Summary
Lamprey tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. Ancak, bazı spinal çıkıntı nöronlar iyi rejeneratörler ve diğerleri değildir. Bu kağıt tam omurilik kesilerde üreten ve in situ hibridizasyon için Wholemount beyinleri ve omurilik hazırlama, konut deniz taşemen larvaları (ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkinler) için teknikleri göstermektedir.
Abstract
Tam bir omurilik yaralanması sonrası, ilk deniz lampreys kesisi seviyesinin altında felç. Ancak, birkaç hafta sonra lokomosyonu kurtarmak ve bu propriyospinal akson ve beyin sapından spinal çıkıntı akson kısa mesafe rejenerasyon (birkaç mm) eşlik ediyor. 36 büyük tanımlanabilir spinal çıkıntı nöronlar arasında, bazı iyi rejeneratörler ve diğerleri kötü rejeneratörler vardır. Bu nöronlar en kolay Wholemount MSS hazırlıkları tespit edilebilir. Lehine nöron-iç mekanizmaları anlamak veya omurgalıların MSS yaralanmadan sonra akson rejenerasyonu inhibe etmek için, biz iyi ve kötü rejeneratörlerde arasında gen ifadesinde farklılıkları belirlemek ve nasıl ifade omurilik transection etkilenir. Bu kağıt mikroskopik görüş altında tam omurilik kesilerde üreten ve br hazırlama, tatlı su tankları konut larva teknikleri ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkin deniz lamprey balıklarının göstermektedirain ve in situ melezleme için omurilik wholemounts. Kısacası, hayvanlar 16 tutulmaktadır C ° ve taşemen Ringer% 1 Benzokain anastezi. Omurilik bir dorsal yaklaşım ile iridektomi makas ile nakledilmiştir ve hayvan 23 ° C'de tatlı su tanklarında kurtarmak için izin verilir. In situ hibridizasyon için, hayvanlar tekrar uyutuldu ve beyin ve kord dorsal yaklaşım ile kaldırıldı.
Introduction
Memelilerde spinal kord yaralanması (SKY) yaralandı aksonlar travma bölgesi üzerinden yeniden ve uygun hedefler yeniden çünkü yaralanma sitenin altındaki fonksiyonlarda kalıcı kaybına yol açan yıkıcı bir durumdur. Memelilerde aksine, lampreys tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. 1 İlginçtir, lampreys çünkü onların büyük boy 2,3 (Şekil 1) beyin hazırlıklarını monte bütün 36 omurilik ayrı ayrı tanımlanabilir nöronların çıkıntı bir dizi var . Bu omurga verme nöronların tüm üst düzey bir tam omurilik transeksiyonu ile axotomized edilir. Grubumuzun ve diğerleri daha önceki çalışmalar, diğerleri genellikle yaralanma sitesi aracılığıyla akson yeniden ederken bile bu nöronların bazı çok düşük bir rejeneratif kapasitesini göstermek SKY sonrası fonksiyonel iyileşme varlığında, (onlar "kötü rejenatörler" olarak kabul edilir) olduğunu göstermiştir (onlar kabul edilir "gOOD rejeneratörler "). 2,3 Bu özellik Lamprey da girişimi nöronların içsel rejeneratif yeteneği farklılıklara yol açacaktır iyi ve kötü yenileyici spinal çıkıntı nöronlar arasındaki gen ifadesinde farklılıkları incelemek için ilginç bir omurgalı model yapar Aynı dış ortamda aksonlar rejenere. 1
Daha önce göstermiştir ki, bu modeli kullanarak, spinal-projelendirme sırasıyla netrin ve RGM inhibitör eylemi aracılık UNC5 4,5 ve neogenin, 6 gibi akson rehberlik molekül reseptörlerinin düşük rejeneratif yeteneği gösteri ifade ile nöronlar. Buna ek olarak, bu yöntem kullanılarak grup, aynı zamanda, sadece iyi bir rejeneratörler yaralanma sonrası ve yenilenme sürecinde nörofilament ekspresyonunun bir toparlanma göstermektedir göstermiştir. Son zamanlarda, Busch ve Morgan 7 kötü rejeneratörler bir arttırmaya göstermektedir ki, bağışıklık fluorışıması yoluyla göstermiştir"kötü yenileyici" spinal çıkıntı nöronlar yavaş yavaş tam bir omurilik kesisi 5,7,8 sonra ölmek gerçeğine yazarlar tarafından ilgili olmuştur yaralanma sonrası sinüklein ed ifade. Yani, tam bir omurilik yaralanmasının taşemen modeli omurilik çıkıntı nöron axotomy sonra "kötü rejeneratörün" kılan anlamak için çok kullanışlı bir model olarak ortaya çıkmıştır.
In situ hibridizasyon Wholemount gerçekleştirmek için yaralanmadan sonra istenilen zaman noktalarında tam bir spinal kord kesisi ameliyat protokolü ve arka beyin diseksiyonu gerçekleştirirken bizim çalışmalar yapmak. Bu yöntem makalede larva Lamprey tam bir omurilik yaralanması cerrahi uygun performansı için detaylı bir protokol mevcut, hayvanların daha sonraki bakım ve in situ melezleme için bir wholemount nihai beyin diseksiyon ve beyin hazırlanması. Ayrıntılı bir protokol pelarva Lamprey beyninde in situ hibridizasyon wholemount rform daha önce rapor edilmiştir. 9 ek olarak, omurilik yaralanması, beyin diseksiyon Bu protokol, aynı zamanda daha sonra imünohistokimya ya da diğer yöntemler için histolojik beyinleri işlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler için Tablo 1'e bakınız.
Deneyler Temple Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Hayvanlar
- Yabanitip larva deniz lamprey balıklarının (Petromyzon marinus L.) elde, 10 - Maine Delaware Nehri (Pennsylvania) veya akışları yan kolları, Michigan Gölü besleyen derelerden - (7 yaşında 4) uzunluğu 14 cm.
- 16 ° C'de 50 galon tatlı su tanklarında 100 hayvanlar - Laboratuvarda, 50 gruplar halinde larvaları korumak. Çizgi çakıl bir inç ile tankları larvalar yuva için, ve su kömür süzüldü ve onlara lamprey balıklarının yerleştirmeden önce klor ve diğer kirleri çıkarmak için en az 48 saat süreyle hava taşlarla şartına bağlıdır. Kullanım güne kadar, kendi sifonlanarak geri dönüşüm hayvanları beslemek için gerek yoktur.
2. Tam SpinalKordon Kesisi
- Omurilik cerrahisi önce aşağıdaki kompozisyona sahip bir taşemen Ringer çözeltisi hazırlayın: 110 mM NaCI, 2.1 mM KCI, 2.6 mM CaCl2, 1.8 mM MgCI2 ve 10 mM Tris tamponu; pH 7,4.
- Omurilik transeksiyonu gerçekleştirmek için, küçük bir kap içinde larva yerleştirin buz gibi soğuk Ringer çözeltisi içinde% 1 tricaine metansülfonat ile anestezi edilmesi.
- Anestezi uygulanmış yerde bir kez yarı Sylgard (silikon) ile doldurulmuş bir petri kabına hayvanlar ve bir kuyruk, hayvanın burun az birini yerleştirilir (cerrahi pozisyonda tutmak için hayvanlar 4 böcek pimleri (0.15 mm çapında) kullanın ve iki 5. solungaç seviyesinde). Neredeyse Ringer çözeltisi ile üstüne kadar petri doldurun. Stereomicroscope altında ameliyat yaparken buz üzerinde larva ile çanak koyun.
- Omurilik transection bir dorsal gerçekleştirmek için, orta hat, 5 inci seviyesinde bir neşter (# 11) ile uzunlamasına bir kesi yapmaksolungaç omurilik görselleştirmek için. Başlangıçta cilt yukarı bakacak ve omurilik Yukarıda anlatılanlardan görülebileceği kadar Daha sonra kas dokusu çok yavaşça kesilir neşter bıçak ucu sokarak açıktır. Moda iki böcek pimleri gelen kancalar ve omurilik kesiye yaparken vücut duvarları açık tutmak için bunları kullanın.
- Tamamen, bir makas (8 Castroviejo #) kullanılarak 5. solungaç seviyesinde omurilik transeksiyonu omurilik dik olarak makas yerleştirin. Omurilik tamamen temiz bir kesim ile nakledilmiş olması gerekir. Omurilik tamamen transected teyit etmek stereomicroscope altında omurilik kesilmiş uçlara gözünüzde canlandırın. Daha sonra, bir çift forseps (# 5) ile transeksiyonu sonra omurilik kesilmiş uçlara yeniden hizalayın.
- Omurilik yaralanması ince forseps ile bir çift dorsal gövde duvarı içindeki yarayı kapatmak ve yara t izin vermek için 1 saat boyunca buz üzerinde larvaları koymak yaptıktan sonrao kurulayın. Buz ve larvaları arasında filtre bir parça kağıt koyun ve taşemen Ringer çözeltisi ile ıslatın. Düşük ısıya sahip olan ve bu nedenle kuru enfeksiyonları önlemek için yardımcı hava yara izin verir, aynı zamanda canlı hayvanları tutar.
- Daha sonra 24 saat boyunca buz gibi soğuk su ile küçük tank Larvalar (tank başına 1 larva) aktarın.
- Davranışsal yaralanma siteye hiçbir hareket kuyruk olduğunu onaylamak için spinal transeksiyondan sonra lezyon larvalar 1 gün inceleyin. Larva (5. solungaç düzeyinde) yaralanma siteye sadece baş rostral taşıyabilirsiniz eğer spinal kord Kesi tam olarak kabul edilir. Bu durumda larva 23 (oda sıcaklığında tatlı su ile tanklar (tank başına 1 larva) transfer edilebilir ° C) onları seçilen zaman noktalarında kurtarmak için izin vermek.
- Iyileşme döneminde her 2 ila 3 gün su değiştirmek.
3. Beyin Diseksiyon ve hazırlanmasıIn situ Hibridizasyon için Beyin
- Yaralanma sonrası istenilen zaman noktalarında larva deniz lamprey balıklarının yer ve yeniden uyutmak ve yukarıdaki gibi beyin diseksiyon için Ringer çözeltisi ile petri onları pin.
- Beynini incelemek için, önce burun deliği ve epifiz organı arasındaki neşter ile enine kesi yapmak. Buradan forseps bir çift ile tutarak Castroviejo bir makas kullanarak beyni çevreleyen dokuyu kesmek başlar.
- Beyin ortaya çıktığında, bir çift forseps kullanılarak koroid pleksus kaldırmak ve kafatası sinirleri hayvanın baş yaymak ve açığa çıkarmak için kancaları kullanın. Ardından, Castroviejo makasla omurilik enine doğru kesti. Beynini incelemek için kranial sinirler kesmek için forseps başka bir çift kullanırken forseps bir çift omurilik tutun.
- Diseksiyon sonrası, silikon küçük bir parça üzerinde beyin koymak ve 2 ins takarak konumda tutunomurilikte bulbuslarında ve 1 ect'yi pimleri. Sonra, posterior ve makas ile dorsal orta hat boyunca beynin cerebrotectal kommisürlere kesilmiş ve yanal alar plakaları saptırmak ve 4 böcek iğneli (Şekil 2) ile silikon onları düz pin.
- , Bir döndürücü üzerinde 3 saat boyunca oda sıcaklığında sabit olarak fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehid (pH 7.4) içeren bir tübe beyin ile silikonun parça aktarın.
- Daha önce tarif edildiği gibi tespit edildikten sonra in situ olarak melezleşme wholemount için beyin kullanmak (Swain ve ark., 1994). Kontrol veya sahte ameliyat hayvanlardan alınan beyinler yaralı hayvanların beyinleri ile paralel olarak her zaman çalıştırılmalıdır. Wholemounted larva beyin nedeniyle, düz, ince ve şekli, aynı zamanda, beyin oldukça saydam hale miyelin 10'un bulunmadığı durumlarda, in situ olarak melezleşme ile incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemi kullanarak elde edilebilir sonuçlarından bir örnek olarak, tanımlanabilir omurilik verme kontrolü, nöronlar ve 2 hafta içinde neogenin transkriptlerinin ekspresyonunu gösteren wholemounted beyinleri temsili görüntüleri lezyon larva deniz lampreys Şekil 2'de gösterilmiştir sonrası. okuyucular tam omurilik transection ve tüm ayrıntılar için deniz lamprey nöronları çıkıntı tanımlanabilir omurilik rejeneratif yeteneği sonra neogenin ifade arasındaki ilişkiyi bildiren önceki bir çalışmada 6 adlandırılır. Kısaca, sonuçlar yaralanmadan sonra tesbit omurga verme nöronlarda neogenin reseptörünün ifade değişiklikler olduğunu göstermiştir. Neogenin reseptör tercihen M1, I1, I2, I4, ya Mth nöronların (Şekil 2B) Bu sonuçlar sonucunu göstermek gibi kötü Rejeneratörlerde ifade edilir tam bir omurilik transeksiyondan sonra iki haftave protokol neogenin reseptör bu hücrelerin yenilenme başarısızlık dahil olabileceğini düşündürmektedir.
Şekil 1: tanımlanabilir reticulospinal nöronların yerini gösteren deniz taşemen beyin dorsal görünümü şematik çizimi. Kısaltmalar için Barreiro-Iglesias ve Shifman. 5 çoğaltılamaz, aşağıdaki listeye bakın.
Dorsal kontrol, (A) 'de neogenin transkriptinin ekspresyon gösteren larval deniz taşemen beyin görüş ve sonrası yaralanma (B), hayvanlar, 2 haftalık Şekil 2. fotomikrografları. B Not yaralanma sonrası Keogenin transkript tercihen rejeneratörleri kötü olduğu bilinen nöronlarda ifade edilir (örneğin M1, I1, I2, I4 ve Mde nöronlar). Ayrıca, beyin (oklar) tutmak için kullanılan pim bıraktığı deliklerin varlığını not edin. Okuyucular aşağıdaki listeye bakın, kısaltmalar için Shifman ve arkadaşları. 6 tarafından önceki çalışmada adlandırılır.
KISALTMALAR
| B (B1-B6) | Bulbar bölgenin, Muller hücreleri (orta rhombencephalic retiküler nükleus) |
| hab.-ped. tr. | habenulopeduncular yolu |
| I1-I6 | Istmik bölgenin Müller hücrelerinin |
| BenX | glossofaringeal motor çekirdeği |
| enf. | infundibulumun |
| isth. Retikülosit. | istmik retiküler formasyon |
| M1-M4 | Müller hücrelerinin 1-4 |
| MTH | Hücre Mauthner |
| MTH ' | Yardımcı Mauthner hücre |
| smi | sulcus Medianus aşağı |
| Vm | trigeminal motor çekirdeği |
| X | vagus motor çekirdeği |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada larva deniz lamprey balıklarının tam bir omurilik kesiye ve arka beyin diseksiyon gerçekleştirmek için detaylı bir protokol mevcut. Bu prosedür in situ hibridizasyon bir bütün-montaj beyin vasıtasıyla omurilik yaralanması sonrası tanımlanabilir omurilik çıkıntı nöronlar arasında gen ifadesinde analiz farklılıkları sağlar. Prosedürdeki kritik aşama hafifçe bir çift larva burun dokunarak 24 saat sonra stereomicrocope altında omurilik kesilmiş uçlara gözlemleyerek kontrol edilebilir ve doğrulanabilir tam bir omurilik kesisi doğru performansı, bir yaralanma yerine yer herhangi bir hareketin kuyruk olup olmadığını görmek için forseps. Ayrıca, cerrahi için kullanılan makaslar küt olmayan hayvanın geri kazanılması için önemli ve tek ve temiz bir kesim omuriliği tamamen transeksiyonu için yapılır olmasıdır.
Yaralanma sonrasında hayvanların hayatta kalması oldukça Anim tutarak geliştirilirAmeliyat sırasında, ilk 24 saat boyunca havayla kurutun ve daha sonra buz soğukluğunda su ile yara sağlamak için kullanılan bir saat boyunca buz üzerinde ALS. Bu süreden sonra, yara kapatılır ve hayvan oda sıcaklığında bile, tatlı su ile tanklara transfer edilebilir.
Larvaların lampreys. Hayvanların büyük bir çoğunluğu daha yüksek sıcaklıklarda tam yaralanma sonrası lokomotor fonksiyonunu davranışsal geri, oda sıcaklığında olup bunların her zamanki gibi soğuk bir sıcaklıkta 11 kurtarmak için izin verilen hareket edebilmek için normal örüntüsünün geri 8-10 hafta gözlenmiştir Tam omurilik transeksiyondan sonra.
Burada gösterildiği gibi, bir gerçekleştirmek için larva beyin sadece işlenebilir seçilen zaman noktalarında tam spinal kord yaralanması, beyin diseksiyon yapıldıktan sonra in situ olarak melezleşme tüm montaj, aynı zamanda histolojik immünohistokimya gibi diğer yöntemler (için (Şekil 2) örneğin 7 (örneğin, 8) ya da florokrom etiketli kaspaz engelleyiciler kullanılarak aktif kaspaz tespiti. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
