Her beskriver vi en tilpasning av protokoller som brukes til å indusere homeostatic plastisitet i nevroner for studiet av plastisitet av astrocytic G protein-koblede reseptorer. Nylig brukt til å undersøke endringer i astrocytic gruppe I mGluRs i juvenile mus, kan metoden brukes til å måle skalering av ulike astrocytic GPCRs, i vev fra voksne mus i situ og in vivo, og for å få en bedre forståelse av sensitiviteten astrocytic reseptorer endringer i neuronal aktivitet.
Nær to tiår med forskning har slått fast at astrocytter i situ og in vivo uttrykke mange G protein-koblede reseptorer (GPCR) som kan bli stimulert av neuronally utgitt senderen. Imidlertid har evnen til astrocytic reseptorer for å oppvise plastisitet som reaksjon på endringer i neuronal aktivitet fått liten oppmerksomhet. Her beskriver vi et modellsystem som kan brukes til å globalt forminske astrocytic gruppe I metabotropiske glutamatreseptorer (mGluRs) i akutte hjerneskiver. Inkludert er metoder for hvordan å forberede parasagittal hippocampus skiver, konstruere kamre egnet for langsiktig skive inkubasjon, toveis manipulere neuronal aksjonspotensial frekvens, last astrocytter og astrocyte prosesser med fluorescerende Ca 2 +-indikatoren, og måle endringer i astrocytic Gq GPCR aktivitet ved opptak spontan og fremkalt astrocyte Ca 2 + hendelser ved hjelp konfokalmikroskopi. I hovedsak en "kalsium roadmap "er gitt for hvordan å måle plastisitet astrocytic GQ GPCR. Anvendelser av den teknikk for undersøkelse av astrocytter er omtalt. Å ha en forståelse av hvordan astrocytic reseptor signalisering er påvirket av endringer i neuronal aktivitet har viktige implikasjoner for både normal synaptisk funksjon samt prosesser underliggende nevrologiske lidelser og nevrodegenerative sykdommer.
Astrocytter svare innen sekunder til stimulering av nerveceller eller nerve axons med økninger i cytoplasma Ca 2 + som følge nesten utelukkende fra aktivering av astrocytic GQ GPCR. For eksempel, muskarine acetylkolinreseptorer 1, cannabinoidreseptorer 2, α 1A adrenerge reseptorer 3, 4, og gruppen jeg mGluRs (se nedenfor) er alle astrocytic Gq GPCR subtyper som akutt reagerer på neuronal aktivitet. Aktivering av astrocytic gruppe I mGluRs er vist i utstrakt grad, etter stimulering av neuronal glutamatergic afferenter in situ (for eksempel akutt hippokampale skiver) 5-7, så vel som i voksne mus cortex in vivo etter sansestimulerings 8.. Utfallet av aktivering av astrocytic Gq GPCR signaliserer på biologi og fysiologi av astrocytter, nevroner, eller astrocyte-neuron interaksjoner har vært en del debatt 9-12. Det vil være some tid før funksjonen av nevron-til-astrocyte reseptor signalisering er fullt verdsatt.
Mens det er klart at nerveceller kan aktivere astrocytic reseptorer ved hjelp av eksperimentelle protokoller, det er sider ved nevron-til-astrocyte reseptor kommunikasjon som fortsatt dårlig forstått. Først den faktiske mengden av neuronal aktivitet er nødvendig for å aktivere astrocytic Gq GPCRs er ikke godt definert, og andre, har evnen til astrocytic reseptorer å vise bruk avhengig plastisitet fått liten oppmerksomhet. For å begynne å ta opp disse spørsmålene, vi har nylig utviklet en protokoll for å indusere toveis skalering av astrocytic gruppe I mGluRs i akutte juvenile hippocampus skiver i respons til langsiktige endringer i nevronale aksjonspotensial (AP)-avhengige synaptiske aktivitet. I likhet med hva som har blitt oppdaget for toveis homeostatic plastisitet nevrale ionotrofiske glutamat reseptorer 13, 14, astrocytic gruppe jeg mGluRs skalerer opp following blokade av nerveaksjonspotensialer og skalere ned når nevronale aksjonspotensial frekvensen økes 15. Disse kompenserende endring i astrocytic reseptorer kan måles ved å ta opp spontant og fremkalt astrocyte Ca 2 +-transienter, og å sammenligne egenskapene til disse hendelsene til de fra astrocytter i kontrollforhold. I dette manuskriptet, beskriver vi komplett metodikk for bruk av denne protokollen, herunder utarbeidelse av akutte hippocampus skiver, inkuberingsforhold å indusere astrocyte reseptor skalering, astrocyte Ca 2 + indikator fargestoff lasting, Ca 2 + bildeteknikker som bruker konfokalmikroskopi, og forventede effekter på astrocyte Gq GPCR aktivitet. Forutsigbare virkninger på astrocyte Ca 2 + signal egenskaper – som tilsvarer de tidligere registrert i dyrkede celler transfektert med ulike uttrykk nivåer av GQ GPCRs – gi et "veikart" som kan brukes i fremtidige studier til analysen for endringer i såtrocytic GPCR uttrykk. Konsekvenser og mulige bruksområder for bruk av denne teknikken vil bidra til vår forståelse av astrocyte-nevronale interaksjoner i den friske og syke hjerne.
De beskrevne skalering modellene representerer praktiske metoder for å forske langsiktig plastisitet astrocytic gruppe jeg mGluRs. Imaging spontane og fremkalt Ca 2 +-hendelser gir en følsom analyse for å måle endringer i astrocytic Gq GPCR aktivitet, som fast bevis har blitt etablert som astrocyte Ca 2 + høyder oppstå etter løslatelsen fra IP 3 R-sensitive butikker nedstrøms Gq GPCR aktivering 10, 12, 17, 18. Andelen av astrocytter i befolkningen svarer til gruppen jeg mGluR agonist og mønsteret av slike Ca 2 + responser rapportere endringer i gruppe I mGluRs av astrocytter.
Den spesifikke teknikken som brukes til å laste astrocytter med Ca 2 +-indikator er et viktig hensyn i utformingen av eksperimenter for å se etter endringer i astrocytic Gq GPCR aktivitet. Bolus-lasting eller bulk-lasting flere astrocytter, eller patch-klemme lasting av individuelle astrocytter kan brukes til bilde Ca 2 + transienter i astrocytter. Hver tilnærmingen gir visse fordeler og ulemper. Direkte fylling astrocytter med Ca 2 + indikator via patch clamp tillater entydig identifisering av cellen som en astrocyte uten behovet for en sekundær markør slik som SR-101. Patch-clamp levering av indikatoren gjør også opptak av Ca 2 + aktivitet fra små astrocytic avdelinger, inkludert de buskete fin prosesser, potensielt dypere i stykket der cellene er sunnere og med flere intakte interaksjoner med synapser (avhengig av laser strøm tilgjengelig). Imidlertid lider patch-clamp lasting fra lav gjennomstrømning som data blir samlet inn en celle om gangen. Bulk-lasting, derimot, kan et stort antall astrocytter være belastet med Ca 2 +-indikator og avbildes samtidig. Det er imidlertid bare astrocytter i nærheten av overflaten (<20 mikrometer) av skiven er lastet, med tilhørende bekymrings om celle helse og intakte synapser.
Mottrykket bolus-lasting protokoll som presenteres her tilbyr en middelvei, med relativt høy gjennomstrømning og muligheten til å overvåke Ca 2 + aktivitet dypere i stykket (40-75 mikrometer). En betydelig økning i andelen av spontant aktive astrocytter hjelp av bolus-lasting teknikken er observert i forhold til bulk-lasting, noe som tyder på at forbindelsene mellom nerve synapser og astrocytic prosesser er mer komplett 15. Med god lasting, kan man ofte overvåke Ca 2 +-aktivitet i hovedprosesser av astrocytter (data ikke vist) eller potensielt enda mindre rom ved hjelp av to-fotonmikroskopi. Men omsorg ville trenge å bli utøvd med å tildele de mindre prosesser til et bestemt astrocyte, som grensene gli inn i uspesifikke bakgrunnsfarging. En ekstra bekymring med bruk av bulk-lasting eller bolus-lasteprosedyrer er behovet for en sekundær marker for astrocyte identifikasjon. Mens det har vært kjent i mange år at astrocytter fortrinnsvis tar opp AM ester av Ca 2 +-indikatorer, er den sekundære markør SR-101 ofte brukt til å verifisere de lastede celler som astrocytter. SR-101 kan i seg selv endre den iboende oppstemthet av nevroner 29. Bruk av SR-101 bekrefter nødvendigheten av å utføre alle astrocyte Ca 2 +-målinger i TTX for å begrense mulige SR-101 effekter på neuronal eksitabilitet. Forutsatt at både kontroll og eksperimentelle gruppene omfatter SR-101, skal markøren i seg selv ikke gjøre rede for effektene som er observert i astrocyte Ca 2 + signale følgende langsiktige manipulering av nerveaksjonspotensialer. SR-101 kan være mer av et problem i høy K +-eksperimenter, men da det kan redusere forskjellen mellom 2,5 mM K + g. 5,0 mM K + hvis basal skuddtakt ikke endres proporsjonalt.
En svært lovende tilnærming til å levere Ca 2 + </sup> Indikatoren til astrocytter har nylig dukket opp som tilbyr et attraktivt alternativ til de mer tradisjonelle tilnærminger ved hjelp av Ca 2 +-fargestoffer. Betydelige fremskritt er gjort i løpet av de siste årene med genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) rettet mot astrocytter 30-32. GECIs kan leveres til astrocytter ved in vivo mikroinjeksjon av adeno-assosierte virale vektorer inn i en region av interesse i hjernen slik som hippocampus. Expression of GECIs oppnås etter ca to uker etter virusinfeksjon 32. Det er mange fordeler som presenteres ved bruken av GECIs i astrocytter. Først blir vektorer rettet til astrocytter ved hjelp av en astrocyte spesifikk promotor, slik at de merkede celler er astrocytter 32. For det andre virker signal-til-støy-nå sammenlignbare med hva som kan oppnås med patch-clamp levering av fargestoff, men uten invasivitet av å ha hatt en patch pipette på cellen 32.. Tredje, kan indikatorene være delivered og uttrykt i voksent vev, noe som er problematisk ved hjelp av bulk-lasting leveringsmåte. Videre er uttrykket mosaikk, og tilbyr muligheten til å skille mellom flere astrocytter. Således kan flere astrocytter potensielt avbildes samtidig, samtidig opptak i soma og fine branchlets samtidig. Derfor kan potensielt én enkelt teknikk kan brukes i stedet for tre separate teknikker (bulk-lasting, bolus-lasting, og patch-clamp lasting) for å spille inn skalering aktivitet av astrocytic GQ GPCRs, sterkt økende effektivitet.
En mulig ulempe med å bruke viral-mediert levering av Ca 2 +-indikatorer til astrocytter er det mulig effekt på skive helse 32. De adeno-assosierte virale vektorer som brukes til å levere de GECIs har vist tidligere å forårsake reaktive gliosis av astrocytter 33. Utarbeidelse av hjernen skiver generelt sannsynlig initierer tidlige stadier av patologi inkludert løslatelse av inflammatory molekyler 10. Derfor, kombinert med de lange inkubasjonstidene kreves for å indusere skalering av astrocytic reseptorer, bruk av GECIs levert ved hjelp av virale vektorer ville trenge for å motta tilleggsvederlag i forbindelse med skive helse i disse typer eksperimenter.
Ved ansettelse av denne protokollen, er det viktig å huske på at søknaden tid for agonist for å produsere et svar vil variere som en funksjon av reseptor tilgjengelighet. For en gitt konsentrasjon av agonist, vil påføringstiden må være lengre hvis reseptorer er skalert ned og kortere hvis reseptorer er skalert opp, for at stoffet skal komme frem til en tilfredsstillende konsentrasjon i vevet i tilstrekkelig grad til å aktivere reseptorene til å produsere en Ca 2 + respons. Det kan derfor hende medikament lukketider, og muligens deres konsentrasjoner, må bli justert, avhengig av den tilsiktede retning av skalering. For eksempel kan agonist-konsentrasjonen må senkes i case av TTX å unngå mette svar, og økte etter inkubasjon skiver i høy K + til og med se en reaksjon. Nærmere bestemt ble den DHPG konsentrasjon forskjøvet 5-15 uM etter TTX behandling til 30-50 uM etter 5,0 mM K + behandling for å studere Ca 2 +-responsmønstre, som 5-15 pM var ofte for lav til å produsere pålitelige responser i astrocytter etter å skalere ned av gruppen jeg mGluRs.
Innspillingen av astrocyte Ca 2 + aktivitet gir ingen direkte bevis for reseptor innsetting eller internalisering til eller fra plasma membranen. Men basert på den bemerkelsesverdige likheten av data med data fra tidligere studier in vitro som undersøkte den direkte sammenhengen mellom GQ GPCR uttrykk nivåer og spontan og fremkalt Ca 2 + transienter 21-24, den mest logiske tolkningen av endringene i Ca 2 + signalisering, er at de astrocyte overflate receptor expression nivåer harforandret. En utfyllende tilnærming kan være en viktig faktor hvis man ønsker å gi ytterligere bevis om locus av effekten på Ca 2 + aktivitet. En strategi vi brukte var å undersøke effekten av TTX inkubasjon på hippocampus skiver fra astrocytic MrgA1R mus. Disse transgene mus uttrykke en utenlandsk Gq GPCR (den MrgA1R) kun i astrocytter. Fordi denne reseptoren ikke er naturlig hjemmehørende i hjernen, er det ingen endogen neurotransmitter til stede for å endre dets aktivitet. Tidligere arbeid antydet at denne reseptoren i inngrep med samme intracellulære signaleringsmolekyler som endogent Gruppe I mGluRs i de samme 34 astrocytter. Etter langvarig inkubering av skiver fra MrgA1R mus i TTX, ingen forskjeller i agonist-fremkalt MrgA1R responser sammenliknet med kullsøster kontroll inkubert skiver vil gi bevis på at virkningen på astrocyte Ca 2 +-aktivitet skyldes endringer lokalisert til overflaten reseptoren, særlig hvis gruppen jeg mGluR svar er fortsatt betydicantly forbedret i de samme astrocytter. Et alternativ, om enn kanskje mer involvert strategi ville være å isolere astrocytter fra skivene for Western blot-analyse, så lenge som en membranfraksjon kan bli analysert for endringer i overflate-reseptor ekspresjonsnivåer. Fluorescens Aktivert Cell Sorting (FACS) eller flowcytometri kan være nyttig her.
De mulige anvendelser av denne teknikken til studiet av nerveceller, astrocytter og astrocyte-nevronale interaksjoner er mange. I våre forsøk, bare DHPG-fremkalt gruppe jeg mGluR astrocytic Ca 2 + Svarene ble studert, i isolerte akutte hippocampus skiver fra juvenile mus. Dette preparatet ikke bare har de intakte afferenter (Schaffer collaterals), men også de nervecellene som gir opphav til dem (CA3 pyramidale celler), noe som gjør det mulig å manipulere avfyring priser på disse glutamatergic nevroner på de postsynaptiske celler (CA1 pyramidale celler) og de astrocytter i stratum radiatum hvis prosesser associate med disse synapsene. Den akutte hippocampus skive er kanskje ikke den beste forberedelsen for å manipulere avfyring priser på andre typer nevroner, men er så mange afferenter avskåret fra de nervecellene som gir opphav til dem. Ikke desto mindre kan det være mulig i visse skive preparater for å observere plastisitet andre astrocytic Gq GPCR subtyper. For eksempel kan skiver være forberedt med basal forebrain kolinerge nevroner og deres anslag til hippocampus intakt. Inkubasjon av disse skiver i TTX eller forhøyet K + ville påvirke basal avfyringshastigheter på kolinerge nerveceller, som fører til skalering av mAchRs i astrocytter av stratum Oriens, som mottar en betydelig del av det kolinerge inngang 1. En alternativ metode er ennå ikke testet for å studere astrocytic reseptor skalering innenfor et bestemt område i hjernen, med alle de forbindelser intakte mens skalerings oppstår, kan være å bruke en in vivo-modell hvor en vedvarende frigjøring av TTX oppnås ved implantering av et plastic polymer Elvax 40W over regionen av interesse 35. Denne tilnærmingen har tidligere vært brukt i en studie av nevronale skalering, men bør også være aktuelt å astrocytic skalering. Til slutt, med riktig avlesning, kan fremtidige studier undersøker andre GPCR familier, inkludert endringer i G s eller g I GPCRs. Man kan forutsi astrocytic GABA B G jeg GPCRs å bli påvirket etter hemming av skyting i lokalt projisere GABA interneuroner innenfor noen skive forberedelse. Utvikling av nye indikatorer rettet mot andre signalmolekyler, som for eksempel en sanntids indikator på den andre messenger cAMP, ville åpne opp et helt nytt område av forskning på nevron-til-astrocyte reseptor kommunikasjon.
Toveis skalering av astrocytic mGluRs ved manipulering av basal neuron fyringsintensitet er et mål på følsomheten av astrocytter til AP-formidlet frigivelse av nevrotransmitter. Astrocytter kan tilsynelatende fornemme spontane APs og glutate utgivelsen på Schaffer sikkerhet-CA1 pyramide celle synapser selv når ekstracellulært K + er innenfor en fysiologisk rekkevidde. Mens akutt anvendelse av TTX ikke redusere hyppigheten av spontane astrocyte Ca 2 +-aktivitet 18, 36, 37, Ca 2 + aktivitet blant astrocytter i befolkningen blir bruk av delte 36, som gir bevis for at astrocytic reseptorer er AP detektorer. Dette tyder på at astrocytter forstand spontane nevronale APs uten innvirkning på deres samlede Ca 2 + aktivitet. Det er allment akseptert at intracellulære konsentrasjoner av IP tre trenger for å nå et terskelnivå for å stimulere IP 3 Rs tilstrekkelig til å føre til en påviselig Ca 2 + høyde. Kunne spontane nevronale APs aktivere astrocytic GPCRs uten å produsere målbare Ca 2 + høyder? Fremtidige studier kan utnytte fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) eller en lignende techn ik (slik som Bret) for å undersøke forholdet mellom G-proteinkobling til reseptoren (et mål på reseptor-aktivering) og Ca2 +-frigjøring fra interne lagre. Bret har vært brukt i stor utstrekning in vitro å påvise G protein-til-GPCR kopling 38, selv om det kan ta tid før denne teknologien blir tilgjengelig for anvendelse i intakte vevspreparater. Det er mulig at astrocytic GQ GPCRs blir aktivert mye oftere enn det som kan registreres ved hjelp av de tilgjengelige Ca 2 + bildebehandlingsverktøy. I tillegg til sensing aksjonspotensialer, kan astrocytic GQ GPCRs også være i stand til å oppdage miniatyr quantal frigjøring av nevrotransmitter som rapportert i en fersk undersøkelse 39. Det toveis skalering metoden beskrevet her kan anvendes i fremtidige studier for å gi et mål på i hvilken grad astrocytic GQ GPCR detektere quantal vesikulært frigjøring av nevrotransmitteren, ved å ta med bafilomycin A1 innenfor inkubasjonstiden protokollen.
ntent "> Så langt skalerings protokoller har bare blitt brukt i hippocampus skiver fra juvenile mus (p12-p18). Derfor er det foreløpig ukjent om astrocytic reseptor skalering kan også fremkalles i vev hentet fra voksne mus. Et overbevisende fersk studie tyder på at gruppen jeg mGluR uttrykk i astrocytter avtar betraktelig etter den første uken av alder og fortsetter å synke til voksen alder, med svært lave nivåer av reseptor uttrykk hos voksne astrocytter 40. Det vil derfor være interessant å finne ut om astrocytic mGluRs skalere opp etter lang Begrepet hemming av nevronal utløsning hos voksne mus hippocampus skiver til nivåer som nærmer seg de sett i astrocytter fra juvenile mus. Dette funnet tyder på at astrocytic reseptor uttrykk er ikke statisk ved en gitt alder, men kan endre seg raskt avhengig av nerve-aktivitet. I motsetning til redusert uttrykk av gruppen jeg mGluRs i voksne mus, er bevis dukker opp som adrenerge reseptorer, inkludert & #945, 1A, α 2A, og β en subtyper, er hovedsakelig uttrykt av astrocytter i den voksne hjernen tre, fire. Den α 1A adrenerge Gq GPCR kan være et attraktivt mål for fremtidige studier av nevron-til-astrocyte kommunikasjon, herunder om disse reseptorene er følsomme for endringer i adrenerge nevroner avfyring priser.The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke UC Riverside Center for Glial-Neuronal Interactions for verdifull diskusjon av skalerings protokoller og data. Forfatterne ønsker også å gi en oppriktig takk til Abcam for å sponse utgivelsen av sitt arbeid.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |