Abstract
Bloedserum dient als een chemoattractant richting die kankercellen migreren en binnen te vallen, hun intravasation faciliteren in haarvaten. De werkelijke moleculen waarnaar het migreren blijven ongrijpbaar. Deze gewijzigde invasie assay ontwikkeld om doelstellingen die celmigratie en invasie drijven identificeren. Deze techniek vergelijkt de invasie index onder drie voorwaarden te bepalen of een specifiek hormoon, groeifactor of cytokine speelt een rol in het mediëren van het invasieve potentieel van een kankercel. Deze omvatten i) normaal foetaal runderserum (FBS), ii) houtskool gestript FBS (CS-FBS), die hormonen, groeifactoren en cytokinen en iii) CS-FBS + molecule verwijderd (aangeduid als "X"). Een significante wijziging invasie CS-FBS vergeleken met FBS, geeft de betrokkenheid van hormonen, cytokinen of groeifactoren de regulering van de verandering. Individuele moleculen kunnen vervolgens weer worden toegevoegd aan CS-FBS hun vermogen om opnieuw te testenvers of redden van de invasie fenotype. Verder kunnen twee of meer elementen worden gecombineerd om de additieve of synergetische effecten van meerdere moleculen in besturen of remmen invasie evalueren. Kortom, deze werkwijze kan de onderzoeker bepalen of hormonen, cytokinen en / of groeifactoren spelen een rol bij invasie door als chemoattractanten en remmers van inval voor een bepaald type kankercel of een bepaalde mutant. Door het identificeren van specifieke chemoattractants en remmers, kan deze gewijzigde invasie assay helpen verhelderen signaalwegen die kankercel invasie sturen.
Introduction
Een nieuw invasie assay is ontwikkeld met het doel van het identificeren van de betrokkenheid van specifieke hormonen, cytokinen en / of groeifactoren zoals chemoattractanten in kankercel invasie. Het vermogen van tumorcellen binnen te dringen door de extracellulaire matrix (ECM) is een kenmerk van het metastatische fenotype 1-3. Invasion kamers zijn uitgebreid gebruikt als in vitro instrumenten kankercel invasie en migratie bestuderen en kunnen kennis verschaffen over de mechanismen van in vivo tumor invasie en metastase. De kamers bestaan uit cilindrische celkweek inserts genest binnen de putten van celkweek platen. De bodems van de inzetstukken halfdoorlatende polycarbonaat of polystyreen membranen van gedefinieerde poriegrootte.
In de standaard invasie assay worden cellen gezaaid op het inzetstuk membraan met serumvrij medium en geplaatst in celcultuur putjes die zijn gevuld met serum of serum-achtige chemoattractanten te set een chemoattractive kracht. Deze kracht drives cellen om door de semi-permeabele membraan (migratie) of door een coating van extracellulaire matrix (invasie), die vervolgens kunnen worden gekleurd met conventionele kleurstoffen detecteren en kwantificeren van het aantal cellen. Het aantal cellen wordt vervolgens genormaliseerd naar de mate van migratie en invasie in een invasieve cellijn. Met deze methode kan een onderzoeker om de invasieve potentieel van de verschillende celtypen onder verschillende omstandigheden, met inbegrip van genetische manipulaties evalueren.
Hormonen, cytokinen en groeifactoren zijn kritische componenten van serum en worden steeds vaker blijken geassocieerd te zijn met het drijven het invasieve fenotype 4. Echter, de aard, de rol en de specificiteit van deze chemoattractive serum moleculen in het bemiddelen invasie nog steeds ongrijpbaar. De uitdaging blijft om te bepalen welke specifieke factoren in het serum of serum-achtige chemoattractants verantwoordelijk voor het rijden bentkankercel invasie evenals wat moleculen de invasie proces kan remmen. In dit verslag beschrijven we een methode om de mogelijke betrokkenheid van hormonen, cytokinen en / of groeifactoren die in serum evalueren, zoals moleculen drijven de chemoattractie en invasie van kankercellen.
In deze voorgestelde gewijzigde protocol, wordt houtskool strippen gebruikt hormonen, cytokinen en groeifactoren van 2% foetaal runderserum (FBS) verwijderen tot 2% houtskool gestript FBS (CS-FBS) genereren. Beide 2% FBS en 2% CS-FBS worden gebruikt als middelen om de chemoattractive kracht kankercel invasie drijven. Met 2% CS-FBS als chemoattractive middel in vergelijking met normale 2% FBS biedt verscheidene voordelen waaronder eerste en meest prominent, de mogelijkheid om de kankerinvasie fenotype in de gereduceerde / relatieve afwezigheid van hormonen, cytokinen en groeifactoren te bestuderen. Het maakt het ook mogelijk de onderzoeker om te beoordelen of de collectieve verwijdering van hormonen, groeifactoren, en cytokines veroorzaakt een toename of afname van de invasieve index. De assay wordt vervolgens bepaald of de toevoeging van een individuele component, aangeduid als "X" kan remmen, verlagen, verhogen of herstellen de invasieve index op zijn oorspronkelijke waarde (zie figuren 2 en 3). Hoewel deze methode is specifiek voor het bereiken van fysiologische niveaus van de component die wordt verwijderd uit het serum tijdens houtskool strippen, moet worden opgemerkt dat houtskool strippen kunnen worden beïnvloed signaaltransductiewegen. Bijvoorbeeld is gerapporteerd dat houtskool strippen de alkalische fosfatase activiteit van osteoprogenitor cellen kan afnemen en induceren adipogenese door verlaging van MAPK activatoren 5. Houtskool gestript media zijn commercieel verkrijgbaar en zijn gebaseerd op het beschreven protocol dat houtskool gecombineerd met dextran en geïncubeerd met foetaal runderserum O / N 6.
Deze test werd ontwikkeld in RespoNSE een resultaat gerapporteerd door Zucker et al. 7 De auteurs toonden dat een mutant fenotype die gap junction communicatie toonden een verhoging van de invasie index bij het migreren naar media met normale 2% FBS. Deze stijging werd geëlimineerd met de vervanging van houtskool gestript serum. Uit deze resultaten concludeerden de auteurs dat deze mutant beïnvloed migratie naar een lipofiel molecuul (specifieker, een hormoon, groeifactor of cytokine) 7. Het is bekend dat hormonen, groeifactoren en cytokinen signaaltransductiewegen betrokken bij tumorontwikkeling en invasie 4. Het is dus belangrijk dat wetenschappelijke onderzoekers bepalen welke factor (en) drijven de tumor invasie van hun specifieke kankercellen of mutanten onder studie. De test is ontworpen om de rol van individuele componenten richten op de fysiologische concentratie zoals bepaald overeenkomstig het verschil tussen de concentratie van de component &# 8220, X "normale FBS en de CS-FBS. Door de ontwikkeling van deze test, kunnen de onderzoekers meer inzicht in de specifieke invasieve route voor hun systeem te krijgen.
Hormonen, groeifactoren en cytokinen zijn vaak ingedeeld als tumor promotoren 8. Sommige van deze factoren zoals EGF worden gebruikt als directe bron voor chemoattractanten invasie kamers 9. Derhalve lijkt het waarschijnlijk dat deze vormen de belangrijkste onderdelen van het serum die directe tumorinvasie. Dit protocol stelt een eenvoudige, maar significante, wijziging van de gebruikelijke in vitro invasie assay waarmee een onderzoeker om de betrokkenheid van hormonen, groeifactoren en cytokines beoordelen mediëren het invasieve potentieel van kankercellen. Echter, de test om de onderzoeker met een antwoord over de vraag of de procedure effectief voor de studie zullen in een eerste stap in de analyse, zodat geen kostbare tijd en r gebruikenIDDELEN als overbodig beschouwd. Deze methode maakt gebruik van CS-FBS en vertrouwt op de onderzoekers beoordelingsmarge met betrekking tot welke moleculen na te streven als lead kandidaten die mogelijk bemiddelen kankercel invasie. De resultaten van deze analyses blijken bruikbaar te zijn om te bepalen welke serum bestanddelen dienen als chemoattractanten en remmers voor de bepaalde cellijn of mutant bestudeerd. Daarnaast kan deze aanpak helpt de onderzoeker bepalen wat de belangrijkste signaalwegen ofwel bevorderen of remmen kankercel invasie; Zo regisseren toekomst drug design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid de verschillende media en de extra componenten
- Voorafgaand aan experimenteren bereiden media bestaande uit DMEM of andere genoemde media met de toevoeging van ofwel normale FBS, houtskool gestript FBS of houtskool gestript FBS plus de component te testen. Merk op dat meerdere componenten kunnen worden getest in elk experiment.
- Weeg en verdun de hormonen, groeifactoren, of cytokines adequate wijze te worden opgelost in de houtskool gestript serum op de fysiologische concentratie.
2. Bereid de Collageen Matrix on Ice
- Bereid 2 ml collageen I matrix bij 2,2 mg / ml door toevoeging van de volgende steriel gefilterde componenten op ijs: 200 pl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 pl 1 N NaOH, 600 ui dubbel gedestilleerd H2O en 1,2 ml collageen I (bij 3.63 mg / ml).
- Houd collageen I oplossing op ijs pas klaar voor de plaat.
3. Bereid Migratie / Invasion Platen voor Assay </ P>
- Voor elke cellijn te testen Gebruik een 24-well plaat ruimte waarin 12 putjes bevatten inserts. Gebruik de extra 12 putten die niet inserts bevatten voor het toevoegen van de chemoattractant media en de overdracht van de inserts voor de experimentele set-up.
OPMERKING: Een collageen matrix op platen met een polyethyleentereftalaat (PET) membraan en 8 urn poriegrootte is optimaal voor de cellijnen hier. Echter, een Matrigel matrix voorbeklede platen ook gesubstitueerd met poriegrootte verminderd in overeenstemming met de cellijn onderzocht. - Duidelijk label de plaat, met behulp van 3 putten per aandoening die wordt geanalyseerd (FBS migratie, CS-FBS migratie, FBS invasie, en CS-FBS invasie evenals FBS-migratie voor een controle, niet-invasieve cellijn). Assay migratie beweging door poriën in een PET membraan en assay invasie door verplaatsing door een collageen of Matrigel matrix en vervolgens door poriën in het membraan. Gebruik verschillende kleuren markers voor elke cel voorwaarde om eenid in de plating proces.
4. Verdeel de invasie Matrix
- Zorgvuldig Pipetteer 75 ul van de collageen matrix oplossing in de inzetstukken te gebruiken voor invasie assays. Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Verspreiden luchtbellen door het aanbrengen van een omgekeerde pipettip naar de oppervlakte.
- Breng de plaat met de met collageen beklede inserts aan een 37 ° C en 5% CO2 incubator gedurende 30 min naar het gel kunnen stollen.
5. Plaat de cellen op het membraan of Invasion Matrix
- Ondertussen trypsinize cellen en media aan 10% FBS. Spin-cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten op een tafelblad centrifuge en spoel 3x in serumvrij medium.
- Resuspendeer in serum vrije media. Tellen cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde dia teller. Voeg serumvrij medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 4 cellen / ml.
- Wanneer het collageen matrix (na 30 min) is gestold, voeg 700 ul van media met ofwel2% FBS gedefinieerd of houtskool-gestript FBS aan elk putje. Van de 12 inserts per plaat:
- 3 inserts hebben collageen en putten met media + 2% FBS
- 3 inserts hebben collageen en putten met media + 2% CS-FBS
- 3 inserts hebben geen collageen en putten met media + 2% FBS
- 3 inserts hebben geen collageen en putten met media + 2% CS-FBS
- Gebruik extra platen afhankelijk van het aantal factoren getest en een zonder collageen controle overeenkomstig elke conditie.
- Voeg celsuspensie aan de inserts op 5 x 10 4 cellen / ml, plating 500 ul cellen per insert in alle migratie en invasie inserts.
- Incubeer de cellen gedurende 22 uur bij 37 ° C.
6. kwantificeren aantal migrerende en binnenvallen Cellen
- Stel kleuring putjes met methanol fixatief, eosine en hemotoxyline, in afzonderlijke putjes.
- Gebruik wattenstaafjes om cellen en matrix uit elk putje te verwijderen.Rrepeat met tweede wattenstaafje aanvraag in voor elk goed.
- Met forceps, dompel elke insert 5 maal gedurende 1 seconde in elk van de 3 oplossingen elkaar.
- Laat inserts drogen O / N.
- Ofwel i) Verwijder filters met een scalpel snijden voorzichtig rond de randen en monteren op een dia met dekglaasje en immersie olie of ii) kan de inzetstukken drogen O / N omgekeerd en gebruik de inzetstukken direct voor microscopie.
- De volgende dag, bekijken dia's of inzetstukken onder een microscoop met een 20X objectief en neem 5 beelden uit verschillende regio's van het filter. Om de samenhang te verbeteren, neem 4 buitenste velden en één centrum.
- Tellen cellen voor alle omstandigheden met behulp van ImageJ software en gelden voor de onderstaande formules.
- Bepaal het percentage invasie als volgt:
Bedoel # cellen binnenvallen door collageen Ik steek = een
Bedoel # cellen migreren via besturingssokkel = b
% Invasion = (a / b) x 100 - Bepaal de invasie Index in 2% FBS als volgt:
% Invasie van cellen worden getest (in 2% FBS) = c
% Invasie van controle invasieve cellen in (2% FBS) = d
Invasion index (FBS) = (c / d) - Bepaal de invasie Index in 2% CS-FBS als volgt:
% Invasie van cellen worden getest (in 2% CS-FBS) = e
% Invasie van controle invasieve cellen in (2% CS-FBS) = f
Invasie Index (CS-FBS) = (e / f)
7. Herhaal Experimenteel protocol Vergelijking Charcoal-gestript FBS Charcoal-gestript FBS + X n met meerdere factoren samen
- Herhaal deze procedure meerdere malen als nodig met verschillende onderdelen van "X" of een combinatie van componenten.
- Breng de berekening van de bijdrage van elke factor "X" op de migratie en invasie effecten bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De invasie index wordt berekend voor elke conditie volgens normalisatie een invasieve cellijn. Voor onze experimenten gebruiken we de 1205Lu melanoma cellijn en gevestigde variant stabiele cellijnen onze invasieve lijnen en de premaligne invasieve variant WM793 waaruit de 1205Lu cellen werden afgeleid 10 dat dient als logische controle. Wij gebruiken ook collageen I als de invasie matrix, want dat is de belangrijkste component van de dermis. Dit is in overeenstemming met een eerdere studie waarbij de optimale invasie matrix is afhankelijk van de cellijn en de mate van overeenstemming met de in vivo resultaten 11. Deze invasie assay wordt schematisch geschetst op basis van de mogelijke resultaten van de onderzoeker zou kunnen verkrijgen. Aanvankelijk moet de invasie-index van 2% FBS aanzienlijk hoger of lager dan de invasie index voor CS-FBS zijn om deze assay (Figuren 1 en 2) voortzetten. Indien een significante INCRverlichten of afname van de invasie index blijkt met houtskool gestript FBS, deze test is niet bruikbaar voor de onderzoeker (figuren 2 en 3). Indien deze verhoging wordt geëlimineerd met houtskool gestript FBS, de onderzoeker al de wetenschap dat de verhoogde invasie is gericht op een hormoon, groeifactor of cytokine (figuren 2 en 3). Vervolgens moet de onderzoeker informatie over het specifieke type tumor en mutatie naar welke kandidaat (s) aanwezig plausibele mechanismen als chemoattractants bepalen benutten. De onderzoeker kan beginnen door te proberen één of meerdere componenten afzonderlijk aan de fysiologische concentratie door toevoeging van de component in het concentratieverschil tussen 2% FBS en 2% CS-FBS (Tabel 1). Als een component toegevoegd aan houtskool gestript serum verhoogt van verlaagt de invasie potentieel vergeleken met de houtskool gestript serum alleen, dat kandidaat "X" kan een gedeeltelijke of serverenvolledige redder afhankelijk van de mate van toename (figuren 2 en 3). Twee of meer componenten kunnen worden gecombineerd om een additieve of synergistische toename bereiken (aangeduid als X1 + X2 + X3 ...) (figuur 3). Een factor die de mate van invasie af zou worden geclassificeerd als een remmende factor (figuren 2-4). In onze experimenten hebben we aangetoond dat het gebruik van een mutante melanoom cellijn (1205Lu T154A) migreren naar een chemoattractant met hormonen, groeifactoren en cytokinen verwijderd veroorzaakte een afname in tumor invasiviteit. Drie hormonen werden getest op een mogelijke "X" herkennen. Deze omvatten oestrogeen (oestradiol), progesteron en schildklierhormoon (T4). Twee van deze hormonen had geen effect op de invasie index (progesteron en schildklierhormoon), terwijl oestrogeen werd geïdentificeerd als in remmende factor (figuur 4). Volgens de in beursgenoteerde mogelijke uitkomstenFiguur 3, de experimentele resultaten in dit voorbeeld, vertonen een afname Voorwaarde 2 en een remming Voorwaarde 3. Het is waarschijnlijk dat oestrogeen verder in deze test wordt gebruikt omdat het van belang bij de identificatie van trajecten die bepaalde signalering factoren sekwestreren kan voor toekomstige drug design strategieën. Additionele experimenten zijn gericht op groeifactoren en cytokinen andere componenten die als "fenotype rescue" pro-invasie chemoattractanten kan dienen identificeren. Identificatie van zowel pro-invasieve en remmende moleculen kunnen gezamenlijk verhelderen invasieve potentieel voor de cellijnen en mutante varianten onderzocht.
Figuur 1. Experimentele opstelling en het ontwerp. Model van de set-up voor de experimentele proces waaruit cellen uitgeplaat, hetzij op de PET membraan direct of de collagen laag in serum vrije media. De cellen zijn ofwel migreren of invasie door de collageen matrix naar een chemoattractant die is aangepast aan het protocol en beschreven als Voorwaarde 1, 2 en 3. De gemigreerde of binnengedrongen cellen worden vervolgens gefixeerd en gekleurd. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
Figuur 2. Mogelijke uitkomsten van de ene standaard invasie assay membraan resultaat. Dit model toont het potentieel resultaten die de onderzoeker kunnen tegenkomen voor de invasie assay en hoe deze resultaten te interpreteren. Elke cirkel is een representatief resultaat van een gekleurd filter met dezelfde 3 voorwaarden die worden beschreven in Figuur 1. Elke stip stelt een cel die is gepasseerd door de invasiematrix en gekleurd op de onderzijde van het membraan. De cellen zouden op passende wijze worden gekwantificeerd en dienovereenkomstig worden geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. De gegevens interpretatie voor invasie met CS-FBS ± X. Dit overzicht beschrijft hoe de berekeningen van de invasie Index bepalen de experimentele conclusies. CS-FBS de houtskool gestript serum en X verwijst naar de afzonderlijke componenten toegevoegd aan de CS-FBS media in de tekst beschreven. De auteurs stellen de standaarddeviatie (SD) als de geaccepteerde variabiliteit door experimentele fout in onze omstandigheden. Afhankelijk van de omstandigheden observatie en het aantal herhalingen, deze factor kan worden ingesteld binnen het bereik van statelijkesche betekenis voor de onderzoeker. Het experiment kan worden herhaald met meerdere "X" moleculen, (aangeduid als X 1 + X 2 + X 3 ...). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Invasion test resultaten. Deze grafiek toont de experimentele resultaten verkregen bij het gebruik van een mutant variant cellijn 3 vastgesteld op basis van 1205Lu gemetastaseerd melanoom cellen. De concentratie van de toegevoegde hormonen zijn: oestrogeen (0,566 pg / ml), progesteron (0.001 ng / ml), schildklierhormoon (0,283 ug / dl). De controle, niet-invasieve cellijn gebruikt voor deze experimenten was WM793B. Dit experiment werd 3 keer herhaald met vergelijkbare resultaten en een representatieve grafiek weergegeven.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS cat # SH30068
Tabel 1. Voorbeelden van concentratiebereik van geselecteerde hormonen, groeifactoren en cytokinen in runder- en humane sera. Het concentratieverschil tussen 2% FBS en 2% CS-FBS vertegenwoordigt de toegevoegde fysiologische concentraties bereiken bedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumormetastase is een meerstaps proces. De cellen moeten breken door de basaalmembraan, intravasate in ofwel het lymfestelsel of bloed microvaatjes, waarin zij worden getransporteerd naar afgelegen plaatsen. De tumorcellen vervolgens extravasatie en koloniseren een macrometastasis 12. Progressie door de epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), tumor invasie en metastase is verbeterd door steroïde hormonen 13,14, groeifactoren 15-18 en cytokinen 19-21. Deze moleculen zijn zo cruciaal voor het aanpakken van de signaalweg van de progressie van de tumor, dat de ontwikkeling van een test om hun rol in de tumor invasieve potentieel aan te pakken is een belangrijke stap in de richting van het ontcijferen van de ingewikkelde signaalwegen.
Deze test van het gebruik van houtskool gestript serum heeft een voordeel ten opzichte van bestaande methoden, omdat het de bedoeling om de drijvende kracht om die aan de tumorcellen migreren identificeren. Een eerdere test heeftgepubliceerd met normale primaire borst fibroblasten in invasie kamers. In deze studie, de auteurs gebruikten houtskool gestript media en opnieuw oestrogeen toegevoegd matrigel cellen die geen invasie veroorzaakte als verwacht omdat de cellen niet tumorigeen. De aanwezigheid van macrofaag geconditioneerde media in de aanwezigheid of afwezigheid van oestrogeen aanzienlijk toegenomen invasie en in gelijke mate 22. Hoewel deze test was gelijk dat het gebruikt invasie assays met houtskool gestript serum in de afwezigheid of aanwezigheid van oestrogeen, was geen tumor assay en is gericht op het bestuderen van paracriene interacties tussen macrofagen en fibroblasten 22. Een andere assay gebruikt houtskool gestript media te tonen dat de toevoeging van lage hoeveelheden oestrogeen verhoogde de proliferatie van borstkankercellen maar veroorzaakte resistentie tegen remmers 23 kinase. Onze studie is uniek doordat het een invasie assay voor verschillende soorten kankercellen om de studieeffect van afzonderlijke hormonen, groeifactoren en cytokinen hetzij alleen hetzij in combinatie. Bovendien, onder voorbehoud van de beschikbare literatuur, hebben we de concentraties van hormonen die nodig zijn vastbesloten om toe te voegen aan de houtskool gestript serum aan fysiologisch relevante niveaus (tabel 1) te bereiken. De toevoeging van de afzonderlijke componenten, "X" op niveaus normaal in serum is een kritische parameter van de test. Hoewel deze test lijkt te worden beperkt door de gepubliceerde niveaus van hormonen, groeifactoren en cytokines in serum, kan de onderzoeker ELISA-assays om de niveaus van bijkomende factoren bepalen.
Terwijl het protocol specifiek is voor gebruik collageen I, kan Matrigel ook gesubstitueerd indien de onderzoeker steeds gebruikte die matrix. De reden dat we de voorkeur aan collageen I gebruiken omdat het een enkele component die is gedefinieerd en is het voornaamste bestanddeel van de dermis. Daarnaast maken we gebruik van 75 pi van 100 μg / ml collageen de invasie matrix maken. Dit kan ook worden gemodificeerd om de gewenste resultaten te bereiken. Het beste is om de concentratie te optimaliseren zodat een redelijk aantal cellen worden geteld op de filters. Als de cellen sterk invasieve, kan het beter zijn om 100 pl collageen I gebruiken voor de matrix of de collageenconcentratie verhogen. Hoewel deze techniek kan helpen de onderzoeker verkrijgen belangrijke informatie is alleen nuttig als de tumorcellen binnenvallen naar een chemoattractant die wordt verwijderd door de houtskool-strippen van het serum. Als er geen verschil tussen de resultaten voor controle en houtskool gestript serum, vervolgens de test zou niet moeite waard. De test wordt tevens het resultaat individuele chemoattractanten als onderdrukkers van chemotaxis. Ook de vergelijking van mogelijke resultaten (figuur 3), hebben we de standaardafwijking het niveau van geaccepteerde experimentele fout voor elk experiment. De werkelijke valUE kan worden bepaald door de onderzoeker gebaseerd op de standaard deviatie of standaardfout en een significante p waarde.
Voorts kan de informatie uit deze assay nuttig bij het ontwerp van farmacologische remmers bepaalde signaalwegen bewijzen. Als bijvoorbeeld één of meer hormonen, groeifactoren en / of cytokinen blijkt te zijn betrokken bij de invasie mechanisme voor een specifieke tumorcel mutatie, als een bestaande farmacologisch middel kan worden gebruikt of een nieuw geneesmiddel bedoeld om deze route remmen. De test is ook een effectief hulpmiddel om de bepaalde tumor mutatie en of het veranderen van de aminozuurresidu of zijn positie handhaaft dezelfde affiniteit voor de chemoattractant die werd geïdentificeerd door deze test. Zo onze assay biedt een nieuwe benadering aanwijzingen geven over de invasie mechanisme van kankercellen en eventueel methoden tumor invasie te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
