
Discussion
En este artículo se describe un protocolo de fraccionamiento polysome bien establecida seguida de un método de análisis de desarrollo propio para la captura de los cambios cualitativos y cuantitativos en la actividad de traducción en un genoma de gran escala en las células de mamíferos. Para completar con éxito este protocolo especial se debe prestar atención a: 1) la confluencia de células (como las tasas de proliferación y disponibilidad de nutrientes se correlacionan con la actividad de la traducción del ARNm y pueden afectar a la composición de la translatome, confluencia celular debe ser consistente a través de repeticiones y las condiciones experimentales), 2) la lisis celular rápida (A pesar de la presencia de cicloheximida y los inhibidores de RNAsa en tampones de lisis debe ser rápida y extractos celulares deben ser superpuestos en gradientes de sacarosa inmediatamente después de la lisis para evitar la degradación del ARN y la disociación de polisomas), 3) la preparación de degradado (para asegurar alta reproducibilidad de datos, gradientes de sacarosa deben prepararse usando el fabricante del gradiente y espeatención social debe tener cuidado al manipularlos).
Además de estudiar los cambios en la actividad de traslación, este protocolo se puede utilizar para aislar los complejos de proteínas de ribosomas asociados y establecer sus funciones fisiológicas. Para este fin, los niveles y el estado de fosforilación de diversas proteínas de ribosomas asociados se pueden determinar por precipitación con TCA, seguido por transferencia Western, mientras que los complejos de proteínas asociadas ribosoma-pueden ser inmunoprecipitada a partir de fracciones del gradiente y se analizaron por transferencia de Western o la espectrometría de masa. Un inconveniente de esta técnica es que el método de fracción de gradiente lento podría dar lugar a la disociación de las proteínas incluso estrechamente unidas cuya cinética de unión se encuentran en rápida asociación / disociación. Los factores asociados a polipéptidos recién sintetizados son ejemplos típicos. Polipéptidos recién sintetizados emergentes formar los ribosomas se pueden inmovilizar en los complejos de proteínas asociadas con ribosomas utilizando reticuladores químicos, tales como 3, 3'-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Este enfoque reveló que el receptor para C activada quinasa 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal quinasa (JNK) / factor de elongación de la traducción eucariota 1A2 (eEF1A2) complejo regula la degradación de los polipéptidos recién sintetizados en respuesta al estrés 27. Además, se utilizó una metodología similar en estudios que muestran que la proteína quinasa C bII (PKCbII) se reclutó a los ribosomas por RACK1 32 y que la activación de complejo mTOR 2 (mTORC2) se produce en los ribosomas en los que fosforila polipéptidos recién sintetizados AKT y regula su estabilidad 33,34.
Las principales limitaciones del método de fraccionamiento de polisomas seguido por análisis Anota son: 1) el requisito para un número relativamente alto de células (~ 15 x 10 6 células), 2) la falta de información de posición con respecto a la localización de ribosoma en una molécula de ARNm dado, y 3 cuestiones relacionadas con la hetero) celular y molecularheterogeneidad de los tejidos normales y tumorales. Los temas relacionados con el número de células requerido pueden ser resueltos mediante la alineación de los picos de los espectros de absorbancia correspondientes a monosomas (80S) de células cuyas cantidades están limitando con los obtenidos a partir de células de alta abundancia (por ejemplo, células HeLa) 35. Técnica de perfiles de ribosoma (ver más abajo) se puede utilizar para determinar la posición exacta del ribosoma en una molécula de ARNm dado, mientras que se discuten los problemas relacionados con los efectos de confusión de la heterogeneidad del tejido sobre la interpretación de los cambios en la expresión génica obtenidos a partir de sistemas complejos, tales como tejidos humanos en detalle en una publicación de Leek y Storey 36.
Recientemente, una novela ribosoma de perfiles técnica fue desarrollada, en el que fragmentos de ribosomas protegida (PRSA) se generan por tratamiento con ARNasa I y analizados por secuenciación profunda-22. Esta técnica permite la determinación de la posición ribosoma en una única resolución de nucleótidos, proporcionando de este modo hasta ahora UNPRconocimientos sobre la biología ecedented ribosoma. Por ejemplo, perfiles de ribosoma se puede utilizar para la determinación de la densidad de ribosoma en una molécula de ARNm dado o la identificación de los elementos que influencia las tasas de inicio de traducción, tales como los sitios de iniciación alternativos, en los codones de iniciación no agosto y elementos reguladores tales como uORFs. Sin embargo, hay varias limitaciones metodológicas que restringen la capacidad de los perfiles de los ribosomas para estimar con precisión la eficacia de traducción del ARNm. Estos incluyen sesgos independientes introducidas por fragmentación aleatoria y digestión con RNAsa I, sesgos introducidos por inhibidores de la traducción (por ejemplo, inhibidores de elongación tales como la emetina y cicloheximida son propensos a inducir la acumulación de ribosomas en los sitios de iniciación de traducción), un gran número de resultados positivos falsos y negativos falsos asociados con puntuaciones de TE, así como su imprecisión en la predicción de las lecturas que se originan a partir de ARNm que codifican la proteína 37. Quizás lo más importante, mientras queperfilado ribosoma permite la identificación directa de la posición ribosoma en una molécula de ARNm dado, el número de ribosomas que se asocia con un ARNm dado se estima indirectamente por la normalización de las frecuencias de lee en rPFS (ARNm al ribosoma-asociado) sobre los observados en los ARNm azar fragmentados (Total ARNm). Por ejemplo, en un entorno sencillo donde cuatro moléculas de ARNm "B" (BA, BB, BC y Bd) están ocupados por cuatro ribosomas en las posiciones 1, 2, 3 y 4, un defecto inherente de la técnica de perfiles ribosoma no permitirá una distinción entre un escenario en el que todos los 4 ribosomas asocian sólo con un ARNm de Ba en las posiciones 1, 2, 3, y 4 y un escenario en el Ba, Bb, Bc y Bd ARNm son cada ocupadas por un solo ribosoma en la posición 1, 2 , 3, y 4, respectivamente. En contraste, durante el fraccionamiento de polisomas, polisomas se conserva la integridad, permitiendo de este modo el aislamiento de piscinas de los ARNm asociados con un número definido de los ribosomas (Figura 1). Esta importacióndistinción entre hormiga fraccionamiento polisomas y perfiles ribosoma sugiere que mientras que el método anterior puede ser utilizado para comparar directamente los ARNm en mRNP, luz y polisomas fracciones pesada, el último método será probablemente fallará a captar los cambios en el translatome que son causados por los mRNAs que la transición de iluminará para polisomas pesados, mientras que sobreestimar la contribución de los que pasar de la fracción mRNP a polisomas pesados. La importancia biológica de estas discrepancias entre los métodos anteriormente mencionados es subrayada por un gran cuerpo de datos que muestran que la activación de la traducción de un subconjunto de ARNm tales como los que son-eIF4E sensible, la transición de la luz a polisomas pesados, mientras que otros, tales como los que albergan elementos 5'TOP, son reclutados a polisomas pesados directamente de charcos de ribosomas libres mRNA 6. Curiosamente, la vía mTOR se ha demostrado que modulan de forma concomitante traducción de "eIF4E-sensible" y 5'TOP ARNm 11. Por lo tanto, las diferencias metodológicas que se describen anteriormente pueden explicar la aparente discordancia de la conclusión entre los estudios utilizando ribosoma de perfiles de 38,39 y fraccionamiento polisomas 24 para evaluar los efectos de la inhibición de mTOR en el translatome.
En conclusión, el fraccionamiento de polisomas y perfiles de ribosoma son métodos complementarios que proporcionan principalmente información sobre el número de ribosomas asociados con el ARNm y la posición del ribosoma en el ARNm, respectivamente. Es importante destacar que, a pesar de las deficiencias y ventajas de estos métodos, sigue siendo esencial que los datos de todo el genoma obtenidos por ambos procedimientos se analizan de manera adecuada y funcional y bioquímico validados.
Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (subvención CIHR MOP-115195) y FRQ-S a la misma, que es también un receptor CIHR Premio Joven Investigador de; y el Consejo Sueco de Investigación y la Sociedad Sueca del Cáncer de OL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Biobasic | HB0264 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | VWR | CABDH4532 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Biobasic | DB0058 | |
| Tris | Biobasic | TB0196 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9515 | RNA precipitation carrier |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1988 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 04693132001 | Tablets (EDTA-free) |
| RNase inhibitor | Promega | N2515 | |
| 0.45 µm Filter System 150 ml | Corning | 431155 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | RNA cleanup kit |
| Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW41Ti Rotor Package with accessories | Beckman Coulter | 331336 | |
| Optima L100 XP ultra centrifuge | Beckman Coulter | DS-9340A | |
| ISCO fraction collector | Brandel | FC-176-R1 | |
| Type II Detector with Chart Recorder | Brandel | UA-6 | UV detector |
| Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump | Brandel | BR-A86-5 | |
| UA-6 Detector Cable | Brandel | 60-1020-211 | |
| FC-176 Communication Cable | Brandel | FCC-176 | |
| Gradient Master Base Unit | Biocomp | 108-1 | Gradient Maker |
| Gradient Forming Attachments | Biocomp | 105-914A-1R | Gradient Maker attachment |
| Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device | MicroDAQ | USB-1208FS | Analysis software attachment |
| Measurement Computing Data Acquisition Software | MicroDAQ | TracerDAQ Pro | Analysis software (Download only) |
| 10x buffer for sucrose gradients: | |||
| 200 mM HEPES (pH7.6) | |||
| 1 M KCl | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 100 µg/ml cycloheximide | |||
| 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | |||
| 100 units/ml RNase inhibitor | |||
| Lysis buffer | |||
| 5 mM Tris-HCl (pH7.5) | |||
| 2.5 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM KCl | |||
| 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] | |||
| Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text |
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