Summary
七鳃鳗完整的脊髓损伤后恢复运动。然而，一些脊髓投射神经元是很好的再生和其他人都没有。本文说明了技术的外壳海七鳃鳗幼体（最近转化成人），产生完全性脊髓横断和原位杂交准备wholemount大脑和脊髓的。
Abstract
经过完全性脊髓损伤，海七鳃鳗在第一瘫痪横断以下的水平。然而，它们恢复运动数周之后，与此相伴的propriospinal轴突和从脑干脊髓伸出的轴突的短距离再生（几个毫米）。其中36个大型识别脊髓投射神经元，有些是很好的再生等是坏的再生。这些神经元可最容易在wholemount CNS制剂来鉴定。为了了解在有利于神经元内在机制或在脊椎动物中枢神经系统损伤后抑制轴突再生，我们确定好坏再生器之间的差异的基因表达，以及如何表达由脊髓横断影响。本文阐述了在淡水舱的技术外壳幼虫和近期改造成海七鳃鳗，产下的显微视觉完全性脊髓横断，并准备BR泉和脊髓wholemounts用于原位杂交。简要地，将动物保持在16 °C和麻醉的1％苯佐卡因的七鳃鳗铃声。脊髓经由背侧入横断与虹膜切除术剪刀和该动物被允许在淡水罐在23℃下进行恢复。用于原位杂交，将动物再次麻醉，并在大脑和脊髓经由背侧的方法除去。
Introduction
在哺乳动物脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的条件，导致的损伤部位以下功能永久性丧失，因为受伤的轴突不需要通过创伤区再生和重新连接到适当的目标。相反，哺乳动物，七鳃鳗恢复完全性脊髓损伤后运动。1有趣的是，七鳃鳗有一套36脊髓投射神经元是单独识别整个安装，因为他们的大尺寸2,3（ 图1）脑准备。所有这些脊髓投射神经元是由一个高层次的脊髓完全横断金黄地鼠。我们的组和其他的以前的研究已经表明，即使在功能恢复脊髓损伤后某些神经元表现出非常低的再生能力的存在（它们被认为是“坏的蓄热室”），而其他通常通过损伤部位再生的轴突（他们被认为是“GOOD再生“）。2,3这种特性使得七鳃鳗有趣脊椎动物模型来研究在好的和坏的再生脊髓投射神经元，这反过来会导致神经元的企图的固有再生能力的差异之间基因表达的差异再生的轴突在同一外在环境。1
利用该模型，我们以前曾表明，脊髓投射神经元的轴突与导向分子受体如UNC5 4,5和neogenin，6分别介导netrin诱导和RGM的抑制作用，低蓄热能力秀的表情。此外，通过使用这个方法，我们小组还表明，只有在良好的蓄热表明神经丝的表达的恢复的损伤后和在再生过程。最近，布希和摩根7表明，免疫荧光，坏再生器显示的increas突触核蛋白的表达主编受伤后，已经涉及了作者这一事实，即“坏再生”脊髓投射神经元脊髓完全横断5,7,8后慢慢死去。因此，一个完整的脊髓损伤的七鳃鳗的模型已经成为一个非常有用的模型，以了解是什么造就了脊髓神经元投射一个“坏再生”切断后。
进行我们的研究，我们在期望的时间点执行一个完整的脊髓横断手术协议和后脑部解剖损伤后原位杂交执行wholemount。在本方法的文章中，我们提出了一个详细的协议为完全性脊髓损伤手术在七鳃鳗幼体的正常性能，后续维护动物和最终大脑解剖和准备的大脑原位杂交wholemount。一份详细的协议，PErform原位杂交的wholemount在幼虫七鳃鳗的大脑已经被报告过。9另外，该协议用 于脊髓损伤和脑解剖也可用于再加工的大脑用于免疫组化分析或其他组织学方法。
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Protocol
表1为在本协议中使用的所有材料。
实验获得批准的机构动物护理和使用委员会在坦普尔大学。
1，动物
- 获得野生型幼虫海七鳃鳗（Petromyzon马里努斯 L.），10 - 23厘米的长度-从流喂养密歇根湖，从支流到特拉华河（宾夕法尼亚州），或者流于缅因州（4 7岁）。
- 在实验室中，幼虫保持在50组 - 100动物50加仑淡水坦克在16℃。符合碎石英寸坦克的幼虫在挖洞，水是木炭过滤，空调与空气的石头至少48小时将七鳃鳗在他们之前，去除余氯等杂质。没有必要对喂动物，其中回收自己的碎屑，最多使用的当天。
2，完全性横断
- 脊髓手术前准备有以下组成的七鳃鳗林格液：110 mM氯化钠，2.1 mM的氯化钾，2.6毫米氯化钙2，1.8毫米氯化镁2和10毫米的Tris缓冲液; pH值7.4。
- 要执行脊髓横断，将幼虫在一个小容器进行麻醉，在冰冷的林格液1％三卡因甲磺酸盐。
- 一旦麻醉的地方在陪替氏培养皿的一半填充的Sylgard（聚硅氧烷）的动物，并使用4个昆虫针（0.15毫米直径），以保持在位置上的动物的手术（一个被放置在动物的口鼻部，一个在尾和两个在第 5 次鳃的水平）。填补了培养皿中几乎达到了林格液的顶部。放菜的幼虫上的冰而进行体视显微镜下手术。
- 要执行脊髓横断背，中线，作一纵切口，用手术刀（＃11）在第 5 次的水平鳃形象化脊髓。最初的皮肤是通过将手术刀刀片的尖端朝上，然后将肌肉组织被切得很平缓，直至脊髓从上面可以看到的开放。时尚的昆虫针两个挂钩，并用它们来保持身体的墙壁打开，而执行脊髓横断。
- 用一把剪刀（Castroviejo＃8）完全横切在第 5 次鳃水平脊髓，垂直插入剪刀脊髓。脊髓已被完全地与一个干净的切割横断。可视化的体视显微镜下脊髓切割端，以确认该脊髓已被完全切断。然后，通过使用一对镊子的（＃5）重新对准脊髓的切断端部的横断后。
- 在进行脊髓横断关闭背侧体壁的伤口有一对细钳子并放置冰上幼虫1小时，以允许伤口吨后Ø干。放一张滤纸冰和幼虫间和七鳃鳗林格液浸泡。低温保存的动物活的同时，它使伤口空气干燥，因此，有助于防止感染。
- 然后转移幼虫小坦克（每罐1幼虫）用冰冷的水24小时。
- 脊髓横断后检查损毁幼虫1天到行为上确认，没有任何动静尾椎受伤的部位。脊髓横断被认为是完整的，如果幼虫能只移动其头部吻端到损伤部位（在第 5 次鳃的水平）。如果是这种情况的幼虫现在可传送到罐（每罐1幼虫）与淡水，在室温（23 ℃），使它们恢复为所选定的时间点。
- 在恢复期间换水，每2至3天。
3，脑解剖和制备脑原位杂交
- 在受伤后的所需时间点重新麻醉幼虫海七鳃鳗和地点和引脚他们在陪替氏培养皿用林格氏溶液来进行脑解剖如上。
- 解剖大脑了，先作一横切口的鼻孔和松果体器官之间的手术刀。从这里开始利用一对Castroviejo剪刀，同时保持其与钳子切割周围的脑组织。
- 一旦脑露出，通过使用一对镊子取出脉络丛和使用钩子来传播该动物的头部和暴露的脑神经。然后，切断脊髓横向与Castroviejo剪刀。而使用其他钳子切颅神经解剖大脑出了钳子抓住脊髓。
- 解剖后，把大脑的一小块硅胶并保持在适当的位置插入2项等销嗅球和1脊髓。然后，切断后并沿背中线与剪刀的大脑cerebrotectal合缝和偏转翼片横向和管脚他们平与4昆虫针（ 图2）的聚硅氧烷。
- 用脑转移片硅氧烷与含在磷酸缓冲盐溶液4％多聚甲醛（pH 7.4）中而固定，在室温北部沿海地区为3小时，在旋转器上的管。
- 固定后在原位杂交用脑的wholemount如前所述（Swain 等人，1994）。从控制或假手术动物的大脑，应始终平行于从受伤的动物的大脑运行。该wholemounted幼虫脑可以通过原位杂交，因为也由于没有髓鞘10，这使得大脑相当半透明其平而薄的形状并且被研究。
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Representative Results
作为可使用这种方法时得到的结果的一个例子，wholemounted大脑的表示控制的可识别的脊髓投射神经元和2周neogenin转录物的表达的代表性图像受损后幼虫海七鳃鳗示于图2。的读者可以参考先前的研究报告6完全脊髓横断和识别脊髓投射海七鳃鳗的神经元的全部细节再生能力后neogenin的表达之间的关系。简要地说，结果表明，在受伤后有变化，在识别脊髓投射神经元的neogenin受体的表达。一个完整的脊髓横断后neogenin受体是优先表达在恶劣的蓄热，如M1，I1，I2，I4，或第M个神经元（参见图2B），这些结果证明了该结果两周的协议和表明可参与这些细胞的再生失败的neogenin受体。
图1：海七鳃鳗的大脑识别出神经元网状脊髓的位置的背视图的示意图 。从巴雷罗-伊格莱西亚斯和Shifman。5转载有关缩写，见下表。
图2显微照片的成熟幼虫海七鳃鳗的脑背示出了neogenin成绩单的对照组（A）的表达，2周后损伤（B）的动物。注意在B中受伤的后neogenin转录物是优先表达在已知是不良再生神经元（ 例如 ，M1，I1，I2，I4和第M个神经元）。此外，请注意所使用的保持大脑（箭头）的销离开孔的存在。的读者可以参考以前的研究Shifman和同事。6对于缩写，见下表。
缩略语
| B（B1-B6） | 延髓区域Müller细胞（中rhombencephalic网状核） |
| hab.-PED。 TR。 | habenulopeduncular道 |
| I1-I6 | 峡区Müller细胞 |
| í点¯x | 舌咽运动核 |
| inf文件。 | 漏斗 |
| ISTH。网状细胞。 | 峡部裂网状结构 |
| M1-M4 | Müller细胞1至4 |
| 个月 | 的Mauthner细胞 |
| MTH“ | 辅助的Mauthner细胞 |
| SMI | 沟medianus劣 |
| VM | 三叉神经运动核 |
| 点¯x | 迷走神经运动核 |
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Discussion
在这里，我们提出了一个详细的协议来执行一个完整的脊髓横断，后脑部解剖幼虫海七鳃鳗。这个程序允许通过全贴脑原位杂交的方法在脊髓损伤后可识别的脊髓神经元投射之间的基因表达差异分析。在该过程中的关键步骤是一个完整的脊髓横断的正确性能，从而可以通过观察stereomicrocope下脊髓的切割端24小时后，轻轻触摸幼虫的口鼻部具有一对被控制和确认钳子，以查看是否有任何移动尾椎到损伤部位。它也是用于动物的是，用于外科手术的剪刀不钝的恢复重要的，一个单一的和干净的切割是为了完全横切脊髓。
动物受伤后的生存高度通过保持阿尼姆改善在外科手术和用于使伤口风干，然后在冰冷的水中进行的第一个24小时的时间期间，在冰上ALS。在此期间后伤口闭合和动物可以在室温下已经被转移到容器用淡水。
幼虫七鳃鳗被允许恢复在室温下，而不是在他们一贯的冷温度，因为更大的大部分动物的伤害在较高温度下恢复后，完全自发的行为功能。11运动的正常模式的恢复是观察8〜10周后脊髓完全横断。
在选定的时间点幼虫大脑可以不仅处理执行完整脊髓横断和大脑解剖执行后如下所示整个安装原位杂交（ 图2），但也可用于其它组织学方法，如免疫组织化学（ 例如：7 例如 8）或活化的胱天蛋白酶通过使用荧光染料标记的胱天蛋白酶抑制剂的检测。5
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
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