Summary
Ribosomer spela en central roll vid proteinsyntesen. Polyribosome (polysom) fraktionering av sackarosdensitetsgradientcentrifugering möjliggör direkt bestämning av effektiviteten hos enskilda mRNA på en genomet hela skalan översättning. Dessutom kan denna metod användas för biokemisk analys av ribosom-och polysom associerade faktorer såsom chaperoner och signalmolekyler.
Abstract
mRNA-translation spelar en central roll i regleringen av genexpression och representerar den mest energikrävande process i däggdjursceller. Följaktligen är dysreglering av mRNA-translation anses spela en viktig roll i en mängd olika patologiska tillstånd, inklusive cancer. Ribosomer värd även följeslagare som underlättar vikning av begynnande polypeptider och därigenom modulera funktion och stabilitet av nyligen syntetiserade polypeptider. Dessutom nya data indikerar att ribosomerna fungerar som en plattform för en repertoar av signalmolekyler som är inblandade i en mängd olika posttranslationella modifieringar av nyligen syntetiserade polypeptider som de följer av ribosomen, och / eller komponenter för translationell maskiner. Häri är en väletablerad metod för ribosomen fraktionering med hjälp av sackarosdensitetsgradientcentrifugering beskrivas. I samband med den egenutvecklade "anota" algoritm denna metod medger direkt bestämning av differential översättning av individuella mRNA på en genomet hela skalan. Dessutom kan denna mångsidiga protokoll användas för en mängd olika biokemiska studier syftar till att dissekera funktionen av ribosom-associerade protein-komplex, inklusive de som spelar en central roll vid veckning och nedbrytning av nyligen syntetiserade polypeptider.
Introduction
De reglerande nätverk som styr genexpression har studerats utförligt under de senaste två decennierna. De allra flesta av dessa forskningsinsatser inriktade på transkriptionsreglering, som innebär förändringar i steady-state mRNA-nivåer på en genomet hela skalan användes för att bestämma så kallade "genuttryck" profiler. Nyligen genomförda studier visar att steady state mRNA-nivåer bara löst motsvara sammansättningen av proteomet 1,2, vilket indikerar att de posttranskriptionella mekanismer, inklusive mRNA-translation, spelar en viktig roll i regleringen av genuttryck 3,4. I själva verket har man beräknat att ~ 50% av proteinnivåer fastställs på nivån av mRNA translation i odödliggjorda musfibroblaster 5.
mRNA translation är en starkt reglerad process under vilken mRNA översätts till proteiner via iscensatt verkan av ribosomer, transfer-RNA (tRNA) och tillbehör faktorer commonly kallad translationsfaktorer (TFS) 6. Proteinsyntes är det mest energikrävande process i däggdjursceller 7 och därför globala mRNA översättningshastigheter justeras för att tillgången på näringsämnen och cellförökningshastigheter 8. Förutom förändringar i de globala mRNA omräkningskurser, olika extracellulära stimuli (t.ex. hormoner och tillväxtfaktorer), intracellulära signaler (t.ex. aminosyra nivåer) och olika typer av stress (t.ex. ER-stress) inducerar selektiva förändringar i pooler av mRNA som är sätts (translatome) 6. Beroende på vilken typ av stimulus, translation aktiviteten hos några, men inte alla mRNA dramatiskt påverkas, vilket därigenom resulterar i förändringar i proteomet som krävs för att montera en snabb cellulär respons 6. Dessa kvalitativa och kvantitativa förändringar i translatome tros vara medierad av samspelet mellan trans-verkande faktorer (t.ex. 6,9. Till exempel förändringar i nivåer och / eller aktiviteten av hastighetsbegränsande translationsinitiering faktorer eIF4E och eIF2 selektivt modulera översättning av avskrifter utifrån de specifika 5'UTR funktioner 6. eIF4E och eIF2 krävs för rekrytering av mRNA och initiator tRNA till ribosomen, respektive 6. En ökning eIF4E aktivitet stärker selektivt översättning av mRNA hyser långa och mycket strukturerade 5'UTRs inklusive de kodnings proliferation och överlevnad stimulerande proteiner inklusive cykliner, c-myc och Bcl-xL 10. I sin tur, inaktivering av eIF2 leder till en global proteinsyntes avstängning, medan selektivt upp reglerar translation av mRNA-molekyler som innehåller korta inhibitoriska uppströms öppna läsramar (uORFs) i sina 5'UTRs, såsom de som kodar för ledar transcriptional regulatorer av det ovikta proteinsvar (t.ex. ATF4). Som svar på olika stimuli, inklusive näringsämnen, tillväxtfaktorer och hormoner, den mekanistiska / mammalian target of rapamycin (mTOR) bana stimulerar eIF4E aktivitet genom att inaktivera 4E-bindande protein (4E-BP) familj av översättningsdämpare, medan MAPK vägen direkt fosforylerar eIF4E 6,11. I sin tur eIF2α kinaser (dvs. PERK, PKR, HRI och GCN2) hämmar eIF2 genom fosforylering dess eIF2α reglerande subenhet som svar på näringsämnen deprivation, ER-stress och virusinfektion 6,12. Förändringar i verksamheten och / eller uttryck av TF, har andra komponenter i translationell maskiner och reglerande faktorer, inklusive miRNA observerats i olika patologiska tillstånd, inklusive cancer, metabola syndrom, neurologiska och psykiska störningar, samt njur-och hjärt-kärlsjukdomar 13-19. Sammantaget indikerar dessa data att omräkning migchanisms spelar en central roll för att upprätthålla cell homeostas och att deras upphävande spelar en central roll i etiologin för olika mänskliga sjukdomar.
Häri är ett protokoll för fraktionering av polysomer genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering i däggdjursceller, som används för att separera polysomerna från monosomes, ribosomala subenheter och budbärare ribonukleoprotein partiklar (mRNPs) beskrivs. Detta möjliggör diskriminering mellan effektivt översatt (i samband med tunga polysomer) från dåligt översatt (i samband med ljus polysomer) mRNA. I denna analys är ribosomer immobiliserad på mRNA med användning av översättnings töjningsegenskaper inhibitorer såsom cykloheximid 20 och cytosolextrakt separerades på 5-50% linjär sackaros densitetsgradienter genom ultracentrifugering. Efterföljande fraktionering av sackarosgradienter tillåter isolering av mRNA-sekvenser i enlighet med antalet av ribosomer de binder till. RNA extraherades från varje fraktion kan sedan användas för att bestämmaförändringar av de fördelningar av mRNA över hela gradienten mellan olika betingelser, varvid translationseffektiviteten ökar från toppen till botten av gradienten. Northern blotting eller kvantitativ omvänd transkription polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) används för att bestämma nivåerna av mRNA i varje fraktion.
Alternativt är fraktioner som innehåller tung polysomer (typiskt mer än 3 ribosomer) samman och genomet hela polysom associerade mRNA nivåer bestäms med hjälp av microarray eller djup-sekvensering. Det är av yttersta vikt att understryka att halterna av polysom associerade mRNA är, förutom översättning, påverkas av transkription och posttranskriptionella mekanismer som påverkar cytosoliska mRNA nivåerna 21. Därför är det nödvändigt att bestämma skillnader i översättning med hjälp av uppgifter genomet hela från polysom associerade mRNA för att korrigera för effekterna av stegen i genuttryck vägen som är uppströms av omräkningstion 21. För att möjliggöra en sådan korrigering, är cytosoliskt RNA utarbetats parallellt med polysom associerade RNA från varje prov och de genomet hela steady state mRNA nivåer bestäms 21. För närvarande, så kallad "translation-effektivitet" (TE) poäng (dvs. log-förhållandet mellan polysom associerade mRNA data och cytosoliska mRNA-data) används ofta för att korrigera för effekterna av förändringar i cytosoliska mRNA-nivåer om översättnings effektiviteten i en givet mRNA 22. Men med hjälp av TE-poäng för att identifiera differential översättning är förknippad med betydande antal falskt positiva och falskt negativa resultat på grund av en matematisk egenskap av TE poängen vanligtvis kallas falsk korrelation 27. Faktiskt en undersökning av data från flera labb visade att sådana falska korrelationer verkar vara oundvikligt när man analyserar förändringar i translatomes 23. Detta föranledde utvecklingen av "analys av differential tr anslation "(anota) algoritm, som inte lider av de tidigare nämnda tillkortakommanden 23. Under anota-analys en regressionsmodell används för att härleda åtgärder för translationell aktivitet oberoende av cytosoliska RNA-nivåer. Sådana åtgärder jämförs sedan mellan villkor och en statistik beräknas. Användaren har möjlighet att tillämpa en varians krympningsmetod, vilket förbättrar statistisk styrka och minskar förekomsten av falskt positiva resultat i studier med få replikat 24. Signifikant har det nyligen visat att störningar i translatome infångats av anota men ej TE-poäng, korrelerar med förändringar i proteomet 25. Därför är det starkt rekommenderat att ansöka anota analys för identifiering av förändringar i översättning på en genomet hela skalan. Även om de teoretiska grunderna för den anota algoritmen diskuterades ingående tidigare 21,23,26, här fokuserar på hur man tillämpar det i praktiken.
ve_content "> Förutom att studera förändringar i mRNA översättningsverksamhet i cellen, kan detta ribosomen fraktioneprotokoll användas för att isolera och biokemiskt och funktionellt karakterisera ribosom-och polysom-associerat protein komplex. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts i det förflutna för att identifiera komplex som reglerar stabiliteten av nyligen syntetiserade polypeptider 27 och / eller deltar i fosforyleringen av komponenterna i translationell maskiner. Denna tillämpning av polysom fraktione metoden kommer också att diskuteras kortfattat.Protocol
1. Sackarosgradient Framställning
- Bered 100 ml 60% (vikt / volym) sackaros lösning i DDH 2 O. Lösning bör filtreras genom ett 0,22 | im filter för att förhindra igensättning av slangen under fraktioneringssteget (steg 3,5).
- Bered 5 ml av 10x sackarosgradient buffert: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCl, 50 mM MgCl2, 100 | ig / ml cykloheximid, 1x proteasinhibitorcocktail (EDTA-fri), 100 enheter / ml RNas-inhibitor.
- Med användning av 60% lösning, som framställts såsom beskrivs i steg 1,1, göra 40 ml av 5% och 50% sackaros-lösningar i 1x sackarosgradient buffert.
- Använd markörblocket försedd med lutning maker att markera halvfull punkt på varje polyallomer ultracentrifuge rör för lager på lager (6 ultracentrifugeringsrören totalt). Med hjälp av skiktning anordning försedd med lutning maker, lägg till 5% sackaros lösning tills den når halvfull punkt. Lägg sedan till 50% sackaros lösning från botten tills interface mellan de två lösningarna når halvfulla punkten. Särskild försiktighet bör iakttas för så att lutningar är så lika som möjligt, eftersom detta är nödvändigt för att uppnå hög reproducerbarhet (se nedan).
- Täta rör med ränta zonal lock medföljer lutning maker och överföra de förseglade rören till röret hållaren på lutning maker.
- Kör gradienten kokare för att erhålla en linjär 5% till 50% gradient. 6 linjära gradienter kommer att bildas inom några minuter genom rotation vid hög lutningsvinkel.
Anm: sackarosgradienter kan användas omedelbart eller förvaras vid -80 ° C under 6 månader.
2. Isolering och sedimentation av polysomer
- Beroende på vilken celltyp, utsäde celler i 1-5 15-cm petriskålar (~ 15 x 10 6 celler) minst en dag före lys. På dagen av experimenten celler bör vara ~ 80% konfluenta. OBS: Optimal confluency är kritisk, eftersom översättning och spridning som är direktproportionella 8, och därför polysomer bör analyseras i aktivt celler som förökar sig (dvs. omräkningskurserna kommer att avsevärt sjunka in över sammanflytande celler medan låg confluency av celler inte kan ge tillräckligt med material för vidare analys). Undantag från denna regel kan göras om till exempel försöksledaren är intresserad av att studera effekten av kontakthämning på översättning. Dock bör cellerna inte hållas under översammanflytande förhållanden för länge, eftersom detta kan få oavsiktliga effekter på translatome.
Om transfektion krävs, de flesta av de kommersiellt tillgängliga kit påverkar inte polysom nivåer. Eftersom på dagen för transfektion cellerna måste vara från 80 till 90% sammanflytande, är det rekommenderat att fortplanta celler 24 h efter transfektion och isolera polysomer 48 h efter transfektion av cellerna ~ 80% konfluenta. - Inkubera cellerna med cykloheximid vid en slutlig koncentration av 100 ng / ml i tillväxtmedium till 5 min vid 37 ° C och 5% CO2; och tvätta cellerna två gånger med 10 ml iskall 1x PBS som innehåller 100 mikrogram / ml cykloheximid. Cykloheximid är en översättning töjning hämmare som "fryser" ribosomer på mRNA och därmed förhindra ribosomen rinna av 20.
- Skrapa cellerna försiktigt i 5 ml iskall 1x PBS som innehåller 100 mikrogram / ml cykloheximid och samla dem i en 50 ml tub. Det är viktigt att detta steg utförs någorlunda snabbt som lämnar cellerna på is under en längre tid kommer att drastiskt minska kvaliteten på polysom preparatet.
- Samla cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 425 | il av hypoton buffert [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl2, 1,5 mM KCl och 1 x proteasinhibitorcocktail (EDTA-fri)], tillsätt 5 | il av 10 mg / ml CHX, 1 | il av 1 M DTT, 100 enheter av RNas-inhibitor och vortexblanda i 5 sek följt av tillsats av 25 pl av 10% Trito^ X-100 (slutkoncentration 0,5%) och 25 pl av 10% natriumdeoxicholat (slutlig koncentration 0,5%) och vortexblanda i 5 sek. På grund av cellsvullnad, kommer hypoton buffert störa plasmamembranet, medan de milda betingelser detergent används för att solubilisera cytosoliska och endoplasmatiska retiklet associerade ribosomer utan att störa kärnhöljet.
- Centrifugera lysat vid 16.000 xg under 7 minuter vid 4 ° C och överför supernatanten (~ 500 l) till en ny pre-kyld 1,5 ml tub. Mät OD vid 260 nm för varje prov med användning av en spektrofotometer och hålla 10% av lysatet som indata som kommer att användas för att bestämma cytosoliska steady state mRNA-nivåer. Späd insignalen till 750 ^ il i RNas-fritt H2O, tillsätt 750 pl av Trizol och flash frysa i flytande kväve.
- Överför ultracentrifugrör innehåller sackaros gradienter i pre-kylda rotor hinkar. Ta bort 500 pl från toppen av sackarosgradienter. Justera lysat så att de innehåller samma OD (10-20 OD vid 260 nm) i 500 l av lyseringsbuffert (beskrivs i steg 2,5) och ladda upp dem på varje sackaros lutning.
OBS: Det är viktigt att omedelbart ladda lysat på lutningar, eftersom det kritiskt att förbättra kvaliteten på polysom preparat. - Väg och balansera varje gradient innan ultracentrifugering.
- Centrifugera vid 222228 x g (36000 rpm) under 2 h vid 4 ° C med användning av SW41Ti rötor.
OBS: För att inte störa sackarosgradienter bör "låg" broms alternativet väljas.
3. Polysom Fraktione och RNA-extraktion
- Förbered fraktionsuppsamlaren genom att rengöra den med varmt RNas fritt vatten som innehåller RNas ZAP (lite spray). Upprepa detta steg med varma RNAse gratis endast vatten. Växla UV-lampa och vänta på grönt ljus för att synas.
- Ta försiktigt bort rören från rotorn och placera dem på is. Slå på datorn, pump, UV-detektor och fraktionssamlare. Ställ pumpen vid 3 ml / min och fill slangen med den jagande lösning [60% (vikt / volym) sackaros innehållande 0,02% (vikt / vol) bromfenolblått] tills den når nålen. Se till att se åtminstone en droppe kommer ut från nålen, och förvissa sig om att inga bubblor införes i pumpen sprutan eller slangen.
- Placera 2 ml rör i en fraktionssamlare. Starta analysprogrammet och ställa in känsligheten på + / - 10 MeV. Ställ in "tidbas" till 100 sek.
- Placera varje ultracentrifugeröret i UV-detektor samtidigt se till att röret är i ortogonala läget. Stick hål på röret med nålen genom att vrida på ratten nedanför röret hållaren.
- Ställ pumpen på 1,5 ml / min och samla fraktionerna Ställa in tiden på 30 sekunder på fraktionssamlaren (detta kommer att leda till ~ 750 pl i varje fraktion). Placera pumpen i den "avlägsna läge", starta pumpen och fraktionssamlare, och samtidigt börja spela in med hjälp av DAQ spårämne. Detta startar en uppåtgående förskjutning av sackaros gradient och en samtidig detektering av UV-absorbans vid 254 nm. Sluta samla in så fort den första droppen jaga lösning faller i en 2 ml samla tub.
- Spara spårning i csv-format och (en gång steg 3.7 är klar), i ett kalkylprogram, gör följande för att identifiera placeringen av varje fraktion i UV-absorbans profilen.:
- Välj den kolumn som innehåller värden som motsvarar absorbansen vid 254 nm (kanal 0).
- Skapa en jämn linje spridningsdiagram av absorbanserna.
- Ställ in den större enhet i X-axeln till 300 (värde erhålls genom att dividera volymen av det 5% -50% sackarosgradient (~ 12 ml) med hjälp av uppsamlingstiden för varje fraktion (30 sek).
- Lägg till 750 l av Trizol i varje fraktion och blixt frysa fraktionerna i flytande kväve.
- Isolera polysom associerade och cytosolic (från 2,6) RNA med hjälp Trizol protokoll enligt tillverkarens anvisningar. För att öka RNA avkastning, fortsätt med RNA precisionpitation vid -80 ° C under 30 min eller -20 ° C över natten.
OBS: På grund av mängden RNA fälls från polysomal fraktioner inte kan synas tydligt rekommenderas att lägga till transportören. Tillsätt 1 l av bärare till röret innan RNA fällningssteget under Trizol protokollet. - Bestäm vilka fraktioner motsvarar mRNA samband med> 3 ribosomen (med hjälp av metod beskrivs 3.6) och samla dessa fraktioner. Använd RNA rensningen kit för att utföra sanering av poolade polysom associerade och cytosolic RNA (från 2,6). Skicka in prover till en anläggning för att bestämma genomet hela mRNA-nivåer med hjälp av microarrays eller djup-sekvensering.
Om översättning av specifika mRNA måste övervakas av RT-qPCR, rekommenderas att använda 500 ng av RNA (från sammanslagna fraktioner innehållande> 3 ribosomer eller total RNA) för att syntetisera cDNA.
Obs: mRNA i samband med> 3 ribosomer sätts godtyckligt att representera effektivt översatta mRNA och innehåller mer än 80% av nyligen SYNTHEstora polypeptider 28,29. Inbegripet fraktioner motsvarande ljus (1-2), medium (2-3) och tung polysomer (> 3) skulle vara fördelaktigt, men dessa kommer att öka antalet prover av 2-faldigt (4 vs 2 per tillstånd) och sålunda Kostnaden för experimentet. Trots att det förväntas att den minskade kostnaden för djupsekvensering och microarrayanalys i framtiden bör gynna det senare, är det tillrådligt att under valideringen, är fördelningen av individuella mRNA övervakas i varje fraktion.
4. Genomvid Analys av mRNA Översättning
- Installera R, bioledare och anota paket:
- Installera R (ladda ner från r-project.org) och starta en R-session.
OBS: R är tillgänglig för alla operativsystem och anota kommer att köras på dem alla. - Installera bioledare (bioconductor.org). R-kod tolkas genom R-terminal (t.ex. R-konsolen i Windows - som lanseras av dols ö klicka på genvägen R). Bioledare installeras genom att skriva (i R-terminal):
källa ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite () - Installera anota bioledare paketet (och qvalue paket som anota föreskrivs) genom att skriva (i R-terminal):
källa ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite (c ("anota", "qvalue")) - Testa att paketet har installerats och öppna anota handboken genom att skriva (i R-terminal):
bibliotek ("anota")
vinjett ("anota") - Anmärkning: Ytterligare hjälp för alla funktioner som används i anota paket kan hittas antingen vid anota webbsida (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) eller genom att använda hjälpfunktionen i R. Till exempel för att få hjälp på anotaPerformQc funktionen går till R-terminal och typ (observera att detta endast fungerar när anota paketet har laddats):
biblioteket ("anota") # laddar anota paketet
? AnotaPerformQc # öppnar hjälpen för denna funktion
- Installera R (ladda ner från r-project.org) och starta en R-session.
- Importera data till R:
- Förbered uttrycks data för analys. Data ska vara pre-behandlas (t.ex. normaliserad och kvalitetskontrollerade) i förhållande till den teknik som användes för att mäta mRNA-nivåer. Ingångsvärden måste logga omvandlas, vanligast är log2. Sammanställ en tabell med uppgifter för alla polysom associerade RNA-prov och en för alla cytosoliska RNA-prover. Den första kolumnen ska innehålla gen-identifierare följt av en datakolumn per prov; den första raden ska innehålla namn på proverna. Det är viktigt att tabellerna har identiskt prov ordning och identisk gen ordning. Spara filerna som tabbavgränsad textfiler som kallas "myPolysomeData.txt" och "myCytosolicData.txt".
- I detta exempel två provklasser används (kontroll eller sjuka) med 3 replikat per klass, och därmed generera 6 prover med denna ordning: C1, C2, C3, D1, D2, D3 i både myCytosolicData.txt och myPolysomeData.txt filer. Anota kräver åtminstone tre replikat per tillstånd när det finns två exempelklasser. Dessa bör vara oberoende biologiska replikat.
- Skapa en katalog som innehåller indata-filer (myPolysomeData.txt och myCytosolicData.txt). Öppet R från denna katalog. I Windows / Mac kan detta göras genom att kopiera en R-genväg i den här katalogen och lansera R använda denna genväg (den som arbetar direkt kan också ändras med rullgardinsmenyer).
- Skapa en fil som heter myCode.R inom den nyskapade katalogen och öppna den med en textredigeringsprogram. Skriv in koden i den här filen.
- För att ladda data till R skriva följande kod till myCode.R filen (kom ihåg att åter spara filen efter varje tillsats av kod). Nedan är en steg-för-step förklaring till koden, men all kod kan också skrivas initialt och källfunktionen (som kör koden, se nedan) används bara en gång:
# # Här laddar anota biblioteket
biblioteket (anota)
# # Detta laddar indata i R
dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt" header = SANT row.names = 1, september = " t"))
dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt" header = SANT row.names = 1, september = " t")) - Kör koden i forskning genom att skriva direkt i R-terminalen:
källa ("myCode.R") - Kontrollera att data har lästs in genom att skriva (i R-terminal):
huvud (dataCyto) # kommer att visa upp i dataCyto tabellen
huvud (dataPoly)
- Identifiering av differentiellt översatta gener:
- Generera en vektor som beskriverkategorierna prov (en vektor är en typ av objekt i R). Denna vektor bör spegla provet ordning i myPolysomeData.txt och myCytosolicData.txt så att alla tre objekt har en identisk ordning av proverna. Vektorn kommer att användas när instruera anota omkring vilken prov för att jämföra. Lägg till följande i myCode.R filen:
# # Observera att replikatprover har identiskt prov klass
# # Beskrivningar (dvs "C" eller "D") i denna vektor.
myPhenotypes <- c ("C", "C", "C", "D", "D", "D") - Utför kvalitetskontroll av datamängden. Det finns ett antal kvalitetsåtgärder som måste bedömas innan anota kan användas för analys. Dessa diskuteras i detalj i anota handboken. Lägg denna kod till myCode.R filen och spara:
anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)
anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) - Kör koden genom att skriva in i R-terminal:
källa ("myCode.R")
Detta kommer att generera ett antal utdatafiler, vilket kan undersökas enligt instruktionerna i anota handboken. - Identifiera differentiellt översatta gener. Prover kommer att jämföras utifrån alfabetisk ordning namnen som levereras till "phenoVec" parametern (dvs. "myPhenotypes" vector) om de inte anges av användaren (genom att använda "kontraster" parametern). Lägg till följande kod myCode.R filen och avsluta genom att använda "källa"-kommando inne i R-terminal som beskrivs ovan:
anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) - Använd hjälpen för anotaGetSigGenes att förstå hur output formateras och se hur man väljer prov kategorier för att jämföra genom att skriva (i R-terminal):
? anotaGetSigGenes - Filter och tomt gener som differentiellt översatta. Det finns flera trösklar som kan tillämpas inom anotaPlotSigGenes funktion och använda hjälp kommer att förenkla en anpassad kombination av sådana trösklar. Om du vill välja för ett tillförlitligt analyserade gener tillämpar minSlope (-0,5), maxSlope (1,5) och slopeP (0.01) inställningar.
Obs! Dessutom inställningar som gäller för RVM 23,26,30 falsk upptäckten hastighet (FDR) (0,15) och vik förändringar (log2 [1,5]) kan t.ex. användas för att identifiera differentiellt översatta gener. Andra filter, såsom "selDeltaPT" kan vara användbart för en strängare filtrering (t.ex. uppsättning selDeltaPT till log2 [1,5]). Det är också nödvändigt att specificera vilka bör filtreras jämförelse (med hjälp av selCont argument). Applicera de beskrivna inställningarna genom att lägga till följande rad till myCode.Rfil:
anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1,5), selDeltaPT = log2 (1,5)) - Utför analys med hjälp av källfunktionen från R-terminalen såsom beskrivs ovan. Detta kommer också att skapa en grafisk produktion. Undersöka denna utgång är en bra utgångspunkt för att utvärdera resultaten av analysen och identifiera eventuella nödvändiga ändringar i inställningarna.
- Generera en outputtabell. Lägg till följande kod till myCode.R filen:
write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = "MySignificantGenes.txt", September = " t") - Kör koden med hjälp av källfunktionen i R-terminalen. Kolumnerna i den resulterande tabellen förklaras i hjälpen för anotaPlotSigGenes funktionen.
- Generera en vektor som beskriverkategorierna prov (en vektor är en typ av objekt i R). Denna vektor bör spegla provet ordning i myPolysomeData.txt och myCytosolicData.txt så att alla tre objekt har en identisk ordning av proverna. Vektorn kommer att användas när instruera anota omkring vilken prov för att jämföra. Lägg till följande i myCode.R filen:
Representative Results
mTOR är en viktig nod i mobilnätet som samordnar globala proteinsyntesen med näringsämnen tillgänglighet 19. mRNA-translation regleras huvudsakligen på det hastighetsbegränsande inledande steg 6. Andelen ribosomer bedriver polysomer korrelerar positivt med translationsinitierings satser 28. Ett exempel på tillämpning av polysom fraktioneringsmetod för att undersöka vilken roll mTOR signalering i att medla effekterna av insulin på mRNA translation presenteras. För detta ändamål var MCF7 humana bröstcancerceller hålles i lågt serum och stimulerades sedan med enbart eller i kombination med den aktiva platsen mTOR inhibitor Torin1 insulin. Icke-stimulerade celler som kontinuerligt hölls i lågt serum, tjänade som en kontroll. mRNPs, monosome (80S) och polysom fraktioner separerades med användning av polysom-fraktioneringsmetod. I förhållande till kontrollcellerna, insulin inducerade en ökning i absorbans i gradientfraktioner motsvarandeatt polysomer, åtföljt av en samtidig sänkning av absorbansen i monosome fraktionen (Figur 1). Dessa rön visar att andelen av ribosomer engagerade i polysomer ökas i insulinbehandlade jämfört med kontrollceller, vilket ger vid handen att, som väntat, stimulerar insulin globala translationsinitierings hastigheter. Torin1 vände effekterna av insulin på absorbans profiler (Figur 1), och därmed bekräftar resultaten att mTOR signalering spelar en viktig roll i att medla effekterna av insulin på översättningen maskiner 19.
Utifrån en grundsats att inkonsekvenser i lutning preparatet inte kan undvikas, har frågor väckts vad avser reproducerbarhet av data som erhållits med hjälp av polysom fraktioneringsmetod 22. För att empiriskt testa detta potentiellt skadlig fråga, cytosoliska och tung polysom associerade RNA (mRNA samband med 4 och fler ribosomer) var isolerade från MCF7-celler behandlade med enbart insulin eller insulin i kombination med Torin1 från fyra oberoende biologiska replikat (Figur 2). Effekterna av insulin och Torin1 om sammansättningen av cytosolic och tung polysom-associerad mRNA i varje replikat bestämdes på en genomet hela skalan med hjälp av en microarray metod. För att bestämma reproducerbarheten för polysom fraktioneringsmetod med principalkomponentanalys (PCA) applicerades. Sådan analys visade att prover som hör till varje tillstånd var tätt placerad inom de första två komponenterna under de olika betingelser var väl separerade (fig. 2). Dessa resultat visar att polysom fraktioneringsmetod som beskrivs här är mycket reproducerbar och därför lämpligt att studera kvantitativa och kvalitativa förändringar i översättningen på en genomet hela nivån.
ad/51455/51455fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg "/>
Figur 1. Polysomal profiler som visar effekten av serumsvält, insulin och mTOR signalering på global översättning i MCF7-celler. MCF7-celler berövades näringsämnen (upprätthållna i 0,1% FBS) i 16 timmar och behandlades med 5 nM insulin (Ins) enbart eller i kombination med 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) under 4 timmar. Obehandlade celler som kontinuerligt berövas näringsämnen (0,1% FBS) användes som kontroll. Motsvarande cytosolextrakt sedimenterades genom centrifugering på 5-50% sackaros gradienter. Fria ribosomala subenheter (40S och 60S), monosomes (80S) och antalet ribosomer i polysom fraktionerna anges.
Figur 2. Genomvid data som erhållits med hjälp av polysome profilering är mycket reproducerbar. MCF7-celler behandlades såsom i figur 1. cytosoliska och polysom associerade RNA (> 3 ribosomer) extraherades från fyra oberoende biologiska replikat och deras genomet hela mRNA-nivåer bestämdes med användning GeneTitan arrayer (Affymetrix). PCA användes för att bedöma reproducerbarheten för resulterande data. Här visas de första två PCA komponenter för alla behandlingar (T1 = Torin 1; ctrl = kontroll, Ins = insulin), ursprung av RNA (C = cytosoliskt, P = polysom-associerat) och replikerar. Prover från samma skick och RNA ursprung är tätt placerade vilket indikerar hög reproducerbarhet.
Discussion
I artikeln beskrivs en väletablerad polysom fraktioneprotokoll följt av en egenutvecklad analysmetod för att fånga kvalitativa och kvantitativa förändringar i translationell aktivitet på en genomet hela skalan i däggdjursceller. För ett framgångsrikt slutförande av detta protokoll särskild uppmärksamhet bör ägnas åt 1) Cell konfluens (som spridning priser och tillgången på näringsämnen korrelerar med mRNA översättningsverksamhet och kan påverka sammansättningen av translatome bör cellsammanflyt vara enhetligt för replikat och experimentella förhållanden), 2) Snabb cellysering (Trots att förekomsten av cykloheximid och RNas-hämmare i buffertar, bör lys vara snabbt och cellulära extrakt bör överlagras på sackarosgradienter direkt efter lys för att förhindra RNA nedbrytning och dissociation av polysomer), 3) Gradient preparat (för att se till hög data reproducerbarhet bör sackarosgradienter beredas med hjälp av gradienten maker och spesiella försiktighet bör iakttas vid hantering av dem).
Förutom att studera förändringarna i translationell aktivitet, kan detta protokoll användas för att isolera ribosom-associerat protein komplex och fastställa deras fysiologiska funktioner. För detta ändamål kan nivåerna och phosphorylation status för olika ribosom-associerade proteiner bestämmas genom TCA-utfällning, följt av Western blotting, under det ribosom-associerade protein-komplex kan immunprecipiteras från gradientfraktioner och analyserades genom Western-blotting eller mass-spektrometri. En brist med denna teknik är att den långsamma lutning fraktionen metod kan leda till dissociation av ens tätt bundna proteiner vars bindande kinetik är i snabb förening / dissociation. Faktorer associerade till nysyntetiserade polypeptider är typexempel. Nysyntetiserade polypeptider framväxande form ribosomerna kan immobiliseras på proteinkomplex associerade med ribosomer som använder kemiska tvärbindare såsom 3, 3'-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Detta tillvägagångssätt har visat att receptorn för Aktiverad C Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal kinas (JNK) / eukaryotisk translation elongeringsfaktor 1A2 (eEF1A2)-komplexet reglerar nedbrytningen av nyligen syntetiserade polypeptider som svar på stress 27. Dessutom har liknande metod används i studier som visar att proteinkinas C BII (PKCbII) rekryteras till ribosomer genom RACK1 32 och att aktivering av mTOR komplex 2 (mTORC2) sker på ribosomerna där det fosforylerar nyligen syntetiserade AKT polypeptider och reglerar deras stabilitet 33,34.
Stora begränsningar i polysom fraktioneringsmetoden, följt av anota analys är följande: 1) kravet på ett relativt stort antal celler (~ 15 x 10 6 celler), 2) avsaknad av positionsinformation avseende lokalisering av ribosomen på en viss mRNA-molekyl, och 3 ) frågor som rör cellulära och molekylära heterogeneity av normala och tumörvävnad. Frågor som rör krävs cell nummer kan lösas genom att rikta absorbansspektra toppar som motsvarar monosomes (80S) av celler vars belopp är begränsande med de som erhållits från hög överflöd celler (t.ex. HeLa-celler) 35. Ribosomen profilering teknik (se nedan) kan användas för att bestämma exakt position av ribosomen på en viss mRNA-molekyl, medan frågor som rör confounding effekter av vävnad heterogenitet om tolkningen av förändringar i genuttryck som erhållits från komplexa system såsom mänskliga vävnader diskuteras i detalj i en publikation med purjolök och Storey 36.
Nyligen gjordes en ny ribosomen profilering teknik som utvecklats, där ribosom skyddade fragment (RPFs) genereras av RNas I behandling och analyserades genom djup-sekvensering 22. Denna teknik medger bestämning av ribosomen ståndpunkt vid en enda nukleotid upplösning, varigenom hittills unprecedented insikter i ribosomen biologi. Till exempel kan ribosomen profilering användas för bestämning av ribosomen densitet på en viss mRNA-molekyl eller identifiering av faktorer som påverkar translationsinitierings priser såsom alternativa initieringsställen, initiering vid icke-augusti kodon och regulatoriska element såsom uORFs. Men det finns flera metodologiska begränsningar som begränsar möjligheten för ribosomen profilering att exakt uppskatta effektiviteten mRNA-translation. Dessa inkluderar oberoende fördomar som införts av slumpmässig fragmentering och RNas I matsmältning, fördomar som införts av hämmare översättning (t.ex. förlängnings hämmare såsom emetin och cykloheximid kommer sannolikt att framkalla ribosomen ackumulering vid översättnings initieringsställen), ett stort antal falskt positiva och falskt negativa resultat i samband med TE-poäng samt deras felaktighet i att förutsäga den lyder som kommer från protein kodning mRNA 37. Kanske viktigast av allt, medanribosomen profilering medger direkt identifiering av ribosomen ställning på en viss mRNA-molekyl, är antalet ribosomer som är förknippade med en viss mRNA indirekt beräknas genom att normalisera frekvenserna för läsningar i RPFs (ribosomen associerade mRNA) över de som observerats i slumpvis fragmente mRNA (total mRNA). Till exempel, i en enkel miljö där fyra "B" mRNA-molekyler (Ba, Bb, Bc och Bd) är upptagna av fyra ribosomer på positionerna 1, 2, 3 och 4, en inneboende brist i ribosomen profilering tekniken inte kommer att tillåta en skillnad mellan ett scenario där alla 4 ribosomer förknippar endast med en Ba-mRNA i positionerna 1, 2, 3, och 4 och ett scenario där Ba, Bb, Bc och Bd mRNA var upptagen av en enda ribosomen vid position 1, 2 , 3, och 4, respektive. Däremot under polysom fraktionering, är polysom integritet bevaras, vilket möjliggör isolering av pooler av mRNA i samband med ett definierat antal ribosomer (Figur 1). Denna important åtskillnad mellan polysom fraktionering och ribosomen profilering antyder att medan den förstnämnda metoden kan användas för att direkt jämföra mRNA i mRNP, lätta och tunga polysom fraktioner, den senare metoden kommer sannolikt att misslyckas med att fånga upp ändringar i translatome som orsakas av mRNA som övergången från lätt till tung polysomer, medan överskatta bidraget från de som flyttas från mRNP fraktionen till tunga polysomer. Den biologiska betydelsen av dessa skillnader mellan de tidigare nämnda metoder understryks av en stor mängd data som visar att translationell aktivering av en delmängd av mRNA till exempel de som är eIF4E känsliga, övergången från ljus till tunga polysomer, medan andra, till exempel de som hyser 5'TOP element, rekryteras till tunga polysomer direkt från pooler av ribosomen fria mRNA 6. Intressant nog har mTORbanan visats samtidigt modulera översättningen av "eIF4E känsliga" och 5'TOP mRNAs 11. Därför kan metodologiska skillnader som diskuteras ovan förklara den uppenbara obalans i slutsatsen mellan studier med ribosomen profilering 38,39 och polysom fraktionering 24 för att bedöma effekterna av mTOR-hämning på translatome.
Sammanfattningsvis, polysom fraktionering och ribosomen profilering är komplementära metoder som i första hand ger information om antalet ribosomer förknippade med mRNA och placering av ribosomen på mRNA, respektive. Viktigt, trots de brister och fördelar med dessa metoder, är det fortfarande viktigt att de uppgifter genomet hela erhållits genom båda förfarandena är tillräckligt analyseras och funktionellt och biokemiskt validerad.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av den kanadensiska Institutes of Health Research bidrag (CIHR MOP-115195) och FRQ-S till IT, som också är en mottagare av CIHR Young Investigator Award; och det svenska Vetenskapsrådet och Svenska Cancerfonden till OL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Biobasic | HB0264 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | VWR | CABDH4532 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Biobasic | DB0058 | |
| Tris | Biobasic | TB0196 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9515 | RNA precipitation carrier |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1988 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 04693132001 | Tablets (EDTA-free) |
| RNase inhibitor | Promega | N2515 | |
| 0.45 µm Filter System 150 ml | Corning | 431155 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | RNA cleanup kit |
| Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW41Ti Rotor Package with accessories | Beckman Coulter | 331336 | |
| Optima L100 XP ultra centrifuge | Beckman Coulter | DS-9340A | |
| ISCO fraction collector | Brandel | FC-176-R1 | |
| Type II Detector with Chart Recorder | Brandel | UA-6 | UV detector |
| Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump | Brandel | BR-A86-5 | |
| UA-6 Detector Cable | Brandel | 60-1020-211 | |
| FC-176 Communication Cable | Brandel | FCC-176 | |
| Gradient Master Base Unit | Biocomp | 108-1 | Gradient Maker |
| Gradient Forming Attachments | Biocomp | 105-914A-1R | Gradient Maker attachment |
| Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device | MicroDAQ | USB-1208FS | Analysis software attachment |
| Measurement Computing Data Acquisition Software | MicroDAQ | TracerDAQ Pro | Analysis software (Download only) |
| 10x buffer for sucrose gradients: | |||
| 200 mM HEPES (pH7.6) | |||
| 1 M KCl | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 100 µg/ml cycloheximide | |||
| 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | |||
| 100 units/ml RNase inhibitor | |||
| Lysis buffer | |||
| 5 mM Tris-HCl (pH7.5) | |||
| 2.5 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM KCl | |||
| 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] | |||
| Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text |
References
- Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
- Komili, S., Silver, P. A. Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view. Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).
- Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells. J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
- De Benedetti, A., Graff, J. R. eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases. Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).
- Roux, P. P., Topisirovic, I. Regulation of mRNA translation by signaling pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Ron, D., Harding, H. P. Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).
- Proud, C. G. mTOR Signalling in Health and Disease. Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).
- Topisirovic, I., Sonenberg, N. mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).
- Pavitt, G. D., Proud, C. G. Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease. Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).
- Abe, M., Bonini, N. M. MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact. Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).
- Kasinath, B. S., et al. Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. Identification of differential translation in genome wide studies. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).
- Larsson, O., et al. Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).
- Colman, H., et al. Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection. J Virol. 87, 6668-6677 (2013).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).
- Gandin, V., et al. Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2. Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).
- Gierer, A. Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis. J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).
- Wright, G. W., Simon, R. M. A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments. Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).
- Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells. Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).
- Grosso, S., et al. PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1. Biochem J. 415, 77-85 (2008).
- Oh, W. J., et al. mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide. EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).
- Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. Activation of mTORC2 by association with the ribosome. Cell. 144, 757-768 (2011).
- Bjur, E., et al. Distinct translational control in CD4+ T cell subsets. PLoS Genet. 9, e13 (2013).
- Leek, J. T., Storey, J. D. Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis. PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).
- Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Cell. 154, 240-251 (2013).
- Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485, 55-61 (2012).
- Thoreen, C. C., et al. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485, 109-113 (2012).
