在这里,我们描述了用于诱导稳态可塑性神经元星形胶质细胞的G蛋白偶联受体的可塑性研究方案的适应。最近用于检查变化星形细胞组I型mGluRs在幼年小鼠中,该方法可以应用于测量各种星形细胞G蛋白偶联受体的比例,在从成年小鼠原位和体内组织,并更好地欣赏星形细胞受体的敏感性的变化的神经元活性。
近二十年研究已经证实, 原位和体内星形胶质细胞表达大量的G蛋白偶联受体(GPCR),可以通过neuronally发布的发射器被激发。然而,星形细胞受体表现出的响应变化的神经元活动的可塑性的能力很少受到关注。在这里,我们介绍了可用于全球范围内扩大或缩小规模星形细胞I组急性脑切片代谢型谷氨酸受体(mGluRs的)一个模型系统。当中包括如何准备矢状窦旁海马切片,构建适合长期切片孵化室,双向操纵神经元动作电位频率,负载星形胶质细胞和星形胶质细胞的过程与荧光Ca 2 +的指标,衡量变动情况记录星形细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体活性的方法自发和诱发星形胶质细胞Ca 2 +的使用共聚焦显微镜的事件。在本质上,一个“钙Řoadmap“是为如何衡量星形细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体的可塑性。该技术为星形胶质细胞的研究应用进行了讨论。具有星形细胞受体信号是如何变化所影响神经元活动的理解有两个正常的突触功能以及过程潜在的神经性疾病和神经退行性疾病具有重要意义。
星形胶质细胞在几秒钟内响应的神经元或神经元轴突的刺激增加细胞质中的Ca 2 +引起的激活星形胶质细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体几乎完全。例如,毒蕈碱型乙酰胆碱受体1,大麻素受体2,α1A肾上腺素能受体3,4,和组I型mGluRs(见下文)都是星形细胞Gq蛋白的GPCR亚型急性神经元的活动作出反应。星形细胞组I的mGluRs的活化已被证明最为广泛,下面的神经细胞的谷氨酸能传入原位刺激(如急性海马切片)5-7,以及在成年小鼠皮质体内以下的感官刺激8。星形胶质细胞的激活Gq蛋白G蛋白偶联受体的生物学和星形胶质细胞,神经元,星形胶质细胞或神经元相互作用的生理信令的结果一直是人们争论9-12的问题。这将是S神经元对胶质细胞受体信号传导的功能之前,青梅时间完全理解。
虽然很清楚,神经元可以使用的实验方案激活星形细胞受体,还有一些仍然知之甚少神经元对星形胶质细胞受体的通信的各个方面。首先,要激活星形胶质细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体所需的神经元活动的实际金额不明确,二是星形细胞受体表现出使用依赖性的可塑性的能力很少受到关注。要开始解决这些问题,我们最近开发的协议,诱导星形胶质细胞组I型mGluRs在急性少年海马脑片双向缩放以响应神经元动作电位依赖的长期变化(AP)突触活动。类似于已经发现神经元离子型谷氨酸受体13,14,星形细胞组I型mGluRs扩大FO的双向稳态塑性神经元动作电位llowing封锁和缩减时神经细胞的动作电位频率增加15。在星形细胞受体这些代偿性改变可以通过记录自发进行测量和诱发星形胶质细胞的Ca 2 +瞬变,这些事件的属性进行比较,以从那些在控制条件下的星形胶质细胞。在这个手稿中,我们描述了完整的方法使用该协议的,包括编制急性海马脑片,培养条件诱导星形胶质细胞受体缩放,利用共聚焦显微镜星形胶质细胞的Ca 2 +指示剂负载,Ca 2 +的成像技术,及预期效果在星形胶质细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体的活性。在星形胶质细胞可预见的影响的Ca 2 +信号的属性-它匹配在转Gq蛋白G蛋白偶联受体的不同表达水平培养细胞之前录制的-提供了一个“路线图”,可以在今后的研究中用于测定的变化为trocytic G蛋白偶联受体的表达。所带来的后果和潜在的应用中使用这种技术将有助于我们在健康和疾病脑星形胶质细胞的神经元相互作用的理解。
所描述的缩放模型代表实际的方法为研究星形胶质细胞I组mGluR的长期可塑性。成像自发和诱发的Ca 2 +的事件提供了一个敏感的检测测量变化的星形胶质细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体的活性,作为确凿的证据已证实星形胶质细胞的Ca 2 +浓度升高的情况从Gq蛋白激活G蛋白偶联受体10的下游的IP 3的R-敏感的商店以下版本, 12,17,18。星形胶质细胞星形胶质细胞在人口中的比例响应I组mGluR激动剂和这样的Ca 2 +反应的报告模式转变组I型mGluRs。
用于加载与星形胶质细胞的Ca 2 +指示剂的具体方法是在实验设计中的一个重要的考虑因素,以寻找变化星形细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体的活性。丸装或散装加载多个星形胶质细胞,或p个别的星形胶质细胞的ATCH钳装载可用于图像的Ca 2 +瞬变的星形胶质细胞。每种方法提供了一定的优点和缺点。直接填充星形胶质细胞的Ca 2 +通过膜片钳指示器,可明确辨识的细胞作为而不需要进行二次标记,如SR-101的星形胶质细胞。指示器的膜片钳分娩也使记录的Ca 2 +从小型星形细胞区室,包括毛精细的工序中,在细胞是健康的切片,并用与突触(取决于激光功率可用)更完整的相互作用可能更深的活性。然而,膜片钳装载从低吞吐量患有作为数据收集一格的时间。批量加载,相反,允许装入的Ca 2 +指示剂大量星形胶质细胞,并同时成像。然而,只有星形胶质细胞的表面附近(<20微米)切片的加载,与之相关联的关注是关于细胞的健康和完整的突触。
这里提出的反压丸加载协议提供了一个中间地带,具有相对较高的吞吐量和监控的Ca 2 +活性更深切片(40-75微米)范围内的能力。相比于批量加载中自发主动星形胶质细胞使用丸加载技术的比例显著增加观察,提示神经突触和星形胶质细胞过程间的连接都比较齐全15。具有良好的负荷,可以经常地监视Ca 2 +的活性,使用2 -光子显微镜的星形胶质细胞(数据未示出)或潜在的甚至更小室的主流程。不过,我们需要在分配较小的流程,以一个特定的星形胶质细胞行使,作为边界融入非特异性背景染色。一个额外的关注与使用批量加载或丸加载程序是需要一个二次三月KER星形胶质细胞的识别。虽然已经知道了许多年,星形胶质细胞优先占用AM酯的Ca 2 +的指标,次级标记SR-101通常被用来验证加载的细胞作为星形胶质细胞。 SR-101可以在本身改变神经元29的内在兴奋性。使用SR-101的证实需要执行在TTX所有星形胶质细胞的Ca 2 +测量值,以限制对神经元的兴奋性可能SR-101的效果。假设这两个控制组和实验组包括SR-101,在自身的标记不应该解释为以下长期操作的神经元的动作电位在星形胶质细胞的Ca 2 +信号中观察到的效果。 SR-101可以是一个更值得关注的在高K +的实验,但是,因为它可以减少2.5 mM的钾离子与之间的差5.0 mM的钾离子,如果基底的燃烧率是不按比例改变。
一个非常有前途的方法来提供的Ca 2 + </sup>指示灯星形胶质细胞是近年来发现其使用的Ca 2 +染料提供了一个有吸引力的替代较传统的方法。显著的进步已在过去数年,有针对性的星形胶质细胞30-32基因编码的钙指标(GECIS)。 GECIS可以通过体内注射的腺相关病毒载体到感兴趣如海马脑区域被输送到星形胶质细胞。 GECIS的表达后大约两周下列病毒感染32实现的。还有由星形胶质细胞使用GECIS呈现诸多优势。首先,向量是针对使用星形细胞特异性启动子的星形胶质细胞的,所以标记的细胞是星形胶质细胞32。第二,信号-噪声现在看来这样的举动,可以使用染料的膜片钳分娩方式获得,但没有有过一个补丁吸管的小区32上的侵袭。三,指标可以是DELivered并表示在成人组织,使用批量加载交付方法是有问题的。此外,表达的是马赛克,提供多种星形胶质细胞中分化能力。因此,一些星形胶质细胞可能会被同时成像,同时也记录在体细胞和细小枝在同一时间。因此,有可能一个单一的技术可以被用于代替三个分开的技术(批量加载,丸剂加载和膜片钳负载)来记录的星形细胞Gq蛋白GPCR的缩放活性,大大提高了效率。
使用病毒介导的交付Ca 2 +的指标星形胶质细胞的一个潜在缺点是片上32健康可能造成的影响。用于递送GECIS的腺相关病毒载体已经预先证明可导致星形胶质细胞33的反应性神经胶质增生。一般脑片的制备可能引发病变的早期阶段,包括INF释放lammatory分子10。因此,结合诱导星形胶质细胞受体的比例所需的潜伏期长的时间,使用病毒载体的使用GECIS的交付将需要在这些类型的实验切片健康的情况下获得额外代价。
当使用这个协议,它的报名时间为激动剂产生一个响应会有所不同的受体可用性的功能是很重要的要记住。对于激动剂的一个给定的浓度,施用时间将要更长,如果受体已按比例缩小,和更短的,如果受体已按比例放大,为使药物在组织中激活受体足以产生的Ca 2 +达到足够的浓度响应。因此,药物的施用时间,并有可能它们的浓度,可以具有取决于缩放的预定方向进行调整。例如,激动剂浓度可能需要在c被降低TTX的酶,以避免饱和的反应,并培养在高K +切片甚至看到一个响应之后增加。具体地说,DHPG浓度从5-15μM移TTX治疗30-50微米5.0毫米的K +处理后,以研究Ca 2 +的响应模式,如5-15微米往往太低,以产生可靠的回应后扩展I组mGluR的下跌后,星形胶质细胞。
星形胶质细胞的Ca 2 +的活性的记录提供了受体的插入或内在化或从细胞膜的直接证据。然而,根据来自体外以往的研究,其中审查Gq蛋白G蛋白偶联受体的表达水平和自发的直接关系,并诱发的Ca 2 +瞬变21-24,变化最合乎逻辑的解释中Ca 2 +的数据的数据惊人的相似信令是,星形胶质细胞表面受体的表达水平有改变。一个互补的方法可能是一个重要的考虑因素,如果一个人想提供更多的证据有关的影响对Ca 2 +的活性位点。我们采用的策略是研究河豚毒素的潜伏期从星形胶质细胞MrgA1R小鼠海马脑片的效果。这些转基因小鼠表达外Gq蛋白G蛋白偶联受体(在MrgA1R)仅在星形胶质细胞。因为该受体是不是当地的大脑,没有内源性神经递质存在改变其活性水平。以前的工作表明,这种受体从事相同的细胞内信号分子作为内源性组I型mGluRs在同一星形胶质细胞34。从MrgA1R小鼠在TTX切片后长期培养后,在激动剂诱发MrgA1R反应没有差异相比于同窝对照孵育切片将提供的证据表明,在星形胶质细胞的影响Ca 2 +的活性是由于局部的表面受体变化,特别是如果I组代谢型谷氨酸受体的反应仍然显icantly增强在相同的星形胶质细胞。另一种选择,虽然也许更复杂的策略是从切片进行Western印迹分析分离的星形胶质细胞,只要一个膜部分可用于改变表面受体的表达水平进行分析。荧光激活细胞分选术(FACS)或流式细胞术可能会有所帮助这里。
这种技术对神经元的研究的可能的应用,星形胶质细胞和星形胶质细胞 – 神经元的相互作用是很多的。在我们的实验中,只DHPG诱发的I组mGluR星形细胞的Ca 2 +的反应进行了研究,在从幼年小鼠急性分离海马切片。该制剂不仅具有完好的传入(谢弗络),也认为它们(CA3锥体细胞)引起的神经元,使得可以操纵这些谷氨酸能神经元的放电率到突触后细胞(CA1区锥体细胞)和其进程ASSOCIAT在辐射层中的星形胶质细胞E而这些突触。急性海马脑片可能不适合操作其他类型的神经元的放电频率最好的准备,但是,由于许多传入神经从它们产生的神经元被切断。然而,它可能会在某些片制剂,观察其它星形细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体亚型的可塑性。例如,切片可与基底前脑胆碱能神经元及其预测准备海马完好。这些切片中的TTX或升高的K +的孵化会影响胆碱能神经元的基底燃烧率,从而导致mAchRs的缩放在地层oriens的星形胶质细胞,其接收胆碱能输入1的显著部分。另一种研究大脑的特定区域之内的星形细胞受体缩放,与所有完整的连接而结垢发生时,可以使用一种体内模型,其中TTX的持续释放是通过PLAST植入实现尚未检验方法关注35以上的地区IC聚合物的Elvax 40W。这种方法已在神经元比例的研究以前使用,但也应适用于星形胶质细胞的比例。最后,用正确的读出,未来的研究可以探讨其他G蛋白偶联受体家族,包括改变G S或G 我 G蛋白偶联受体。也许有人会预测星形细胞的GABA B G我的GPCR受到影响下面的局部投影任何片内准备GABA的interneurons抑制射击。靶向其他信号分子,如第二信使cAMP的实时指标新指标的开发,将开辟的神经元到星形胶质细胞受体传播研究一个全新的领域。
星形细胞mGluR的通过操纵基底神经元放电频率的双向定标提供了星形胶质细胞的神经递质的AP-介导的释放灵敏度的测量。星形胶质细胞可以明显地感觉到自发的AP和glutamaTE发布在谢弗侧支-CA1锥体细胞突触甚至当细胞外K +是一种生理范围内。虽然河豚毒素急性应用程序不减少星形胶质细胞自发的频率Ca 2 +的活动18,36,37,在成为去相关的36人口的星形胶质细胞中的Ca 2 +的活性,提供的证据表明,星形胶质细胞受体的AP探测器。这表明,星形胶质细胞自发的感觉神经元的AP与他们的整体Ca 2 +的活性没有影响。它已被广泛接受的细胞内浓度的IP 3的需要达到一个阈值电平,以刺激IP 3卢比到足以导致可检测Ca 2 +的升高。可以自发的神经元的AP激活星形胶质细胞的G蛋白偶联受体,而不产生可衡量的Ca 2 +升高?未来的研究可以利用荧光共振能量转移(FRET)或类似的技术部历史神游(如BRET)研究G蛋白偶联的受体(受体激活的量度)和Ca 2 +的释放从内部存储之间的关系。 BRET已被广泛用于在体外检测G蛋白对GPCR耦合38,尽管它可能需要一些时间这项技术变得可用于在完整的组织制剂后使用。这可能是星形细胞Gq蛋白的GPCR被激活大大多于可以使用当前可用的Ca 2 +的成像工具被记录。除了 感知动作电位,星形细胞Gq蛋白G蛋白偶联受体也可能是能够检测神经递质的微型量子释放的报道在最近的研究39。这里描述的双向缩放方法可用于在将来的研究中,以提供给该星形细胞Gq蛋白GPCR的检测量子囊泡释放神经递质,通过包括巴弗洛霉素A1在孵化协议的程度的一种度量。
ntent“>到目前为止,缩放协议都只是从幼年小鼠(P12-P18)海马使用,因此它是目前未知的,如果星形细胞受体的比例也可以诱导成年小鼠的组织。一个引人注目的最近的一项研究表明,星形胶质细胞I组mGluR表达的年龄后的第一周大幅减弱,并继续下降,直到成年,在成年星形胶质细胞40受体的表达水平很低,因此这将是有趣的,以确定是否星状细胞的mGluRs扩大下长长期抑制成年小鼠海马脑片的水平接近的负责人在幼年小鼠星形胶质细胞神经元放电。这个发现表明,星形胶质细胞受体表达也不是一成不变的在给定的年龄,但可以迅速改变取决于神经元活动的水平。相反, I组在成年小鼠mGluR的表达降低,有证据表明肾上腺素能受体,包括&#945,1A,2Aα和β1亚型,主要是通过在成人大脑3,4星形胶质细胞表达。在α1A肾上腺素Gq蛋白G蛋白偶联受体可能是神经元对胶质细胞通信未来的研究,包括这些受体是否改变肾上腺素能神经元放电频率敏感的一个有吸引力的目标。The authors have nothing to disclose.
作者要感谢加州大学河滨分校的中心胶质细胞神经元的相互作用的缩放协议和数据有价值的讨论。作者也想给一个真诚的感谢您对Abcam公司赞助其作品的出版。
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |