Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die Empfindlichkeit der Rezeptoren Astrozyten gewinnen angewendet werden Veränderungen in der neuronalen Aktivität.
Nähe von zwei Dekaden der Forschung hat festgestellt, dass Astrozyten in situ und in vivo exprimieren viele G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die von neuronal-Freigabe Sende angeregt werden können. Jedoch wurde die Fähigkeit von Astrozyten Rezeptoren Plastizität in Reaktion auf Veränderungen in der neuronalen Aktivität aufweisen, wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Hier beschreiben wir ein Modellsystem, die global nach oben oder unten skalieren Astrozyten Gruppe I metabotropen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) in akuten Hirnschnitten verwendet werden kann. Enthalten sind Methoden, wie man parasagittale Hippocampus vorbereiten, bauen Kammern geeignet für langfristige Scheibe Inkubation bidirektional manipulieren neuronalen Aktionspotential, Belastung Astrozyten und Astrozyten Prozesse mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator, und messen Veränderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität durch die Aufnahme spontane und evozierte Astrozyten Ca 2 +-Ereignisse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Im wesentlichen ein "Calcium roadmap "ist, wie man Plastizität der Astrozyten Gq GPCRs zu messen. Anwendungen der Technik zur Untersuchung von Astrozyten diskutiert. Nachdem ein Verständnis dafür, wie Astrozyten-Rezeptor-Signal wird durch Veränderungen der neuronalen Aktivität beeinflusst hat wichtige Implikationen sowohl für die normale synaptische Funktion sowie Prozesse zugrunde liegenden neurologischen Störungen und neurodegenerative Erkrankungen.
Astrozyten reagieren innerhalb von Sekunden bis Stimulation von Neuronen oder neuronalen Axonen mit einem Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2 + resultierenden fast ausschließlich aus der Aktivierung von Astrozyten Gq GPCRs. Zum Beispiel muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren 1, 2 Cannabinoid-Rezeptoren, α 1A adrenergen Rezeptoren 3, 4, und ich mGluRs Gruppe (siehe unten) sind alle Astrozyten Gq GPCR-Subtypen, die akut die neuronale Aktivität zu reagieren. Aktivierung von Astrozyten Gruppe I-mGluRs wurde sehr ausgiebig demonstriert, nach Stimulation des glutamatergen Nerven Afferenzen in situ (z. B. akute Hippocampus) 5-7 sowie in adulten Maus Kortex in vivo nach sensorischer Stimulation 8. Das Ergebnis der Aktivierung von Astrozyten Gq GPCR-Signal über die Biologie und Physiologie der Astrozyten, Neuronen oder Astrozyten-Neuron-Interaktionen ist eine Angelegenheit der Debatte 12.09. Es wird s seinome Zeit vor der Funktion von Neuronen zu Astrozyten-Rezeptor-Signal ist voll gewürdigt.
Zwar ist klar, dass Neuronen Astrozyten Rezeptoren mit Versuchsprotokolle zu aktivieren, gibt es Aspekte der Neuron-zu-Astrozyten-Rezeptor-Kommunikation, die kaum verstanden zu bleiben. Zuerst wird die tatsächliche Menge der neuronalen Aktivität erforderlich Astrozyten Gq GPCRs aktivieren ist nicht gut definiert, und die zweite ist die Fähigkeit der Astrozyten Rezeptoren nutzungsabhängige Plastizität aufweisen wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Um zu beginnen, um diese Fragen zu beantworten, haben wir vor kurzem ein Protokoll zur bidirektionalen Skalierung der Astrozyten Gruppe I mGluRs in akuten Jugend Hippocampus in Reaktion auf langfristige Veränderungen in der neuronalen Aktionspotential (AP)-abhängige synaptische Aktivität zu induzieren. Ähnlich wie für bidirektionale homöostatische Plastizität neuronaler ionotropen Glutamat-Rezeptoren 13, 14, Astrozyten Gruppe I mGluRs Scale-up fo entdecktllowing Blockade neuronaler Aktionspotentiale und verkleinern, wenn neuronale Aktionspotentialfrequenz erhöht 15. Diese kompensatorischen Veränderungen in Astrozyten Rezeptoren können durch spontane Aufnahme gemessen werden und evozierte Astrozyten Ca 2 +-Transienten-und den Vergleich der Eigenschaften von diesen Ereignissen um die aus Astrozyten in Kontrollbedingungen. In diesem Manuskript, beschreiben wir die vollständige Methodik für den Einsatz dieses Protokolls, einschließlich der Vorbereitung der akuten Hippocampus, Inkubationsbedingungen zu Astrozyten-Rezeptor-Skalierung zu induzieren, Astrozyten Ca 2 +-Indikator-Farbstoff Laden, Ca 2 +-Imaging-Techniken mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und erwarteten Auswirkungen auf Astrozyten Gq GPCR-Aktivität. Vorhersehbare Auswirkungen auf Astrozyten Ca 2 + Signaleigenschaften – was die zuvor in kultivierten Zellen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus von Gq GPCRs transfiziert aufgezeichnet wurde – eine "Roadmap", die in zukünftigen Studien genutzt werden kann, um Änderungen in wie Assaytrocytic GPCR Ausdruck. Die Auswirkungen und Anwendungsmöglichkeiten für den Einsatz dieser Technik wird zu unserem Verständnis der Astrozyten-neuronalen Interaktionen im gesunden und erkrankten Gehirn beitragen.
Die beschriebenen Skalierung Modelle stellen praktische Methoden für die Erforschung von Langzeitplastizität von Astrozyten Gruppe I mGluRs. Imaging spontane und evozierte Ca 2 +-Ereignisse können empfindlicher Test für die Messung von Veränderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität, als feste Beweise wurde festgestellt, dass Astrozyten Ca 2 +-Erhöhungen treten nach der Entlassung von IP 3 R empfindlichen Läden hinter der Gq GPCR-Aktivierung 10, 12, 17, 18. Der Anteil der Astrozyten in der Bevölkerung reagiert auf Gruppe I mGluR-Agonisten und dem Muster solcher Ca 2 +-Antworten berichten Veränderungen in der Gruppe I mGluRs von Astrozyten.
Die spezifische Technik zur Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator zu laden ist eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung von Experimenten, um Änderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität zu suchen. Bolus-loading-oder Masse-Laden mehrerer Astrozyten oder pATCH-Clamp-Belastung der einzelnen Astrozyten, um die Bild Ca 2 +-Transienten in Astrozyten verwendet werden. Jeder Ansatz bietet gewisse Vorteile und Nachteile. Direktes Füllen Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator durch Patch-Clamp ermöglicht eine eindeutige Identifikation der Zelle als Astrozyten ohne Notwendigkeit eines sekundären Marker, wie SR-101. Patch-Clamp Lieferung der Anzeige ermöglicht auch die Aufnahme von Ca 2 +-Aktivität von Astrozyten kleine Fächer mit den buschigen feinen Prozesse, möglicherweise tiefer in der Scheibe, wo Zellen sind gesünder und mit mehr intakt Interaktionen mit Synapsen (abhängig von der Laserleistung verfügbar). Jedoch leidet Patch-Clamp-Beladung von geringem Durchsatz, da die Daten zu einem Zeitpunkt einer Zelle gesammelt. Massenlade hingegen ermöglicht eine große Anzahl von Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator beladen und gleichzeitig abgebildet werden. Jedoch nur Astrozyten in der Nähe der Oberfläche (<20 &mgr; m) der Scheibe geladen sind, zugeordnet Anliegens über die Zellgesundheit und intakte Synapsen.
Die hier vorgestellte Gegendruck Bolus-loading-Protokoll bietet einen Mittelweg, mit relativ hohen Durchsatz und die Fähigkeit, Ca 2 +-Aktivität zu überwachen tiefer innerhalb der Scheibe (40-75 um). Im Vergleich zu Massenbeladung Ein signifikanter Anstieg im Prozentsatz der spontan aktiven Astrozyten mit der Bolus-Beladungstechnik beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen zwischen neuronalen Synapsen und die Astrozyten Prozesse voll 15. Mit guten Laden, kann man oft beobachten Ca 2 +-Aktivität in Hauptprozesse von Astrozyten (Daten nicht gezeigt) oder möglicherweise sogar kleinere Fächer mit 2-Photonen-Mikroskopie. Allerdings wäre Pflege brauchen, um bei der Zuordnung der kleinere Prozesse zu einem bestimmten Astrozyten ausgeübt werden, da die Grenzen in die unspezifische Hintergrundfärbung mischen. Eine weitere Sorge mit der Verwendung von Großlade-oder Bolus-Ladeverfahren ist die Notwendigkeit für eine sekundäre marker für Astrozyten Identifikation. Während es schon seit vielen Jahren bekannt, dass Astrozyten bevorzugt nehmen AM Ester Ca 2 +-Indikatoren wird die Sekundär Marker SR-101 häufig verwendet, um die geladenen Zellen als Astrozyten zu überprüfen. SR-101 kann in sich selbst verändern die innere Erregbarkeit von Neuronen 29. Verwendung von SR-101 bestätigt die Notwendigkeit, alle Astrozyten Ca 2 +-Messungen in TTX durchführen, um mögliche SR-101 Effekte auf die neuronale Erregbarkeit zu begrenzen. Unter der Annahme, dass sowohl Kontroll-und Versuchsgruppen schließen SR-101, sollte der Marker an sich nicht für die in Astrozyten-Ca 2 +-Signal beobachteten Effekte nach der Langzeitmanipulation neuronaler Aktionspotentiale zu berücksichtigen. SR-101 kann mehr ein Anliegen sein, in hohen K + Experimente aber, wie kann es den Unterschied zwischen 2,5 mM K + vs reduzieren 5,0 mM K +, wenn die basale Feuerrate ist nicht proportional geändert.
Ein sehr vielversprechender Ansatz für die Ca 2 + liefern </sup> Anzeige Astrozyten hat vor kurzem entstanden, die eine attraktive Alternative zu den traditionellen Ansätzen bietet mit Ca 2 +-Farbstoffe. Bedeutende Fortschritte wurden in den letzten Jahren mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) Astrozyten 30-32 gezielt gemacht worden. GeCIS können Astrozyten durch in vivo-Mikroinjektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in einer Hirnregion von Interesse, wie dem Hippocampus geliefert. Die Expression von GeCIS nach etwa zwei Wochen nach Virusinfektion 32 erreicht. Es gibt zahlreiche Vorteile durch die Verwendung von GeCIS in Astrozyten gekennzeichnet. Zuerst werden die Vektoren in Astrozyten mit einem Astrozyten-spezifischen Promotor richtet, so dass die markierten Zellen Astrozyten 32. Zweitens, das Signal-zu-Rausch scheint nun vergleichbar zu dem, was mit Patch-Clamp-Lieferung von Farbstoff erhalten werden, jedoch ohne die Invasivität, die eine Patchpipette auf die Zelle 32 hatte. Drittens können die Indikatoren sein delivered und in der Erwachsenengewebe, das mit Bulk-Loading-Versandmethoden problematisch ist, ausgedrückt. Weiterhin ist der Ausdruck Mosaik, bietet die Möglichkeit, unter mehreren Astrozyten differenzieren. So können mehrere Astrozyten potenziell gleichzeitig abgebildet werden, während die Aufnahme auch im Soma und feine Ästchen in der gleichen Zeit. Daher könnte eine einzige Technik, die in Platz drei separate Verfahren (bulk-loading, Bolus-Laden und Patch-Clamp-Belastung) verwendet werden, um die Skalierung Aktivität der Astrozyten Gq GPCRs aufzeichnen, Effizienz deutlich erhöht werden.
Ein möglicher Nachteil der Verwendung von viral-vermittelte Abgabe von Ca 2 +-Indikatoren Astrozyten die möglichen Auswirkungen auf die Gesundheit Scheibe 32. Die Adeno-assoziierte virale Vektoren verwendet, um die GeCIS liefern haben bereits gezeigt worden, um reaktive Gliose der Astrozyten 33 verursachen. Herstellung von Hirnschnitten im Allgemeinen wahrscheinlich initiiert frühen Stadien der Pathologie einschließlich der Freisetzung von inflammatory 10 Moleküle. Daher kombiniert mit den langen Inkubationszeiten erforderlich, um die Skalierung der Astrozyten-Rezeptoren induzieren, die Verwendung von GeCIS Verwendung viraler Vektoren geliefert müssten zusätzliche Gegenleistung im Rahmen von Schicht Gesundheit in dieser Art von Experimenten zu erhalten.
Bei der Verwendung dieses Protokoll, ist es wichtig zu beachten, dass der Antrag für die Zeit, um eine Antwort Agonisten produzieren wird als Funktion des Rezeptors Verfügbarkeit variieren. Für eine gegebene Konzentration des Agonisten wird die Anwendungszeit muss länger sein, wenn Rezeptoren unten skaliert kürzer, und wenn Rezeptoren haben, skaliert für das Medikament, eine angemessene Konzentration im Gewebe an Rezeptoren ausreichend zu aktivieren, um eine Ca 2 + zu erzeugen erreichen Antwort. Daher können Arzneimittel Anwendungszeiten und möglicherweise ihre Konzentrationen müssen in Abhängigkeit von der beabsichtigten Richtung der Skalierung eingestellt werden. Zum Beispiel muss die Agonistenkonzentration in der C abgesenktase von TTX zu vermeiden Sättigung Reaktionen und erhöhte nach Inkubation Scheiben in hohen K + noch eine Antwort finden. Insbesondere wurde die DHPG-Konzentration von 5 bis 15 uM nach TTX-Behandlung auf 30-50 uM nach 5,0 mM K + Behandlung, um die Ca 2 +-Antwort-Muster zu untersuchen, wie 5-15 uM war oft zu gering, um zuverlässige Antworten in verschobene Astrozyten nach Verkleinerung der Gruppe I mGluRs.
Aufzeichnung von Astrozyten Ca 2 +-Aktivität bietet keinen direkten Beweis von Rezeptor Internalisierung Einsetzen oder zu oder von der Plasmamembran. Jedoch, bezogen auf die bemerkenswerte Ähnlichkeit der Daten mit Daten aus früheren Untersuchungen in vitro, die die direkte Beziehung zwischen Gq GPCR-Expressionsniveaus und spontane sucht und evozierte Ca 2 +-Transienten 21-24, die logische Interpretation der Änderungen der Ca 2 + Signalisierung, daß die Astrozyten-Oberflächenrezeptor-Expressionsniveaus habengeändert. Ein komplementärer Ansatz kann ein wichtiger Aspekt sein, wenn man will, um zusätzliche Erkenntnisse über den Ort der Wirkung auf die Ca 2 +-Aktivität liefern. Eine Strategie, die wir verwendet wurde, um die Wirkung von TTX Inkubation auf Hippocampus von Astrozyten MrgA1R Mäusen zu untersuchen. Diese transgenen Mäuse exprimieren einen Fremd Gq GPCR (die MrgA1R) nur in Astrozyten. Da dieser Rezeptor nicht heimisch an das Gehirn, gibt es keinen endogenen Neurotransmitter vorhanden, seine Aktivität zu ändern. Frühere Arbeiten vorgeschlagen, dass dieser Rezeptor die gleiche intrazelluläre Signalmoleküle als endogene Gruppe I mGluRs in den gleichen Astrozyten 34 greift. Nach Langzeit-Inkubation von Scheiben von MrgA1R Mäuse in TTX, keine Unterschiede in der Agonisten-evozierte MrgA1R Antworten im Vergleich zu Kontrolle inkubiert Wurfscheiben wäre nachzuweisen, dass die Wirkung auf Astrozyten aufgrund von Änderungen an der Oberfläche lokalisierten Rezeptor Ca 2 +-Aktivität, vor allem wenn Gruppe I mGluR Antworten sind immer noch significantly in den gleichen Astrozyten verbessert. Eine alternative, wenn auch komplizierter Strategie wäre, Astrozyten aus den Scheiben für die Western-Blot-Analyse zu isolieren, solange einer Membranfraktion kann für Änderungen der Oberflächenrezeptorexpressionsniveaus analysiert. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) oder Durchflusszytometrie kann hier hilfreich sein.
Die möglichen Anwendungen dieser Technik auf die Untersuchung von Neuronen, Astrozyten und Astrozyten-neuronalen Interaktionen viele. In unseren Experimenten nur DHPG-evozierte Gruppe I mGluR Astrozyten Ca 2 +-Antworten untersucht wurden, in isolierten akuten Hippocampus von jungen Mäusen. Diese Vorbereitung hat nicht nur die intakten Afferenzen (Schaffer-Kollateralen), aber auch die Nervenzellen, die Anlass zu ihnen (CA3 Pyramidenzellen), so dass es möglich ist, die Feuerraten dieser glutamatergen Neuronen auf die postsynaptischen Zellen (CA1-Pyramidenzellen) zu manipulieren und die Astrozyten in Stratum radiatum deren Prozesse verbundee mit diesen Synapsen. Die akute Hippocampus-Scheibe ist vielleicht nicht die beste Vorbereitung für die Manipulation von Feuerraten von anderen Arten von Neuronen zu sein, aber, wie viele Afferenzen aus den Neuronen, die Anlass zu ihnen abgebrochen. Dennoch kann es in bestimmten Schnittpräparate sein, Plastizität der anderen Astrozyten Gq GPCR-Subtypen zu beobachten. Zum Beispiel könnte Scheiben mit cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns und ihre Projektionen hergestellt intakt Hippocampus. Inkubation dieser Scheiben in TTX oder erhöhter K + würde basalen Feuerraten von cholinergen Neuronen beeinflussen, was zu Skalierung mAChRs in Astrozyten des Stratum oriens, die einen wesentlichen Anteil des cholinergen Eingang 1 empfangen. Ein alternativer Ansatz für die noch nicht erprobt Astrozyten-Rezeptor-Skalierung in einem bestimmten Bereich des Gehirns, mit allen Verbindungen intakt studieren, während die Skalierung auftritt, könnte es sein, ein in vivo-Modell, bei dem eine anhaltende Freisetzung von TTX durch Implantation eines plast erreicht verwendenic Polymer Elvax 40W oberhalb der interessierenden Region 35. Dieser Ansatz wurde bereits in einer Studie von neuronalen Skalierung verwendet worden, aber sollte auch auf Astrozyten Skalierung sein. Schließlich, mit der richtigen Anzeige, zukünftige Studien könnten andere GPCR Familien, einschließlich der Änderungen in G s oder G i GPCRs zu untersuchen. Man könnte Astrozyten GABA B G vorherzusagen i GPCRs zu folgenden Hemmung der Brenn lokal vorstehende GABA Inter innerhalb einer Schnittpräparat betroffen sein. Entwicklung neuer Indikatoren, die gegen andere Signalmoleküle, wie eine Echtzeit-Anzeige der zweiten Botenstoffes cAMP, die Öffnung für ein völlig neues Gebiet der Forschung auf Neuron-zu-Astrozyten-Rezeptor-Kommunikation.
Bidirektionale Skalierung der Astrozyten mGluRs durch Manipulation der basalen Neuronenfeuerraten liefert ein Maß für die Empfindlichkeit der Astrozyten auf AP-vermittelte Freisetzung von Neurotransmitter. Astrozyten kann offenbar spüren spontanen APs und glutamate Freisetzung bei Schaffer Sicherheiten-CA1-Pyramidenzellen Synapsen auch bei extrazellulären K + ist in einem physiologischen Bereich. Während akute Anwendung der TTX ist die Häufigkeit der spontanen Astrozyten Ca 2 +-Aktivität 18, 36, 37, die Ca 2 +-Aktivität unter den Astrozyten in der Bevölkerung wird entkorreliert 36, den Nachweis, dass Astrozyten Rezeptoren sind AP-Detektoren nicht zu reduzieren. Dies deutet darauf hin, dass Astrozyten spüren spontanen neuronalen APs mit auf ihre Gesamt Ca 2 +-Aktivität nicht beeinflussen. Es wird allgemein akzeptiert, dass die intrazelluläre Konzentration von IP 3 benötigen, um einen Schwellenwert zu IP 3 Rs stimulieren ausreichend, um eine nachweisbare Ca 2 +-Erhöhung führen zu erreichen. Könnte spontanen neuronalen APs aktivieren Astrozyten GPCRs, ohne messbare Ca 2 +-Erhöhungen? Zukünftige Studien könnten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) oder eine ähnliche techn nutzen ique (wie BRET), um die Beziehung zwischen G-Protein-Kopplung an den Rezeptor (ein Maß für die Rezeptoraktivierung) und Ca 2 +-Freisetzung aus internen Speichern zu prüfen. BRET wurde ausführlich in vitro verwendet werden, um G-Protein-zu-GPCR-Kupplung 38 zu erkennen, auch wenn es einige Zeit dauern, bis diese Technologie wird für die Verwendung in intakten Gewebepräparate zur Verfügung. Es ist möglich, dass Astrozyten Gq GPCRs ist viel häufiger als mit der aktuell verfügbaren Ca 2 +-Imaging Werkzeuge aufgezeichnet werden aktiviert. Neben der Erfassung von Aktionspotentialen, können Astrozyten Gq GPCRs auch in der Lage, Miniatur-Quanten Freisetzung von Neurotransmitter zu erfassen, wie in einer aktuellen Studie 39 gemeldet werden. Die hier beschriebene bidirektionale Skalierungsverfahren kann in zukünftigen Studien genutzt werden, um ein Maß für den Umfang, in dem Astrozyten Gq GPCRs erkennen Quanten vesikulären Freisetzung von Neurotransmitter, indem Bafilomycin A1 im Inkubationsprotokoll bieten.
ntent "> So weit die Skalierungs Protokolle nur im Hippocampus von jungen Mäusen (p12-p18) verwendet worden. Daher ist es zur Zeit nicht bekannt, ob Astrozyten-Rezeptor-Skalierung könnte auch von erwachsenen Mäusen Gewebe induziert werden. Eine überzeugende neue Studie legt nahe, dass Gruppe I mGluR Expression in Astrozyten verringert erheblich nach der ersten Woche und weiter bis ins Erwachsenenalter zurückgehen, mit einem sehr niedrigen Niveau von Rezeptor-Expression in adulten Astrozyten 40. Es wäre daher interessant sein, festzustellen, ob Astrozyten mGluRs skalieren nach Lang tige Hemmung der neuronalen Erregung bei erwachsenen Hippocampus der Maus auf Werte, die denen in Astrozyten von jungen Mäusen gesehen. Dieser Befund legt nahe, dass Astrozyten-Rezeptor-Expression ist nicht statisch in einem bestimmten Alter, sondern kann schnell je nach Höhe des neuronalen Aktivität zu verändern. Im Gegensatz zu verminderte Expression von Gruppe I mGluRs in erwachsenen Mäusen, die Beweise ab, dass adrenergen Rezeptoren, einschließlich & #945; 1A, 2A α und β 1-Subtypen, werden überwiegend durch Astrozyten im Gehirn von Erwachsenen 3, 4 ausgedrückt. Die α 1A-adrenergen Gq GPCR kann ein attraktives Ziel für zukünftige Studien der Neuron-zu-Astrozyten-Kommunikation, einschließlich, ob diese Rezeptoren empfindlich auf Veränderungen der adrenergen Neuronenfeuerraten sein.The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei UC Riverside Center for Neuronal Gliazellen-Interaktionen für wertvolle Diskussion der Skalierung Protokolle und Daten zu bestätigen. Die Autoren möchten auch ein aufrichtiges Dankeschön an Abcam für das Sponsoring der Veröffentlichung ihrer Arbeit zu geben.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |