Här beskriver vi en anpassning av protokoll som används för att inducera homeostatiska plasticitet i nervceller för studiet av plasticiteten hos astrocytiska G-proteinkopplade receptorer. Nyligen används för att undersöka förändringar i astrocytic grupp I mGluRs hos unga möss, kan metoden användas för att mäta skalning av olika astrocytiska GPCRs, i vävnad från vuxna möss i situ och in vivo, och att få en bättre uppfattning om hur känsliga astrocytiska receptorer på förändringar i neuronal aktivitet.
Nära två decennier av forskning har visat att astrocyter i situ-och in vivo uttrycker många G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som kan stimuleras av neuronalt släppt sändare. Däremot har förmåga astrocytiska receptorer att ställa ut plasticitet som svar på förändringar i nervaktivitet fått lite uppmärksamhet. Här beskriver vi ett modellsystem som kan användas för att globalt skala upp eller ner astrocytic grupp I metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) i akut hjärnan skivor. Inkluderat är metoder för att förbereda parasagittal hippocampus skivor, konstruera kammare lämpliga för långsiktig skiva inkubation, dubbelriktat manipulera neuronal aktionspotential frekvens, last astrocyter och astrocyternas processer med fluorescerande Ca 2 + indikator, och mäta förändringar i astrocytic Gq GPCR aktivitet genom inspelning spontana och framkallade astrocyternas Ca 2 +-händelser med hjälp av konfokalmikroskopi. I huvudsak en "kalcium roadmap "är anges hur man mäter plasticitet av astrocytiska Gq GPCRs. Tillämpningar av tekniken för studium av astrocyter diskuteras. Att ha en förståelse för hur astrocytisk receptor signalering påverkas av förändringar i neuronal aktivitet har stor betydelse för både normal synaptisk funktion samt processer underliggande neurologiska sjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar.
Astrocyter svarar inom sekunder för stimulering av nervceller eller neuronala axoner med ökningar i cytoplasma Ca2 + följer nästan uteslutande från aktivering av astrocytiska Gq GPCRs. Exempelvis muskarinacetylkolinreceptorer 1, cannabinoidreceptors 2, α 1A adrenerga receptorer 3, 4 och grupp I mGluR (se nedan) är alla astrocytiska Gq GPCR subtyper som akut svarar på nervaktivitet. Aktivering av astrocytisk grupp I mGluR har demonstrerats i störst omfattning, efter stimulering av neuronal glutamaterg afferenter in situ (såsom akut hippocampus skivor) 5-7, såväl som i vuxen mus cortex in vivo efter sensorisk stimulering 8. Resultatet av aktiveringen av astrocytic Gq GPCR signalering på biologi och fysiologi av astrocyter, neuroner, eller astrocyternas-neuron interaktioner har varit en fråga för debatt 9-12. Det kommer att bli sågra tid innan funktionen av neuron-till-astrocyternas receptor signalering är helt uppskattat.
Även om det står klart att nervceller kan aktivera astrocytiska receptorer använder experimentella protokoll, det finns aspekter av neuron-till-astrocyternas receptor kommunikation som förblir dåligt kända. För det första, den faktiska mängden nervaktivitet som krävs för att aktivera astrocytic Gq GPCRs är inte väldefinierad, och andra, har förmåga astrocytiska receptorer för att ställa ut användningen beroende plasticitet fått lite uppmärksamhet. Till att börja ta itu med dessa frågor, nyligen utvecklat vi ett protokoll för att framkalla dubbelriktad skalning av astrocytic grupp I mGluRs i akut juvenil hippocampus skivor som svar på långsiktiga förändringar i nervaktionspotential (AP) beroende synaptisk aktivitet. I likhet med vad som har upptäckts för dubbelriktad homeostatiska plasticitet av neuronala jonotropa glutamatreceptorer 13, 14, astrocytisk grupp I mGluR skala upp following blockad av neuronala aktionspotentialer och skala ner när neuronal aktionspotential frekvensen ökar 15. Dessa kompensatoriska förändringar i astrocytiska receptorer kan mätas genom att spela in spontana och framkallade astrocyternas Ca 2 + transienter och jämföra egenskaperna hos dessa händelser till dem från astrocyter i kontrollförhållanden. I detta manuskript, beskriver vi hela den metod för användning av detta protokoll, inklusive utarbetande av akut hippocampus skivor, inkubationsförhållanden att inducera astrocyternas receptor skalning, astrocyte Ca 2 + indikator färgämne lastning, Ca 2 +-bildteknik som använder konfokalmikroskopi och förväntade effekter på astrocyternas Gq GPCR-aktivitet. Förutsägbara effekter på astrocyternas Ca2 + signalering egenskaper – som matchar de som registrerats tidigare i odlade celler transfekterade med olika uttrycksnivåer av Gq GPCRs – ger en "färdplan" som kan användas i framtida studier för att analysera förändringar i såtrocytic GPCR uttryck. Förgreningar och potentiella tillämpningar för användning av denna teknik kommer att bidra till vår förståelse av astrocyternas-neuronala interaktioner i den friska och sjuka hjärnan.
De beskrivna skalmodeller representerar praktiska metoder för att forska långsiktig plasticitet astrocytic grupp I mGluR. Imaging spontana och framkallade Ca 2 +-evenemang ger en känslig analys för att mäta förändringar i astrocytic Gq GPCR-aktivitet, som konkreta bevis har fastställts att astrocyternas Ca 2 + höjder inträffar efter utsläpp från IP 3 R känsliga butiker nedströms Gq GPCR aktivering 10, 12, 17, 18. Andelen astrocyter i befolkningen svarar på grupp I mGluR-agonist och mönstret av sådana Ca 2 + svar rapportera förändringar i grupp I mGluR av astrocyter.
Den specifika teknik som används för att ladda astrocyter med Ca 2 + indikator är en viktig faktor vid utformningen av experiment för att leta efter förändringar i astrocytic Gq GPCR-aktivitet. Bolus-lastning eller bulk-lastning flera astrocyter, eller patch-clamp lastning av individuella astrocyter kan användas för att bild Ca 2 +-transienter i astrocyter. Varje metod har vissa fördelar och nackdelar. Direkt fylla astrocyter med Ca 2 + indikator via patch clamp medger entydig identifiering av cellen som astrocyte utan behov av en sekundär markör såsom SR-101. Patch-clamp leverans av indikator möjliggör också inspelning av Ca2 + aktivitet från små astrocytiska fack inklusive buskiga fina processer, potentiellt djupare i segmentet där cellerna är friskare och med fler intakta interaktioner med synapser (beroende på lasereffekt som finns tillgänglig). Emellertid lider patch-clamp lastning från låg genomströmning eftersom data samlas in en cell i taget. Bulk-lastning, däremot, tillåter ett stort antal astrocyter vara belastad med Ca2 +-indikator och avbildas samtidigt. Det är dock bara astrocyter nära ytan (<20 ^ m) av den del lastas, med tillhörande oros om cell hälsa och intakta synapser.
Den mottrycks bolus-lastprotokoll presenteras här erbjuder en medelväg, med relativt hög kapacitet och förmåga att övervaka Ca2 + aktivitet djupare inom segmentet (40-75 mikrometer). En betydande ökning av andelen spontant aktiva astrocyter med hjälp av bolus-laddningsteknik observeras jämfört med bulk-belastning, vilket tyder på att sambanden mellan neuronala synapser och astrocytiska processer är mer komplett 15. Med god belastning, kan man ofta följa Ca2 + aktivitet i huvudprocesser för astrocyter (data visas ej) eller potentiellt ännu mindre fack med hjälp av 2-foton mikroskopi. Men skulle omsorg måste iakttas vid tilldelning de mindre processerna till en viss astrocyte, eftersom gränserna smälta in i icke-specifik bakgrundsfärgning. Ett ytterligare problem med hjälp av bulk-lastning eller bolus-lastningsförfaranden är behovet av en sekundär markker för astrocyternas identifiering. Även om det har varit känt i många år att astrocyter företrädesvis ta upp AM ester Ca2 +-indikatorer, är den sekundära markören SR-101 används ofta för att kontrollera de laddade cellerna som astrocyter. SR-101 kan i sig förändra den inneboende retbarhet av nervceller 29. Användning av SR-101 bekräftar behovet av att utföra alla astrocyternas Ca 2 +-mätningar i TTX för att begränsa eventuella SR-101 effekter på neuronala retbarhet. Om man antar att både kontroll-och experimentgrupper innefattar SR-101, bör markören i sig inte hänsyn till de effekter som observerats i astrocyternas Ca2 +-signalering efter långvarig manipulation av neuronala aktionspotentialer. SR-101 kan vara mer av ett problem i hög K +-experiment, men eftersom det kan minska skillnaden mellan 2,5 mM K + vs 5,0 mM K +, om de basala eldhastighet inte ändras proportionellt.
En mycket lovande metod för att leverera Ca2 + </sup> Indikatorn för astrocyter har uppstått nyligen, som erbjuder ett attraktivt alternativ till de mer traditionella metoder med hjälp av Ca 2 + färgämnen. Betydande framsteg har gjorts under de senaste åren med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) riktade till astrocyter 30-32. GECIs kan levereras till astrocyter genom in vivo-mikroinjektion av adenoassocierade virala vektorer in i en hjärnregion av intresse, såsom hippocampus. Uttryck av GECIs uppnås efter cirka två veckor efter virusinfektion 32. Det finns många fördelar som presenteras med hjälp av GECIs i astrocyter. Först är de vektorer som riktas till astrocyter med användning av en astrocyt specifik promotor, så att de märkta cellerna är astrocyter 32. För det andra verkar den signal-till-brus nu jämföras med det som kan erhållas med användning av patch-clamp avgivning av färgämne, men utan invasivitet av att ha haft en patch-pipett på cellen 32. För det tredje kan indikatorerna vara delivered och uttrycks i vuxen vävnad, vilket är problematiskt att använda bulk-lastning leveransmetoder. Vidare är uttrycket mosaik, som erbjuder förmågan att särskilja mellan flera astrocyter. Sålunda kan flera astrocyter potentiellt avbildas samtidigt, medan också inspelning i soma och fina branch samtidigt. Därför kan eventuellt en enskild teknik kan användas i stället för tre olika tekniker (bulk-lastning, bolus-lastning, och patch-clamp lastning) för att spela in skalnings aktivitet astrocytiska Gq GPCRs, kraftigt ökar effektiviteten.
En potentiell nackdel med att använda viral-medierad leverans av Ca 2 +-indikatorer för astrocyter är den möjliga effekten på skiva hälsa 32. Det adenoassocierade virala vektorer som används för att leverera de GECIs har visats tidigare för att orsaka reaktiv glios av astrocyter 33. Beredning av hjärnan skivor i allmänhet sannolikt initierar tidiga stadier av patologi inklusive frisättning av inflammatory molekyler 10. Därför, i kombination med de långa inkubationstider som krävs för att framkalla skalning av astrocytiska receptorer, användning av GECIs levereras med hjälp av virala vektorer skulle behöva få ytterligare ersättning i samband med slice hälsa i dessa typer av experiment.
Vid användning av detta protokoll, är det viktigt att hålla i minnet att applikationstiden för agonist för att producera ett svar kommer att variera som en funktion av receptor tillgänglighet. För en given koncentration av agonist, kommer applikationstiden måste vara längre om receptorer har skalats ned och kortare om receptorer har skalas upp, för läkemedlet att nå en adekvat koncentration i vävnaden för att aktivera receptorer i tillräcklig utsträckning för att producera en Ca 2 + respons. Därför kan drogansökningstider och potentiellt deras koncentrationer, att behöva justeras beroende på den avsedda riktningen för skalning. Till exempel kan agonistkoncentrationen måste sänkas i Case av TTX för att undvika mätt svar, och ökade efter inkubation skivor i hög K + för att ens se ett svar. Närmare bestämt var det DHPG koncentrationen skiftat 5-15 mikroM efter TTX behandling till 30-50 mikroM efter 5,0 mM K + behandling för att studera Ca 2 + svarsmönster, som 5-15 mikroM var ofta för låg för att få fram tillförlitliga svar i astrocyter efter nedtrappning av grupp I mGluRs.
Inspelning av astrocyternas Ca2 + aktivitet ger något direkt bevis för receptor insättning eller internalisering till eller från plasmamembranet. Men baserat på den märkliga likheten av data med data från tidigare studier in vitro som granskade det direkta förhållandet mellan Gq GPCR uttrycksnivåer och spontana och framkallade Ca 2 + transienter 21-24, det mest logiska tolkningen av förändringarna i Ca2 + signalering är att astrocyternas ytreceptor expressionsnivåer harförändrats. En kompletterande strategi kan vara en viktig faktor om man vill ge ytterligare bevis om orten för effekten på Ca 2 + aktivitet. En strategi som vi använde var att undersöka effekten av TTX inkubation på hippocampus skivor från astrocytiska MrgA1R möss. Dessa transgena möss uttrycka en främmande Gq GPCR (det MrgA1R) endast i astrocyter. Därför att denna receptor är inte naturligt i hjärnan, finns det ingen endogen neurotransmittor närvarande för att ändra dess aktivitetsnivå. Tidigare arbete föreslog att denna receptor engagerar samma intracellulära signalmolekyler som endogen grupp I mGluRs i samma astrocyter 34. Efter långvarig inkubation av skivor från MrgA1R möss i TTX, inga skillnader i agonist-framkallade MrgA1R svar jämfört med kullkontroll inkuberas skivor skulle ge belägg för att effekten på astrocyternas Ca2 + aktivitet beror på förändringar lokaliserade till ytan receptorn, särskilt om grupp I mGluR svar är fortfarande betyär markant förbättrad i samma astrocyter. Ett alternativ, men kanske mer involverad strategi skulle vara att isolera astrocyter från skivorna för Western blot-analys, så länge som en membranfraktion skulle kunna analyseras förändringar i yt-receptorexpressionsnivåer. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) eller flödescytometri kan vara till hjälp här.
Möjliga tillämpningar av denna teknik för studiet av neuroner, astrocyter och astrocyternas-neuronala interaktioner är många. I våra experiment, bara DHPG-framkallade grupp I mGluR astrocytiska Ca 2 + svar studerades, i isolerade akut hippocampus skivor från unga möss. Detta preparat har inte bara de intakta afferenter (Schaffer säkerheter), men också de nervceller som ger upphov till dem (CA3 pyramidala celler), vilket gör det möjligt att manipulera tändsatser för dessa glutamaterg nervceller på de postsynaptiska celler (CA1 pyramidala celler) och astrocyterna i stratum radiatum vars processer intressebolage med dessa synapser. Den akuta hippocampus slice är kanske inte den bästa förberedelsen för att manipulera tändsatser för andra typer av nervceller, dock så många afferenter avskiljas från de nervceller som ger upphov till dem. Icke desto mindre kan det vara möjligt att i vissa slice beredningar att observera plasticitet andra astrocytiska Gq GPCR-subtyper. Exempelvis kan skivorna framställas med basala framhjärnan kolinerga neuroner och deras projektioner till hippocampus intakt. Inkubation av dessa skivor i TTX eller förhöjt K + skulle påverka basal bränning priser av kolinerga nervceller, vilket leder till skalning av mAchRs i astrocyter av stratum oriens, som får en betydande del av det kolinerga ingång 1. En alternativ ännu oprövad tillvägagångssätt att studera astrocytisk receptor skalning inom ett visst område i hjärnan, med alla anslutningar intakta medan skalning sker skulle kunna vara att använda en in vivo-modell, där en fördröjd frisättning av TTX uppnås genom implantation av en plastic polymeren Elvax 40W ovanför det intressanta området 35. Denna metod har tidigare använts i en studie av neuronal skalning men bör också vara tillämpliga på astrocytic skalning. Slutligen, med korrekt avläsning kan framtida studier undersöka andra GPCR familjer, inklusive förändring i G s eller G I GPCRs. Man kan förutsäga astrocytisk GABA B-G i GPCRs att påverkas efter hämning av bränning i lokalt utskjutande GABA interneuronen inom någon skiva beredning. Utveckling av nya indikatorer efter andra signalmolekyler, såsom en realtidsindikator för den andra budbäraren cAMP, skulle öppna upp ett helt nytt forskningsområde på neuron-till-astrocyternas receptor kommunikation.
Dubbelriktad skalning av astrocytiska mGluRs genom manipulation av basal neuron bränning priser ger ett mått på känsligheten för astrocyter till AP-medierad frisättning av signalsubstansen. Astrocyter kan tydligen känna spontana AP och glutamate utgåvan vid Schaffer säkerheter-CA1 pyramidal cell synapser även när extracellulärt K + är inom ett fysiologiskt intervall. Medan akut tillämpning av TTX inte minska frekvensen av spontana astrocyte Ca2 + aktivitet 18, 36, 37, Ca2 + aktivitet bland astrocyter i befolkningen blir avkorrelerade 36, som styrker att astrocytiska receptorer är AP-detektorer. Detta tyder på att astrocyterna känner av spontana neuronal APs utan inverkan på deras totala Ca2 + aktivitet. Det är allmänt accepterat att intracellulära koncentrationer av IP 3 behöver för att nå en tröskelnivå för att stimulera IP 3 Rs tillräckligt för att leda till en detekterbar Ca2 + höjd. Kan spontana neuronal AP aktiverar astrocytiska GPCRs utan att producera mätbara Ca 2 + höjder? Framtida studier kunde utnyttja fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) eller något liknande Techn ique (t.ex. BRET) för att undersöka förhållandet mellan G-proteinkoppling till receptorn (ett mått på receptoraktivering) och Ca 2 + frisättning från interna affärer. BRET har använts i stor utsträckning in vitro för att detektera G-protein-till-GPCR koppling 38, även om det kan dröja innan tekniken blir tillgänglig för användning i intakta vävnadspreparat. Det är möjligt att astrocytiska Gq GPCRs är aktiveras mycket oftare än vad som kan spelas in med hjälp av de tillgängliga Ca2 + bildframställning. Förutom att känna av aktionspotentialer, kan astrocytiska Gq GPCRs också kunna detektera miniatyr quantal frisättning av signalsubstansen som rapporterats i en nyligen genomförd studie 39. Den dubbelriktade skalning metod som beskrivs här kan användas i framtida studier för att ge ett mått på i vilken utsträckning astrocytic Gq GPCRs upptäcker quantal vesikulär frisättning av signalsubstansen, genom att inkludera bafilomycin A1 i inkubationstiden protokollet.
ntent "> Hittills skalnings protokollen har endast använts i hippocampus skivor från unga möss (p12-p18). Därför är det för närvarande okänt om astrocytic receptor skalning också skulle kunna induceras i vävnad erhålls från vuxna möss. En övertygande ny studie tyder på att grupp I mGluR uttryck i astrocyter minskar betydligt efter den första veckan i ålder och fortsätter att minska förrän i vuxen ålder, med mycket låga nivåer av receptoruttryck i vuxna astrocyter 40. Det skulle därför vara intressant att avgöra om astrocytiska mGluRs skala upp efter lång- sikt hämning av neuron i vuxna mus hippocampus skivor till nivåer som närmar sig de som ses i astrocyter från unga möss. Detta fynd tyder på att astrocytic receptoruttryck är inte statiskt vid en viss ålder, men kan ändras snabbt beroende på nivåer av nervaktivitet. I motsats till minskat uttryck av grupp I mGluRs i vuxna möss, är bevis fram som adrenerga receptorer, bland & #945; 1A, α 2A, och β 1-subtyper, är till övervägande del uttrycktes av astrocyter i den vuxna hjärnan 3, 4. Den α 1A adrenerga Gq GPCR kan vara ett attraktivt mål för framtida studier av neuron-till-astrocyternas kommunikation, även om dessa receptorer är känsliga för förändringar i adrenerga neuron bränning priser.The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för UC Riverside Centrum för Gliaceller-neuronala interaktioner för värdefull diskussion om skal protokoll och data. Författarna vill också ge ett stort tack till Abcam för sponsring publiceringen av deras arbete.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |