यहाँ हम astrocytic जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के plasticity के अध्ययन के लिए न्यूरॉन्स में homeostatic plasticity प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर आधारित एक फिल्म का वर्णन. हाल ही में astrocytic समूह किशोर चूहों में मैं mGluRs में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, विधि बगल में और vivo में वयस्क चूहों से ऊतक में, विभिन्न astrocytic GPCRs की स्केलिंग को मापने के लिए, और astrocytic रिसेप्टर्स की संवेदनशीलता का एक बेहतर सराहना हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता है neuronal गतिविधि में परिवर्तन करने के लिए.
अनुसंधान के दो दशकों के करीब बगल में और vivo में astrocytes neuronally में जारी ट्रांसमीटर द्वारा प्रेरित किया जा सकता है कि कई जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) व्यक्त कि की स्थापना की है. हालांकि, neuronal गतिविधि में बदलाव के जवाब में plasticity प्रदर्शन करने के लिए astrocytic रिसेप्टर्स की क्षमता कम ध्यान दिया गया है. यहाँ हम विश्व स्तर तक पैमाने या astrocytic समूह नीचे मैं तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (mGluRs) metabotropic करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मॉडल प्रणाली का वर्णन. शामिल bidirectionally फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक के साथ neuronal कार्रवाई संभावित आवृत्ति, भार astrocytes और astrocyte प्रक्रियाओं में हेरफेर, लंबी अवधि टुकड़ा ऊष्मायन के लिए उपयुक्त कक्षों का निर्माण, parasagittal hippocampal स्लाइस तैयार है, और रिकॉर्डिंग से astrocytic GQ GPCR गतिविधि में परिवर्तन को मापने के लिए कैसे पर तरीके हैं confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहज और पैदा astrocyte सीए 2 + घटनाओं. संक्षेप में, एक "कैल्शियम Roadmap "astrocytic GQ GPCRs के plasticity को मापने के लिए के लिए प्रदान की जाती है. Astrocytes के अध्ययन के लिए तकनीक के आवेदन पर विचार विमर्श कर रहे हैं. Astrocytic रिसेप्टर संकेतन neuronal गतिविधि में परिवर्तन से प्रभावित है की एक समझ के बाद दोनों सामान्य synaptic समारोह के साथ ही प्रक्रियाओं अंतर्निहित मस्तिष्क संबंधी विकार और neurodegenerative रोग के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.
Astrocytes 2 + astrocytic GQ GPCRs की सक्रियता से लगभग विशेष परिणामस्वरूप cytoplasmic CA में वृद्धि के साथ न्यूरॉन्स या neuronal axons की उत्तेजना को सेकंड के भीतर जवाब. उदाहरण के लिए, मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स 1, cannabinoid रिसेप्टर्स 2, α 1 ए एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स 3, 4, और समूह मैं mGluRs (नीचे देखें) तीव्रता से neuronal गतिविधि का जवाब है कि सभी astrocytic GQ GPCR उपप्रकार हैं. Astrocytic समूह मैं mGluRs के सक्रियण (जैसे तीव्र hippocampal स्लाइस के रूप में) बगल में neuronal glutamatergic afferents की उत्तेजना 5-7, साथ ही इन विवो में वयस्क माउस प्रांतस्था में संवेदी उत्तेजना 8 निम्नलिखित के बाद, सबसे बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया गया है. जीव विज्ञान और astrocytes, न्यूरॉन्स, या astrocyte न्यूरॉन बातचीत के शरीर क्रिया विज्ञान पर संकेत astrocytic GQ GPCR की सक्रियता का परिणाम बहस 9-12 की बात की गई है. यह है हो जाएगान्यूरॉन से astrocyte रिसेप्टर संकेतन के समारोह से पहले ome समय पूरी तरह से सराहना की है.
यह न्यूरॉन्स प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग astrocytic रिसेप्टर्स को सक्रिय कर सकते हैं कि स्पष्ट है, बुरा समझा रहते हैं कि न्यूरॉन से astrocyte रिसेप्टर संचार के पहलू हैं. सबसे पहले, astrocytic GQ GPCRs सक्रिय करने की आवश्यकता neuronal गतिविधि की वास्तविक राशि अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है, और दूसरा, उपयोग पर निर्भर plasticity प्रदर्शन करने के लिए astrocytic रिसेप्टर्स की क्षमता कम ध्यान दिया गया है. इन सवालों का पता करने के लिए शुरू करने के लिए, हमने हाल ही में neuronal कार्य क्षमता में दीर्घकालिक परिवर्तन (एपी) पर निर्भर synaptic गतिविधि के जवाब में astrocytic समूह तीव्र किशोर hippocampal स्लाइस में मैं mGluRs की द्विदिश स्केलिंग प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है. मैं mGluRs के लिए ऊपर पैमाने पर neuronal ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 13, 14, astrocytic समूह की द्विदिश homeostatic plasticity के लिए खोज की गई है के समानllowing neuronal कार्रवाई क्षमता की नाकाबंदी और neuronal कार्रवाई संभावित आवृत्ति 15 की वृद्धि हुई है जब नीचे पैमाने. Astrocytic रिसेप्टर्स में ये प्रतिपूरक परिवर्तन सहज रिकॉर्डिंग से मापा और astrocyte सीए 2 + यात्रियों पैदा की और नियंत्रण की स्थिति में astrocytes से उन लोगों के लिए इन घटनाओं के गुणों की तुलना की जा सकती है. इस पांडुलिपि में, हम astrocyte रिसेप्टर स्केलिंग प्रेरित करने के लिए तीव्र hippocampal स्लाइस, ऊष्मायन शर्तों की तैयारी सहित, इस प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए पूरी पद्धति का वर्णन, astrocyte सीए 2 + सूचक डाई लोड हो रहा है, सीए 2 + इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर, और उम्मीद प्रभाव astrocyte GQ GPCR गतिविधि पर. Astrocyte पर उम्मीद के मुताबिक प्रभाव 2 सीए संकेत गुणों + – GQ GPCRs के विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट संवर्धित कोशिकाओं में पहले से रिकॉर्ड से मेल – जो के रूप में परिवर्तन के लिए परख करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक "रोडमैप" प्रदानtrocytic GPCR अभिव्यक्ति. इस तकनीक के इस्तेमाल के लिए प्रभाव और संभावित अनुप्रयोगों स्वस्थ और रोगग्रस्त मस्तिष्क में astrocyte-neuronal बातचीत की हमारी समझ के लिए योगदान देगा.
वर्णित स्केलिंग मॉडल astrocytic समूह मैं mGluRs की लंबी अवधि के plasticity शोध के लिए व्यावहारिक तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं. इमेजिंग सहज और पैदा सीए 2 + घटनाओं, ठोस सबूत astrocyte सीए 2 + उन्नयन GQ GPCR सक्रियण 10 के बहाव आईपी 3 आर संवेदनशील दुकानों से रिहाई के बाद होती है कि स्थापित किया गया है, के रूप में astrocytic GQ GPCR गतिविधि में परिवर्तन को मापने के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करता है 12, 17, 18. जनसंख्या में astrocytes का प्रतिशत समूह मैं mGluR एगोनिस्ट और ऐसे सीए 2 + प्रतिक्रियाओं के पैटर्न का जवाब देने astrocytes द्वारा समूह मैं mGluRs में परिवर्तन रिपोर्ट.
सीए 2 + सूचक के साथ astrocytes लोड करने के लिए प्रयोग किया जाता विशिष्ट तकनीक astrocytic GQ GPCR गतिविधि में परिवर्तन देखने के लिए प्रयोगों के डिजाइन में एक महत्वपूर्ण विचार है. सांस में लोडिंग या थोक लोड कई astrocytes, या पीव्यक्तिगत astrocytes के ATCH दबाना लोड हो रहा है astrocytes में छवि सीए 2 + यात्रियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक दृष्टिकोण कुछ फायदे और नुकसान प्रदान करता है. सीधे पैच दबाना के माध्यम से सीए 2 + सूचक के साथ astrocytes भरने ऐसे एसआर-101 के रूप में एक माध्यमिक मार्कर के लिए आवश्यकता के बिना एक astrocyte के रूप में सेल की स्पष्ट पहचान देता है. सूचक का पैच दबाना वितरण भी कोशिकाओं को स्वस्थ हैं जहां टुकड़ा में और synapses (उपलब्ध लेजर शक्ति पर निर्भर करता है) के साथ और अधिक बरकरार बातचीत के साथ संभावित गहरी जंगली ठीक प्रक्रियाओं, सहित छोटे astrocytic डिब्बों से सीए 2 + गतिविधि की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है. डेटा एक बार में एक कक्ष एकत्र कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि पैच दबाना लोडिंग कम throughput से ग्रस्त है. थोक लोड हो रहा है, इसके विपरीत, astrocytes की एक बड़ी संख्या में सीए 2 + सूचक के साथ भरी हुई है और एक साथ imaged किया जा अनुमति देता है. हालांकि, केवल astrocytes सतह के पास टुकड़ा (<20 माइक्रोन) जुड़े चिंता के साथ, लोड कर रहे हैंसेल स्वास्थ्य और बरकरार synapses के बारे में है.
यहाँ प्रस्तुत backpressure सांस लोडिंग प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत उच्च throughput और टुकड़ा (40-75 माइक्रोन) के भीतर गहरी सीए 2 + गतिविधि पर नजर रखने की क्षमता के साथ, एक बीच का रास्ता प्रदान करता है. सांस में लोडिंग तकनीक का उपयोग कर अनायास सक्रिय astrocytes के प्रतिशत में एक उल्लेखनीय वृद्धि neuronal synapses और astrocytic प्रक्रियाओं के बीच कनेक्शन 15 अधिक पूरा कर रहे हैं, सुझाव है कि थोक लोडिंग की तुलना में मनाया जाता है. अच्छा लदान के साथ, एक बार 2 photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग astrocytes (नहीं दिखाया डेटा) या संभवतः भी छोटे डिब्बों की मुख्य प्रक्रियाओं में सीए 2 + गतिविधि की निगरानी कर सकते. हालाँकि, ध्यान सीमाओं अविशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला में मिश्रण के रूप में, एक विशेष astrocyte के लिए छोटे प्रक्रियाओं बताए में प्रयोग करने की आवश्यकता होगी. थोक लोडिंग या सांस लोडिंग प्रक्रियाओं के उपयोग के साथ एक अतिरिक्त चिंता एक माध्यमिक मार्च के लिए की जरूरत हैastrocyte पहचान के लिए केर. यह astrocytes preferentially सीए 2 + संकेतक AM एस्टर ऊपर ले कि कई वर्षों के लिए जाना जाता रहा है, वहीं माध्यमिक मार्कर एसआर-101 अक्सर astrocytes के रूप में भरी हुई कोशिकाओं को सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एसआर-101 अपने आप में न्यूरॉन्स 29 की आंतरिक excitability बदल सकता है. एसआर-101 का प्रयोग neuronal excitability पर संभव एसआर-101 प्रभाव को सीमित करने के लिए TTX में सभी astrocyte सीए 2 + माप प्रदर्शन करने की जरूरत की पुष्टि होती है. नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों दोनों एसआर-101 में शामिल मानते हुए कि, अपने आप में मार्कर neuronal कार्रवाई क्षमता के लंबी अवधि के हेरफेर निम्नलिखित astrocyte सीए 2 + संकेतन में मनाया प्रभाव के लिए खाते में नहीं होना चाहिए. यह 2.5 मिमी कश्मीर + बनाम के बीच अंतर कम हो सकता है के रूप में एसआर-101, तथापि, उच्च + K प्रयोगों में एक चिंता का विषय हो सकता है 5.0 मिमी कश्मीर + बेसल फायरिंग दर आनुपातिक रूप से परिवर्तित नहीं है.
सीए 2 + वितरित करने के लिए एक बहुत ही होनहार दृष्टिकोण </sup> Astrocytes के लिए सूचक सीए 2 + रंगों का उपयोग कर अधिक परंपरागत तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है जो हाल ही में उभरा है. उल्लेखनीय प्रगति astrocytes 30-32 के लिए लक्षित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) के साथ पिछले कुछ वर्षों में किया गया है. GECIs ऐसे हिप्पोकैम्पस के रूप में ब्याज की एक मस्तिष्क क्षेत्र में एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर के vivo microinjection द्वारा astrocytes के लिए दिया जा सकता है. GECIs की अभिव्यक्ति वायरल संक्रमण 32 निम्नलिखित लगभग दो सप्ताह के बाद हासिल की है. Astrocytes में GECIs के उपयोग द्वारा प्रस्तुत कई फायदे हैं. सबसे पहले, वैक्टर एक astrocyte विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग astrocytes को निशाना बनाया, तो लेबल कोशिकाओं astrocytes 32 हैं. दूसरा, संकेत करने वाली शोर अब लेकिन सेल 32 पर एक पैच विंदुक था होने के invasiveness के बिना, डाई का पैच दबाना वितरण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है क्या करने के लिए तुलनीय है. तीसरा, संकेतक डेल हो सकता हैivered और थोक लदान प्रसव के तरीके का उपयोग समस्याग्रस्त है जो वयस्क ऊतकों में व्यक्त किया. इसके अलावा, अभिव्यक्ति कई astrocytes के बीच अंतर करने की क्षमता की पेशकश की पच्चीकारी है. यह भी एक ही समय में सोमा और ठीक टहनियों में रिकॉर्डिंग इस प्रकार, जबकि कई astrocytes संभवतः, एक साथ imaged किया जा सकता है. इसलिए, संभवतः एक ही तकनीक बहुत कार्यकुशलता बढ़ाने, astrocytic GQ GPCRs की स्केलिंग गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए तीन अलग तकनीक (थोक लोड हो रहा है, सांस में लोडिंग, और पैच दबाना लोड हो रहा है) के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.
Astrocytes के लिए सीए 2 + संकेतक के वायरल की मध्यस्थता वितरण का उपयोग करने का एक संभावित दोष यह टुकड़ा स्वास्थ्य 32 पर संभव प्रभाव है. GECIs देने के लिए इस्तेमाल एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर astrocytes 33 की प्रतिक्रियाशील gliosis पैदा करने के लिए पहले से दिखाया गया है. सामान्य रूप में मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी संभावना inf की रिहाई सहित विकृति के प्रारंभिक दौर आरंभ करता हैlammatory 10 अणुओं. इसलिए, GECIs का उपयोग वायरल वैक्टर का उपयोग कर दिया astrocytic रिसेप्टर्स की स्केलिंग को प्रेरित करने के लिए आवश्यक लंबी ऊष्मायन टाइम्स, साथ संयुक्त प्रयोगों के इन प्रकारों में टुकड़ा स्वास्थ्य के संदर्भ में अतिरिक्त ध्यान प्राप्त करने की आवश्यकता होगी.
इस प्रोटोकॉल को रोजगार है, यह एक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए एगोनिस्ट के लिए आवेदन समय रिसेप्टर उपलब्धता के एक समारोह के रूप में अलग अलग होंगे कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है. एगोनिस्ट की दी एकाग्रता के लिए, आवेदन समय रिसेप्टर्स नीचे पहुंचा, और कम किया है तो रिसेप्टर्स एक सीए 2 + निर्माण करने के लिए पर्याप्त रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए ऊतक में एक पर्याप्त एकाग्रता तक पहुँचने के लिए दवा के लिए, ऊपर पहुंचा दिया है कि अगर लंबे समय तक रहना होगा प्रतिक्रिया. इसलिए, दवा आवेदन टाइम्स, और संभवतः उनके सांद्रता, स्केलिंग का इरादा दिशा पर निर्भर करता है समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, agonist एकाग्रता सी में उतारा जाना पड़ सकता हैTTX के एएसई प्रतिक्रियाओं saturating से बचने, और यहां तक कि एक प्रतिक्रिया देखने के लिए उच्च + K में स्लाइस incubating के बाद वृद्धि हुई है. विशेष रूप से, DHPG एकाग्रता 5-15 माइक्रोन अक्सर में विश्वसनीय प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए बहुत कम था, के रूप में सीए 2 + प्रतिक्रिया पैटर्न का अध्ययन करने के क्रम में 5.0 मिमी + K उपचार के बाद 30-50 माइक्रोन तक TTX उपचार के बाद 5-15 माइक्रोन से स्थानांतरित कर दिया गया था समूह मैं mGluRs के नीचे स्केलिंग के बाद astrocytes.
Astrocyte सीए 2 + गतिविधि की रिकॉर्डिंग प्लाज्मा झिल्ली को या से रिसेप्टर प्रविष्टि या internalization का कोई प्रत्यक्ष सबूत उपलब्ध कराता है. हालांकि, GQ GPCR अभिव्यक्ति के स्तर और सहज बीच सीधे संबंध की जांच की और सीए 2 + यात्रियों 21-24, सीए 2 + में परिवर्तन का सबसे तार्किक व्याख्या पैदा की जो इन विट्रो में पिछले अध्ययनों से डेटा के साथ डेटा की उल्लेखनीय समानता के आधार पर संकेतन astrocyte सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर हैबदला. एक सीए 2 + गतिविधि पर प्रभाव का ठिकाना बारे में अतिरिक्त साक्ष्य प्रदान करना चाहता है, तो एक पूरक दृष्टिकोण से एक महत्वपूर्ण विचार हो सकता है. हम इस्तेमाल एक रणनीति astrocytic MrgA1R चूहों से hippocampal स्लाइस पर TTX ऊष्मायन के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था. इन ट्रांसजेनिक चूहों केवल astrocytes में एक विदेशी GQ GPCR (MrgA1R) व्यक्त करते हैं. इस रिसेप्टर मस्तिष्क का निवासी नहीं है, क्योंकि अपनी गतिविधि का स्तर परिवर्तित करने के लिए उपस्थित नहीं अंतर्जात neurotransmitter है. पिछला काम इस रिसेप्टर एक ही astrocytes 34 में अंतर्जात समूह मैं mGluRs रूप संकेतन अणुओं वही intracellular संलग्न है कि सुझाव दिया. TTX में MrgA1R चूहों से स्लाइस के बाद लंबे समय तक ऊष्मायन, littermate नियंत्रण की तुलना में एगोनिस्ट पैदा MrgA1R प्रतिक्रियाओं में कोई मतभेद नहीं, स्लाइस astrocyte पर प्रभाव सीए 2 + गतिविधि सतह रिसेप्टर के लिए स्थानीय परिवर्तन की वजह से है कि सबूत उपलब्ध कराएगा incubated विशेष रूप से समूह मैं mGluR प्रतिक्रियाओं अभी भी signif रहे हैंicantly एक ही astrocytes में बढ़ाया. एक विकल्प है, शायद अधिक शामिल रणनीति के रूप में लंबे समय से एक झिल्ली अंश सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, जैसा कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए स्लाइस से astrocytes को अलग करने के लिए किया जाएगा, हालांकि. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) या प्रवाह cytometry यहाँ मददगार हो सकता है.
न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों, astrocytes और astrocyte-neuronal बातचीत कई हैं. हमारे प्रयोगों में, केवल DHPG पैदा समूह मैं astrocytic सीए 2 + प्रतिक्रियाओं किशोर चूहों से अलग तीव्र hippocampal स्लाइस में, अध्ययन किया गया mGluR. यह तैयारी बरकरार afferents (Schaffer कोलेटरल), लेकिन यह भी उन्हें (CA3 पिरामिड कोशिकाओं) को जन्म दे कि न्यूरॉन्स है कि यह संभव postsynaptic कोशिकाओं (सीए 1 पिरामिड कोशिकाओं) पर इन glutamatergic न्यूरॉन्स की फायरिंग दर में हेरफेर करने के लिए कर रही है और न ही जिसका प्रक्रियाओं associat परत radiatum में astrocytesइन synapses के साथ ई. तीव्र hippocampal टुकड़ा न्यूरॉन्स के अन्य प्रकार की फायरिंग दरों से छेड़छाड़ के लिए सबसे अच्छी तैयारी नहीं हो सकता है, तथापि, के रूप में कई afferents उन्हें को जन्म दे कि न्यूरॉन्स से कटे हैं. फिर भी, यह अन्य astrocytic GQ GPCR उपप्रकार के plasticity निरीक्षण करने के लिए कुछ टुकड़ा तैयारी में संभव हो सकता है. उदाहरण के लिए, स्लाइस बरकरार हिप्पोकैम्पस के लिए बेसल अग्रमस्तिष्क cholinergic न्यूरॉन्स और उनके अनुमानों के साथ तैयार किया जा सकता है. TTX या ऊंचा + K में इन स्लाइस की ऊष्मायन कोलिनर्जिक इनपुट 1 के एक महत्वपूर्ण हिस्से को प्राप्त जो परत oriens की astrocytes में mAchRs के स्केलिंग के लिए अग्रणी cholinergic न्यूरॉन्स की बेसल फायरिंग दरों को प्रभावित करेगा. एक वैकल्पिक स्केलिंग तब होती है, जबकि TTX की एक निरंतर जारी एक प्लास्ट का आरोपण द्वारा हासिल की है, जहां एक Vivo में मॉडल का उपयोग करने के लिए हो सकता है बरकरार कनेक्शन के सभी के साथ मस्तिष्क के एक विशेष क्षेत्र के भीतर astrocytic रिसेप्टर स्केलिंग, अध्ययन करने के लिए अभी तक untested दृष्टिकोणआईसी बहुलक Elvax 40W ब्याज 35 के क्षेत्र के ऊपर. यह दृष्टिकोण neuronal स्केलिंग के एक अध्ययन में पहले से इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी astrocytic स्केलिंग के लिए लागू किया जाना चाहिए. अंत में, उचित readout के साथ, भविष्य के अध्ययन जी एस या जी मैं GPCRs में परिवर्तन सहित अन्य GPCR परिवारों की जांच कर सके. एक मैं GPCRs स्थानीय स्तर पर किसी भी टुकड़ा तैयारी के भीतर GABA interneurons पेश करने में फायरिंग के निषेध निम्नलिखित प्रभावित होने की astrocytic GABA बी जी की भविष्यवाणी सकता. इस तरह के दूसरे दूत शिविर के एक वास्तविक समय सूचक के रूप में अन्य संकेतन अणुओं को लक्षित नए संकेतकों के विकास, न्यूरॉन करने वाली astrocyte रिसेप्टर संचार पर अनुसंधान का एक नया क्षेत्र खुल जाएगा.
बेसल न्यूरॉन फायरिंग दरों के हेरफेर से astrocytic mGluRs के द्विदिश स्केलिंग neurotransmitter के एपी की मध्यस्थता रिलीज करने के लिए astrocytes की संवेदनशीलता का एक उपाय प्रदान करता है. Astrocytes जाहिरा तौर पर सहज ए पी एस और glutama समझ सकते हैंकोशिकी कश्मीर + एक शारीरिक सीमा के भीतर है, तब भी जब Schaffer जमानत के-CA1 पिरामिड सेल synapses पर ते रिहाई. TTX की तीव्र आवेदन सहज astrocyte की आवृत्ति astrocytic रिसेप्टर्स एपी डिटेक्टरों हैं कि सबूत उपलब्ध कराने सीए 2 + गतिविधि 18, 36, 37, हो जाता है 36 decorrelated आबादी में astrocytes के बीच सीए 2 + गतिविधि को कम नहीं करता है. इस astrocytes कोई उनके समग्र सीए 2 + गतिविधि पर असर के साथ सहज neuronal APs भावना है कि पता चलता है. यह व्यापक रूप से आईपी 3 के intracellular सांद्रता एक detectable सीए 2 + ऊंचाई करने के लिए नेतृत्व करने के लिए पर्याप्त रूप से आईपी 3 रुपये प्रोत्साहित करने के लिए एक सीमा के स्तर तक पहुँचने की जरूरत है कि स्वीकार कर लिया है. सहज neuronal APs औसत दर्जे सीए 2 + उन्नयन के बिना उत्पादन astrocytic GPCRs को सक्रिय कर सकता है? भविष्य के अध्ययन प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) या इसी तरह के एक techn उपयोग कर सकता रिसेप्टर को जी प्रोटीन युग्मन (रिसेप्टर सक्रियण का एक उपाय) और आंतरिक दुकानों से सीए 2 + रिहाई के बीच संबंध की जांच करने के लिए (जैसे कि ब्रेट के रूप में) ique. इस तकनीक बरकरार ऊतक तैयारी में इस्तेमाल के लिए उपलब्ध हो जाता है कि कुछ समय पहले हो सकता है, हालांकि ब्रेट, जी प्रोटीन से GPCR युग्मन 38 का पता लगाने के लिए इन विट्रो में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. यह astrocytic GQ GPCRs बहुत अधिक बार वर्तमान में उपलब्ध सीए 2 + इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करके दर्ज किया जा सकता से सक्रिय किया जा रहा है कि संभव है. कार्रवाई क्षमता संवेदन के अलावा, astrocytic GQ GPCRs भी हाल के एक अध्ययन में 39 रिपोर्ट में neurotransmitter के लघु quantal रिहाई पता लगाने में सक्षम हो सकता है. यहाँ वर्णित द्विदिश स्केलिंग पद्धति जो astrocytic GQ GPCRs ऊष्मायन प्रोटोकॉल में bafilomycin A1 शामिल करके neurotransmitter के quantal vesicular रिहाई, पता लगाने के लिए किस हद तक का एक उपाय प्रदान करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
astrocytic रिसेप्टर स्केलिंग भी वयस्क चूहों से प्राप्त ऊतकों में प्रेरित किया जा सकता है अगर ntent "> इस प्रकार अब तक, स्केलिंग प्रोटोकॉल केवल किशोर चूहों (P12-P18) से hippocampal स्लाइस में इस्तेमाल किया गया है. इसलिए, यह अभी अज्ञात है. एक सम्मोहक ताजा अध्ययन astrocytes में समूह मैं mGluR अभिव्यक्ति उम्र के पहले हफ्ते के बाद काफी कम हो और वयस्क astrocytes 40 में रिसेप्टर अभिव्यक्ति की बहुत कम स्तर के साथ, वयस्कता तक गिरावट जारी है. इसलिए यह astrocytic mGluRs निम्नलिखित ऊपर पैमाने निर्धारित करने के लिए दिलचस्प होगा पता चलता है लंबी किशोर चूहों से astrocytes में देखा उन निकट स्तर के लिए वयस्क माउस hippocampal स्लाइस में neuronal फायरिंग की अवधि के निषेध. यह निष्कर्ष astrocytic रिसेप्टर अभिव्यक्ति एक भी उम्र में स्थिर नहीं है लेकिन neuronal गतिविधि के स्तर पर निर्भर करता है तेजी से बदल सकते हैं सुझाव है. के विपरीत वयस्क चूहों में समूह मैं mGluRs की कम अभिव्यक्ति, सबूत सहित & # कि एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स, उभर रहा है945, 1 ए, α 2A, और β 1 उपप्रकार, मुख्य रूप से वयस्क मस्तिष्क 3, 4 में astrocytes द्वारा व्यक्त कर रहे हैं. α 1 ए एड्रीनर्जिक GQ GPCR इन रिसेप्टर्स एड्रीनर्जिक न्यूरॉन फायरिंग दरों में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं कि क्या सहित न्यूरॉन करने वाली astrocyte संचार के भविष्य के अध्ययन के लिए एक आकर्षक लक्ष्य हो सकता है.The authors have nothing to disclose.
लेखकों स्केलिंग प्रोटोकॉल और डेटा की बहुमूल्य चर्चा के लिए glial-neuronal बातचीत के लिए यूसी रिवरसाइड केंद्र को स्वीकार करना होगा. लेखकों को भी अपने काम के प्रकाशन के प्रायोजन के लिए Abcam के लिए एक गंभीर धन्यवाद देना चाहूंगा.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |