Здесь мы опишем адаптацию протоколов, используемых для индукции гомеостатическую пластичность нейронов для изучения пластичности астроцитарных G-белком. Недавно используется, чтобы исследовать изменения в астроцитов группы I мГлуР у мышей в отношении несовершеннолетних, метод может быть применен для измерения масштабирование различных астроцитарных GPCRs, в ткани из взрослых мышей в месте и в естественных условиях, и, чтобы получить лучшую оценку чувствительности астроцитарных рецепторов на изменения в активности нейронов.
Около двух десятилетий исследований было установлено, что астроциты в месте и в естественных условиях выразить многочисленные G-белком рецепторы (GPCR), что может стимулироваться нейронально-переносчика. Тем не менее, способность астроцитов рецепторов проявляют пластичность в ответ на изменения в активности нейронов уделяется мало внимания. Здесь мы описываем модель системы, которую можно использовать в глобальном масштабе вверх или вниз астроцитов группы I метаботропных глутаматных рецепторов (мГлуР) при острых срезах мозга. Включены методы о том, как подготовить парасагиттальных срезах гиппокампа, построить камер, пригодных для долгосрочного ломтик инкубации в двух направлениях манипулировать нейронов действий потенциал частоты, нагрузки астроциты и астроцитов процессы с флуоресцентным Са 2 + индикатор, и измерить изменения в астроцитов Gq GPCR деятельности по записи спонтанной и вызвала астроцитов Ca 2 + события с помощью конфокальной микроскопии. В сущности, "кальций гoadmap "является предусмотрено как измерить пластичность астроцитарных GPCRs GQ. Обсуждается применение метода для изучения астроцитов. Имея понимание того, как астроцитов сигнализации рецептора зависит от изменений в активности нейронов имеет важные последствия как для нормальной синаптической функции, а также процессов, лежащих неврологических расстройств и нейродегенеративных заболеваний.
Астроциты реагировать в течение нескольких секунд стимуляции нейронов или аксонов с увеличением цитоплазмы Ca 2 + в результате почти исключительно из активации астроцитов GPCRs GQ. Например, мускариновых рецепторов ацетилхолина 1, рецепторы каннабиноидов 2, α 1A адренорецепторов 3, 4, и группа Я мГлуР (см. ниже) все астроцитарных Gq GPCR подтипы, что остро реагируют на нейронной активности. Активация астроцитов группа I мГлуР было продемонстрировано наиболее широко, после стимуляции нейронных глутаматэргических афферентов на месте (например, острых срезах гиппокампа) 5-7, а также в коре головного мозга взрослой мыши в естественных следующее сенсорной стимуляции 8. Итогом активации астроцитов Gq GPCR сигнализации по биологии и физиологии астроциты, нейроны, или астроцитов-нейронных взаимодействий был предметом дискуссий 9-12. Это будет сОме время перед функцией сигнализации рецепторов нейронов-на-астроцитов в полной мере оценили.
Хотя ясно, что нейроны могут активировать астроцитов рецепторы использованием экспериментальных протоколов, есть аспекты нейрон-на-астроцитов рецепторов связи, которые остаются мало изучены. Во-первых, фактическое количество нейронной активности, необходимой для активации астроцитов Gq GPCRs не четко определены, и, во-вторых, способность астроцитов рецепторов выставлять использование зависит от пластичности уделяется мало внимания. Для начала, чтобы ответить на эти вопросы, мы недавно разработали протокол, чтобы побудить двунаправленную масштабирование астроцитов группы I мГлуР в острых несовершеннолетних срезах гиппокампа в ответ на долгосрочные изменения в нейронной потенциала действия (AP)-зависимых синаптической активности. Подобно тому, что было обнаружено для двунаправленного гомеостатического пластичности нейронов ионотропных рецепторов глутамата 13, 14, астроцитов группы я мГлуР расширению масштабов FOllowing блокада нервных потенциалов действия и уменьшать, когда нейронов потенциал действия частота увеличивается 15. Эти компенсационные изменения в астроцитарных рецепторов может быть измерена путем записи спонтанной и вызвала астроцитов Са 2 + переходных и сравнения свойств этих событий, чтобы те из астроцитов в контрольных условиях. В этой рукописи, мы опишем полную методологию для использования этого протокола, включая подготовку острых срезов гиппокампа, условий инкубации индуцировать астроцитов рецептора масштабирование, астроцитов Са 2 + индикатор загрузки краситель, Ca 2 + методы визуализации с использованием конфокальной микроскопии, и ожидаемые эффекты на астроцитов Gq GPCR деятельности. Прогнозируемые воздействия на астроцитов Ca 2 + сигнальные свойства – те, которые соответствуют предварительно записаны в культивируемых клетках, трансфецированных различных уровней экспрессии Gq GPCRs – предоставить «дорожную карту», которую можно использовать в дальнейших исследованиях для анализа изменений в качествеtrocytic выражение ХВГФ. Последствия и возможные приложения для использования этой техники будет способствовать нашему пониманию астроцитов-нейронов взаимодействий в здоровой и больного мозга.
Описанные масштабирования модели представляют практические методы для исследования долгосрочных пластичность астроцитов группы I мГлуР. Визуализации спонтанные и вызванные Ca 2 + события обеспечивает чувствительный анализ для измерения изменений в астроцитов деятельности Gq GPCR, как твердых доказательств было установлено, что астроцитов Ca 2 + фасады происходят следующем выпуске от IP 3 R чувствительных магазинах ниже по течению от Gq GPCR активации 10, 12, 17, 18. Процент астроцитов в популяции в ответ на группы я mGluR агонистов и картины таких Ca 2 + ответов сообщать об изменениях в I группе мГлуР астроцитами.
Конкретный метод используется для загрузки астроциты с Ca 2 + индикатор является важным фактором при проектировании экспериментов, чтобы узнать про изменения в астроцитов деятельности Gq GPCR. Пилюля загрузкой или сыпучих загрузкой несколько астроциты, или рATCH-зажим загрузка отдельных астроцитов может быть использован для изображений Са 2 + переходных процессов в астроциты. Каждый подход имеет определенные преимущества и недостатки. Непосредственно заполнения астроциты с Ca 2 + индикатор через патч зажим позволяет однозначную идентификацию клетки как астроцитов без необходимости вторичного маркера, такого как SR-101. Патч-зажим поставка показателя также позволяет запись Ca 2 + деятельности от мелких астроцитарных отсеков включая густыми мелкими процессов, потенциально более глубоких на срезе, где клетки являются более здоровыми и с более нетронутыми взаимодействия с синапсов (в зависимости от мощности лазера имеется). Тем не менее, патч-зажим загрузка страдает от низкой пропускной как данные собраны на одну клетку за один раз. Массовая загрузка, напротив, позволяет большое количество астроцитов быть загружены с Ca 2 + индикатор и отображается одновременно. Тем не менее, только астроциты вблизи поверхности (<20 мкм) среза загружены, связанного с озабоченностьюс о здоровье клеток и неповрежденных синапсов.
Противодавление болюс-загрузке протокола, представленные здесь предлагает золотую середину, при относительно высокой пропускной способностью и возможностью контроля Ca 2 + активность в глубине среза (40-75 мкм). Значительное увеличение доли спонтанно активных астроцитов, используя технику болюс загрузкой наблюдается по сравнению с объемной загрузкой, предполагая, что соединения между нейронных синапсов и астроцитов процессов являются более полными 15. С хорошей загрузке, можно часто контролировать Ca 2 + активность в основных процессов астроцитов (данные не представлены) или потенциально даже более мелких отсеков с использованием 2-фотонной микроскопии. Тем не менее, уход необходимо будет осуществляться в присвоении более мелкие процессы для конкретного астроцитов, как границы сливаются в неспецифической фона окрашивания. Еще одна проблема с использованием объемной загрузкой или болюс загрузкой процедур является необходимость вторичного рынкег для идентификации астроцитов. В то время как он был известен в течение многих лет, что астроциты преимущественно занимают AM эфир Ca 2 + показатели, вторичный маркер SR-101 часто используется для проверки загруженных клетки как астроциты. SR-101 может само по себе изменить внутреннюю возбудимость нейронов 29. Использование SR-101 подтверждает необходимость выполнения всех астроцитов Ca 2 + измерения в ТТХ ограничить возможные SR-101 воздействие на возбудимости нейронов. Если предположить, что оба управления и экспериментальные группы включают SR-101, маркер в себе не должна учитывать эффектов, наблюдаемых в астроцитов Ca 2 +-сигнализации следующих долгосрочного манипулирования нейронных потенциалов действия. SR-101 может быть больше беспокойства в высокой K + экспериментов, однако, как это может уменьшить разницу между 2,5 мМ К + против 5.0 мМ К +, если базальная скорострельность не изменяется пропорционально.
Очень перспективный подход для доставки Са 2 + </sup> Индикатор астроцитов недавно возник который предлагает привлекательную альтернативу более традиционным подходам помощью Ca 2 + красители. Значительные успехи были достигнуты в течение последних нескольких лет с генетически кодируемых показателей кальция (GECIs), направленных на астроциты 30-32. GECIs может быть доставлен в астроцитах путем микроинъекции в естественных условиях адено-ассоциированные вирусные векторы в область мозга интерес, такие как гиппокампа. Выражение GECIs достигается примерно через две недели после вирусной инфекции 32. Существуют многочисленные преимущества, представленные использованием GECIs в астроциты. Во-первых, векторы направлены на астроциты с использованием промотора астроцитов по конкретным тем, чтобы меченые клетки астроциты 32. Во-вторых, шум сигнал-теперь похоже сопоставимы с тем, что можно получить с помощью патч-зажим доставку краски, но без инвазивности имея патч пипетки на 32 ячейки. В-третьих, показатели могут быть дельivered и выражается в взрослой ткани, которая является проблематичным с использованием методов объемной нагрузки доставки. Кроме того, выражение мозаика, обладает способностью дифференцироваться между несколькими астроциты. Таким образом, несколько астроциты потенциально могут быть отображены одновременно, а также записи в сомы и тонкой веточки одновременно. Таким образом, потенциально одна техника может быть использована вместо трех отдельных методов (основная загрузка, болюс-погрузочных и патч-зажим нагрузки) для записи масштабирования деятельность астроцитарных GPCRs GQ, значительно увеличивая эффективность.
Один потенциальный недостаток использования вирусного опосредованного доставку Ca 2 + показателей к астроцитов является возможное влияние на срез здоровья 32. В аденоассоциированные вирусные векторы, используемые для доставки GECIs было показано ранее, вызывают реактивные глиоз астроцитов 33. Подготовка срезах мозга в целом, вероятно, инициирует ранние стадии патологии, включая выпуска инфlammatory молекул 10. Таким образом, в сочетании с длинными времени инкубации, необходимых, чтобы вызвать масштабирование астроцитарных рецепторов, использование GECIs поставляемых с помощью вирусных векторов необходимо будет получить дополнительную рассмотрение в контексте здоровья среза в этих типах экспериментов.
При использовании этого протокола, важно иметь в виду, что время приложение для агониста для получения ответа будет варьироваться в зависимости от доступности рецепторов. Для данной концентрации агониста, время приложение должно быть больше, если рецепторы уменьшено, и короче, если рецепторы расширены, для лекарственного средства, чтобы достичь адекватной концентрации в ткани, чтобы активировать рецепторы достаточно, чтобы произвести Са 2 + ответ. Таким образом, применение препарата раз и, возможно, их концентрации, возможно, придется быть скорректирована в зависимости от предполагаемого направления масштабирования. Например, концентрации агониста, возможно, должны быть снижены в Cазы ТТХ, чтобы избежать насыщения ответов, и увеличивается после инкубации срезов в высокой K + даже увидеть ответ. В частности, концентрация ДХПГ был перенесен с 5-15 мкМ после лечения ТТХ к 30-50 мкМ после лечения 5,0 мМ К + в целях изучения Са 2 + модели реагирования, как 5-15 мкм часто слишком низкое для получения надежных ответов в астроциты после сворачивают группы I мГлуР.
Запись астроцитов Ca 2 + деятельности не дает прямых доказательств вставки рецепторов или интернализации на работу или с плазменной мембране. Однако, основываясь на замечательном сходстве данных с данными предыдущих исследований в пробирке которые рассмотрели прямую взаимосвязь между уровнем Gq GPCR экспрессии и спонтанным и вызванных Са 2 + переходных 21-24 наиболее логичным интерпретацию изменений в Ca 2 + сигнализации является то, что уровни экспрессии рецепторов на поверхности астроцитов иметьизменилось. Дополнительный подход может быть важным фактором, если кто-то хочет представить дополнительные доказательства о локус влияния на Ca 2 + деятельности. Стратегия, которую мы использовали, был изучить эффект ТТХ инкубации на срезах гиппокампа из астроцитов мышей MrgA1R. Эти трансгенные мыши выразить иностранный Gq GPCR (MrgA1R) только в астроциты. Поскольку этот рецептор не родной к мозгу, нет эндогенный медиатор присутствует изменить свои уровни активности. Предыдущая работа предположил, что этот рецептор участвует тот же внутриклеточной сигнализации молекулы в качестве эндогенного группа I мГлуР в тех же астроцитов 34. После длительного инкубация срезов от мышей MrgA1R в ТТХ, никаких различий в агонистов-вызвали MrgA1R ответов по сравнению с контролем однопометница не выдерживают ломтики бы представить доказательства, что эффект от астроцитов Са 2 + активность в связи с изменениями, локализованных на поверхности рецептора, особенно если ответы группа Я mGluR еще значиicantly усиливается в тех же астроциты. В качестве альтернативы, хотя, возможно, более активно участвовать стратегией было бы изолировать астроциты из срезов для вестерн-блоттинга, пока мембранной фракции могут быть проанализированы для изменения уровня поверхности рецепторных экспрессии. Флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) или проточной цитометрии могут быть полезны здесь.
Возможности применения этой техники к изучению нейронов, астроциты и астроцитов-нейронов взаимодействия очень много. В наших экспериментах, только ДХПГ-вызвала группа Я mGluR астроцитарных Ca 2 + ответы были изучены, в изолированных острых срезов гиппокампа мышей несовершеннолетних. Этот препарат не только неповрежденные афференты (Schaffer залогов), но и нейроны, которые приводят к ним (СА3 пирамидальных клеток), что делает возможным манипулировать теплотехнической этих глутаматергических нейронов на постсинаптических клеток (СА1 пирамидальных клеток) и астроциты в роговом radiatum процессами, свяе с этих синапсов. Острая гиппокампа ломтик не может быть лучшая подготовка для работы огневые темпы других типов нейронов, однако, как и многие афференты отделена от нейронов, которые приводят к ним. Тем не менее, это может быть возможно в некоторых препаратах срезов наблюдать пластичность других подтипов астроцитарных Gq GPCR. Например, кусочки могут быть подготовлены с базальных отделах переднего мозга холинергических нейронов и их проекций на гиппокампе нетронутыми. Инкубационный из этих срезов в ТТХ или повышенной K + повлияет базальные теплотехнической холинергических нейронов, что приводит к масштабированию mAchRs в астроциты страты Oriens, которые получают значительную часть холинергической входа 1. Альтернативный пока непроверенной подход к изучению астроцитов рецептора масштабирование в пределах определенной области мозга, с все соединения неповрежденных а масштабирование происходит, может быть использование модели в естественных условиях, где с замедленным высвобождением ТТХ достигается путем имплантации пластIC полимер Elvax 40W выше интересующей области 35. Этот подход был ранее использовались в исследовании нейронов масштабирования, но также должны быть применимы к астроцитов масштабирования. Наконец, с надлежащим считывания, будущие исследования могли бы изучить другие семьи GPCR, в том числе изменений в G с или G I GPCRs. Можно было бы предсказать астроцитов ГАМК B G I GPCRs, будут затронуты следующие ингибирования стрельбы в локально проектирование ГАМК интернейроны в какой-либо подготовки среза. Разработка новых показателей, ориентированных на другие сигнальные молекулы, такие как в режиме реального времени индикатор вторичного мессенджера цАМФ, откроет целую новую область исследований на нейрон-на-астроцитов связи рецепторов.
Двунаправленный масштабирование астроцитарных мГлуР манипуляциями базальных ставок нейрон огневых обеспечивает измерение чувствительности астроцитов к AP-опосредованного высвобождения нейромедиатора. Астроциты-видимому, может ощущать спонтанные точки доступа и glutamaтэ-релиз на Шаффер залога-СА1 пирамидальных клеток синапсов даже когда внеклеточного К + находится в физиологическом диапазоне. В то время как острый применение ТТХ не уменьшает частоту спонтанных астроцитов Са + активность 2 18, 36, 37, + активность Са 2 среди астроцитов в популяции становится декоррелированной 36, что свидетельствует, что астроцитарных рецепторы AP детекторы. Это говорит о том, что астроциты ощутить спонтанные нейронные точек доступа с не влияет на их общее Са 2 + деятельности. Общепризнано, что внутриклеточные концентрации IP 3 должны достигнуть порогового уровня, чтобы стимулировать IP 3 Rs достаточно, чтобы привести к обнаружению Са 2 + высоты. Может спонтанные нейронные ТД активируйте астроцитов GPCRs не производя измеримые Ca 2 + высоты? Будущие исследования могут использовать флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET) или аналогичный технич IQUE (например, BRET) для изучения взаимосвязи между G белка связывания с рецептором (мера активации рецептора) и Ca 2 +-релизе внутренних магазинах. BRET широко используется в пробирке, чтобы обнаружить G белок-на-GPCR муфту 38, хотя это может быть какое-то время, прежде чем эта технология станет доступной для использования в подготовке неповрежденной ткани. Вполне возможно, что астроцитарных GPCRs Gq активизируются гораздо чаще, чем могут быть записаны с использованием имеющихся в настоящее время инструменты Са 2 + визуализации. В дополнение к зондирования потенциалы действия, астроцитарных GPCRs Gq может также быть в состоянии обнаружить миниатюрный квантовых высвобождение нейромедиатора о чем сообщается в недавнем исследовании 39. Двунаправленный метод масштабирования описано здесь могут быть использованы в будущих исследованиях, чтобы обеспечить меры, в какой степени астроцитов Gq GPCRs выявления квантовых везикулярного высвобождение нейромедиатора, путем включения bafilomycin A1 в протоколе инкубации.
ntent "> До сих пор протоколы масштабирования использовались только в срезах гиппокампа мышей несовершеннолетних (p12-p18). Таким образом, в настоящее время неизвестно, если астроцитов масштабирование рецепторов также может быть вызван в ткани, полученных из взрослых мышей. убедительным Недавнее исследование предполагает, что группа Я mGluR выражение в астроциты значительно уменьшается после первой недели возраста и продолжает снижаться до совершеннолетия, с очень низким уровнем экспрессии рецепторов у взрослых астроцитов 40. Поэтому было бы интересно определить, если астроцитарных мГлуР масштабов следующая долго- Термин ингибирование нейронов стрельбы у взрослых ломтиками мыши гиппокампа до уровней, приближающихся к тем, которые наблюдаются в астроциты от мышей несовершеннолетних. Эта находка позволяет предположить, что астроцитов экспрессии рецептора не является статичным в данном возрасте, но могут быстро меняться в зависимости от уровней активности нейронов. В отличие от снижение экспрессии группа I мГлуР у взрослых мышей, информации поступает, что адренорецепторов, в т.ч. и #945; 1А, α 2А и β 1 подтипы, преимущественно выражается астроцитов в головном мозге взрослых 3, 4. Α 1А адренергических Gq ХВГФ может быть привлекательной целью для будущих исследований Нейрон-на-астроцитов связи, в том числе, являются ли эти рецепторы чувствительны к изменениям в адренергических ставок нейрон обжига.The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность центр UC Риверсайд для глиальных-нейронных взаимодействий для полноценного обсуждения протоколов, масштабирования и данных. Авторы также хотели бы дать искреннее спасибо к Abcam за спонсирование публикацию своей работы.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |