Abstract
بعد اصابة كاملة في النخاع الشوكي، والشلل الأنقليس البحر في البداية دون مستوى transection. ومع ذلك، فإنها استعادة تنقل بعد عدة أسابيع، وهذا يرافقه تجديد مسافة قصيرة (بضعة ملم) نخاعي مخصوص من المحاور والمحاور إسقاط العمود الفقري، من جذع الدماغ. بين 36 الخلايا العصبية في العمود الفقري إسقاط-تعريفية كبيرة، وبعضها regenerators جيدة والبعض الآخر سيئة regenerators. يمكن بسهولة تحديد هذه الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الاستعدادات wholemount. من أجل فهم الآليات العصبية الجوهرية التي تحول دون محاباة أو محوار تجديد بعد إصابة في الجهاز العصبي المركزي الفقاريات، نحن تحديد الاختلافات في التعبير الجيني بين regenerators الجيدة والسيئة، وكيف يتأثر التعبير transection الحبل الشوكي. وتوضح هذه الورقة تقنيات اليرقات الإسكان وتحولت مؤخرا الأنقليس البحر الكبار في خزانات المياه العذبة، وإنتاج كاملة transections الحبل الشوكي تحت الرؤية المجهرية، وإعداد رعين وwholemounts الحبل الشوكي لالتهجين في الموقع. باختصار، يتم الاحتفاظ الحيوانات في 16 ° C وتخدير في 1٪ بنزوكاين في الجلكى قارع الأجراس. ومقطوع الحبل الشوكي مع مقص قطع القزحية عبر نهج الظهرية ويسمح للحيوان لاسترداد في خزانات المياه العذبة في 23 درجة مئوية. لالتهجين في الموقع، وreanesthetized الحيوانات والدماغ والحبل إزالة عبر نهج الظهرية.
Introduction
في الثدييات إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو شرط المدمرة التي تؤدي إلى فقدان دائم للوظيفة تحت موقع الإصابة لمحاور جرح لا تتجدد من خلال منطقة الصدمة وإعادة الاتصال إلى أهدافهم المناسبة. على عكس الثدييات، الأنقليس التعافي تنقل بعد إصابة الحبل الشوكي كاملة. 1 ومن المثير للاهتمام، الأنقليس لديها مجموعة من 36 الحبل الشوكي إسقاط الخلايا العصبية التي يمكن تحديدها بشكل فردي في جبل لالجامع الاستعدادات الدماغ بسبب حجمها الكبير 2،3 (الشكل 1) . وaxotomized كل من هذه الخلايا العصبية في العمود الفقري عن طريق إسقاط كامل transection الحبل الشوكي على مستوى عال. وقد أظهرت الدراسات السابقة من مجموعتنا وآخرون أنه حتى في وجود الانتعاش وظيفية بعد اصابات النخاع الشوكي بعض هذه الخلايا العصبية تظهر قدرة التجدد منخفضة جدا (أنها تعتبر "regenerators سيئة")، في حين أن آخرين تتجدد عادة محور عصبي من خلال موقع الإصابة (أنها تعتبر "زregenerators العود "). 2،3 هذه الخاصية تجعل الأنقليس نموذجا الفقاريات مثيرة للاهتمام لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني بين الاسترجاع الجيد والسيئ إسقاط الخلايا العصبية في العمود الفقري والتي بدورها سوف تؤدي إلى اختلافات في القدرة على التجدد من الخلايا العصبية الذاتية التي تحاول تجديد محاور عصبية في نفس البيئة خارجي. 1
باستخدام هذا النموذج أظهرنا سابقا أن الخلايا العصبية مع انخفاض القدرة على التجدد المعرض التعبير عن مستقبلات الجزيء التوجيه محور عصبي مثل UNC5 4،5 وneogenin، 6 الذي توسط في العمل المثبطة من netrin وRGM التوالي إسقاط العمود الفقري. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام هذا الأسلوب وقد أظهرت مجموعتنا أيضا أن فقط regenerators جيدة تظهر انتعاشا للتعبير عن neurofilaments بعد إصابة وأثناء عملية التجدد. مؤخرا، أظهرت بوش ومورغان 7 بواسطة المناعي أن تظهر regenerators سيئة على الزيادهإد التعبير عن synuclein بعد الإصابة، التي ارتبط بها الكتاب إلى حقيقة أن "المجداد سيئة" إسقاط الخلايا العصبية في العمود الفقري يموتون ببطء بعد استكمال الحبل الشوكي transection 5،7،8. لذلك، برز نموذج الجلكى اصابة في الحبل الشوكي كاملة كنموذج مفيد جدا لفهم ما يجعل الحبل الشوكي والخلايا العصبية إسقاط "المجداد سيئة" بعد axotomy.
لإجراء دراسات لدينا ونحن أداء كاملة الشوكي transection الحبل بروتوكول جراحة وتشريح الدماغ الخلفي عند نقاط الوقت المطلوب بعد إصابة لأداء wholemount التهجين في الموقع. في المقالة المنهجية الحالية نقدم بروتوكول مفصلة عن الأداء السليم لعملية جراحية في العمود الفقري إصابة الحبل كاملة في الأنقليس اليرقات، وصيانة لاحقة من الحيوانات وتشريح الدماغ النهائي وإعداد الدماغ لwholemount التهجين في الموقع. بروتوكول مفصل لPErform على wholemount في الموقع التهجين في الدماغ من الأنقليس اليرقات وقد ذكر سابقا. 9 وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا البروتوكول لإصابة الحبل الشوكي وتشريح الدماغ يمكن أن تستخدم أيضا ثم لمعالجة أدمغة لالمناعية النسيجية أو أساليب أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
انظر الجدول رقم 1 لجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.
تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة تمبل.
1. الحيوانات
- الحصول wildtype اليرقات البحر الأنقليس (Petromyzon مارينوس L.)، 10 - 14 سم في الطول (4-7 سنة) من مصادر تغذية بحيرة ميشيغان، من روافد لنهر ديلاوير (بنسلفانيا) أو تيارات في ولاية ماين.
- في المختبر، والحفاظ على اليرقات في مجموعات من 50-100 الحيوانات في خزانات المياه العذبة 50 جالون عند 16 درجة مئوية. خط الدبابات مع بوصة من الحصى لليرقات لتحفر في وتصفية المياه الفحم واشترط بالحجارة الهواء لمدة 48 ساعة على الأقل لإزالة الكلور وغيرها من الشوائب قبل وضع الأنقليس فيها. ليست هناك حاجة لتغذية الحيوانات، والتي تدوير المخلفات الخاصة بهم، حتى يومنا الاستخدام.
2. الكامل العمود الفقريTransection الحبل
- قبل جراحة الحبل الشوكي إعداد حل الجلكى قارع الأجراس مع التشكيل التالي: 110 مم كلوريد الصوديوم، 2.1 ملي بوكل، 2.6 مم CaCl 2، 1.8 ملم MgCl 2 و 10 ملي تريس العازلة؛ ودرجة الحموضة 7.4.
- لأداء transection الحبل الشوكي، ووضع اليرقات في وعاء صغير ليتم تخدير مع 1٪ تريكين methanesulfonate الجليد في حل قارع الأجراس البارد.
- مرة واحدة مكان تخدير الحيوانات في طبق بتري تملأ نصف مع Sylgard (سيليكون) وتستخدم 4 دبابيس الحشرات (0.15 مم) لعقد الحيوانات في موقف لعملية جراحية (يتم وضع واحد في خطم الحيوان، واحدة في ذيل واثنين على مستوى الخيشومية الموافق 5). ملء طبق بتري تقريبا إلى أعلى مع حل قارع الأجراس. وضع الطبق مع اليرقة على الجليد أثناء أداء الجراحة تحت stereomicroscope.
- لأداء transection الحبل الشوكي على ظهري، خط الوسط، وجعل شق طولي مع مشرط (# 11) في مستوى ال 5الخيشومية لتصور الحبل الشوكي. في البداية الجلد مفتوح عن طريق إدراج غيض من شفرة مشرط مواجهة ومن ثم يتم قطع الأنسجة العضلية بلطف شديد حتى يمكن رؤية الحبل الشوكي من فوق. أزياء اثنين من السنانير دبابيس الحشرات واستخدامها لعقد الجدران مفتوحة أثناء تنفيذ transection الحبل الشوكي.
- تماما القطع في الحبل الشوكي في مستوى الخيشومية الموافق 5 باستخدام زوج من مقص (Castroviejo 8 #)، إدراج مقص عموديا إلى الحبل الشوكي. الحبل الشوكي لابد مقطوع تماما مع قطع نظيفة احد. تصور الحبل الشوكي قطع نهايات تحت stereomicroscope للتأكد من أن الحبل الشوكي تم مقطوع تماما. ثم، إعادة ترتيب قطع طرفي الحبل الشوكي بعد transection باستخدام زوج من ملقط (رقم 5).
- بعد أداء transection الحبل الشوكي إغلاق الجرح في جدار الجسم الظهرية مع زوج من ملقط غرامة ووضع اليرقات على الجليد لمدة 1 ساعة للسماح للر الجرحس تجف. وضع قطعة من ورق الترشيح بين الجليد واليرقات ونقع عليه مع حل الجلكى قارع الأجراس. درجة حرارة منخفضة تحافظ على الحيوانات الحية في الوقت نفسه أنه يتيح الجرح للهواء الجاف، وبالتالي يساعد على منع الالتهابات.
- ثم نقل اليرقات إلى خزانات صغيرة (1 يرقة لكل خزان) مع الماء البارد الجليد لمدة 24 ساعة.
- دراسة lesioned يرقات 1 يوم بعد transection الشوكي لتأكيد سلوكيا أنه لا يوجد الذيلية الحركة إلى موقع الإصابة. ويعتبر الحبل الشوكي transection كاملة إذا اليرقة يمكن أن تتحرك إلا منقاري رأسه إلى موقع الإصابة (على مستوى الخيشومية الموافق 5). إذا كان هذا هو الحال اليرقات ويمكن الآن أن يتم تحويلها إلى خزانات (1 يرقة لكل خزان) مع المياه العذبة في درجة حرارة الغرفة (23 ° C) للسماح لهم لاستعادة لحظات زمنية بالتوقيت الذي تم اختياره.
- خلال فترة النقاهة تغيير الماء كل 2 إلى 3 أيام.
3. تشريح الدماغ وإعدادالدماغ لالتهجين في الموقع
- في الوقت المطلوب نقاط بعد الإصابة إعادة تخدير اليرقات البحر الأنقليس ومكان وارجاعهم في طبق بتري مع حل قارع الأجراس لإجراء تشريح الدماغ على النحو الوارد أعلاه.
- لتشريح الدماغ خارج، تأكد أولا شق عرضية مع مشرط بين فتحة الأنف والجهاز الصنوبرية. من هنا تبدأ لقطع الأنسجة المحيطة بالمخ باستخدام زوج من مقص Castroviejo حين عقد مع زوج من ملقط.
- مرة واحدة يتعرض لها المخ، وإزالة الضفيرة المشيمية باستخدام زوج من ملقط واستخدام السنانير لنشر رأس الحيوان وفضح أعصاب في الجمجمة. ثم، وقطع الحبل الشوكي عرضيا مع مقص Castroviejo. عقد الحبل الشوكي مع زوج من ملقط مع استخدام زوج آخر من ملقط لقطع الأعصاب القحفية لتشريح الدماغ بها.
- بعد تشريح، ووضع الدماغ على قطعة صغيرة من السيليكون والاحتفاظ بها في موقف بإدخال 2 الإضافيةإلخ الدبابيس في بصيلات الشم و 1 في الحبل الشوكي. ثم، وقطع الخلفي والملتقيات cerebrotectal من الدماغ على طول خط الوسط الظهرية مع مقص وصرف لوحات الجناحية أفقيا وارجاعهم شقة للسيليكون مع 4 دبابيس الحشرات (الشكل 2).
- نقل قطعة من السيليكون مع الدماغ إلى أنبوب يحتوي بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4) لتكون ثابتة في غرفة تيمباراتوري لمدة 3 ساعة على محور دوار.
- بعد التثبيت استخدام الدماغ لwholemount في الموقع التهجين كما هو موضح سابقا (سوين وآخرون، 1994). يجب تشغيل العقول من السيطرة أو صورية تعمل الحيوانات دائما بالتوازي مع العقول من الحيوانات المصابة. الدماغ اليرقات wholemounted يمكن دراستها عن طريق التهجين في الموقع بسبب شكله المسطح ورقيقة وأيضا بسبب غياب 10 المايلين، مما يجعل الدماغ شفافة إلى حد ما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
