Summary
As lampreias recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinhal. No entanto, alguns neurônios espinhais de projeção são bons regeneradores e outros não. Este artigo ilustra as técnicas para larvas de lampreia mar habitação (e adultos recém-transformados), produzindo completos transecções medulares e preparar cérebros wholemount e medulas espinhais de hibridização in situ.
Abstract
Depois de uma lesão completa da medula espinhal, lampreias marinhas no primeiro estão paralisados abaixo do nível da transecção. No entanto, eles se recuperam locomoção depois de várias semanas, e isso é acompanhado por regeneração curta distância (alguns mm) dos axônios propriospinal e axônios espinal-se projectam a partir do tronco cerebral. Entre os 36 grandes neurônios espinhais-projetando identificáveis, alguns são bons e outros são regeneradores maus regeneradores. Esses neurônios podem ser mais facilmente identificados em preparações wholemount SNC. A fim de compreender os mecanismos neuronais intrínsecos que favorecem ou inibem a regeneração do axônio após a lesão nos vertebrados do SNC, podemos determinar diferenças na expressão gênica entre os bons e maus regeneradores, e como expressão é influenciada pela medula transecção espinhal. Este artigo ilustra as técnicas para larval habitação e lampreias marinhas adultas recentemente transformados em tanques de água, produzindo completos transecções da medula espinhal sob visão microscópica, e preparando brain e wholemounts da medula espinhal para hibridização in situ. Resumidamente, os animais são mantidos em 16 ° C e anestesiados em 1% benzocaína na lampreia Ringer. A medula espinal é seccionado com tesoura iridectomia através de uma abordagem dorsal e o animal é deixado recuperar em tanques de água a 23 ° C. Para a hibridização in situ, os animais são reanesthetized e o cérebro e medula removido por meio de uma abordagem dorsal.
Introduction
Nos mamíferos lesão medular (LM) é uma condição devastadora que leva à perda permanente da função abaixo do local da lesão, porque os axônios lesionados não se regeneram através da zona de trauma e se reconectar com suas metas adequadas. Em contraste com os mamíferos, lampreia recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinal. Uma forma interessante, a lampreia tem um conjunto de 36 projectando neurónios da medula espinal que são identificáveis individualmente em conjunto de montagem em preparações de cérebro devido ao seu grande tamanho 2,3 (Figura 1) . Todos esses neurônios espinhais de projeção são axotomizados por um alto nível de transecção completa da medula espinhal. Estudos anteriores de nosso grupo e outros mostraram que, mesmo na presença de recuperação funcional após SCI alguns destes neurónios mostram uma muito baixa capacidade de regeneração (que são considerados "maus regeneradores"), enquanto outros geralmente regenerar seu axónio através do local da lesão (que são consideradas de "gregeneradores ood "). 2,3 Esta característica faz com que as lampreias um modelo vertebrado interessante estudar as diferenças na expressão gênica entre o bem eo mal regenerador neurônios espinhais-projetando que por sua vez levará para as diferenças na capacidade de regeneração intrínseca dos neurônios que tentar regenerar seus axônios no mesmo ambiente extrínseca. 1
Usando esse modelo, já haviam demonstrado que a medula de projeção neurônios com baixa capacidade regenerativa show de expressão de receptores de moléculas orientação axonal como UNC5 4,5 e neogenin 6, que medeiam a ação inibitória da netrin e RGM respectivamente. Além disso, utilizando este método nosso grupo também mostrou que apenas as boas regeneradores mostram uma recuperação da expressão de neurofilamentos após o ferimento e durante o processo de regeneração. Recentemente, Busch e Morgan 7 por imunofluorescência demonstraram que os regeneradores maus mostrará um increased expressão de sinucleína após a lesão, o que tem sido relacionado pelos autores para o fato de que o "mau regenerador" neurônios espinhais-projetando morrer lentamente após um completo medula espinhal transection 5,7,8. Assim, o modelo de lampreia de uma lesão completa da medula espinhal tem emergido como um modelo muito útil para entender o que faz um cordão espinhal neurônio projetando um "mau regenerador" após axotomia.
Para realizar os estudos que estão executando um protocolo completo cirurgia espinal medula transecção e uma dissecção cerebral posterior nos pontos de tempo desejado após a lesão para realizar wholemount hibridação in situ. No presente artigo metodológico apresentamos um protocolo detalhado para o bom desempenho de uma medula cirurgia completa lesão da medula em lampreias larvais, a posterior manutenção dos animais ea dissecação cerebral final e preparação do cérebro para uma wholemount hibridização in situ. Um protocolo detalhado para perform o wholemount hibridização in situ no cérebro de lampreias larvais foi relatada anteriormente. 9 Além disso, o protocolo de lesão medular e dissecação do cérebro pode ser usado também para, em seguida, processar os cérebros para imuno-histoquímica ou outros métodos histológicos.
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Protocol
Ver Tabela 1 para todos os materiais utilizados neste protocolo.
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade de Temple.
1. Os animais
- Obter tipo selvagem lampreias marinhas larvais (Petromyzon marinus L.), 10-14 cm de comprimento (4-7 anos) dos córregos que alimentam o Lago Michigan, a partir de afluentes do rio Delaware (Pensilvânia) ou córregos em Maine.
- No laboratório, a manter as larvas em grupos de 50 - 100 animais em tanques de água doce de 50 galões a 16 ° C. Linha de tanques com uma polegada de cascalho para as larvas de toca, e que a água é filtrada e carvão condicionado com pedras de ar por pelo menos 48 horas para remover o cloro e outras impurezas antes de colocar as lampreias neles. Não há necessidade de alimentar os animais, que reciclam seus próprios detritos, até o dia de uso.
2. completa SpinalCord transecção
- Antes da cirurgia da espinal medula preparar uma solução lampreia Ringer com a seguinte composição: NaCl 110 mM, KCl 2,1 mM, 2,6 mM de CaCl 2, 1,8 mM MgCl 2 e 10 mM de tampão Tris; pH 7,4.
- Para realizar a transecção da medula espinhal, coloque as larvas em um pequeno recipiente a ser anestesiada com 1% de metano tricaina em solução Ringer gelada.
- Uma vez anestesiados lugar os animais em uma placa de Petri com meio cheio Sylgard (de silicone) e quatro pinos de utilizar insectos (0,15 mm de diâmetro) para manter os animais em posição para a operação (um é colocado no focinho do animal, um na cauda e dois no nível de 5 º guelras). Encha o prato de petri quase até o topo com uma solução de Ringer. Coloque o prato com a larva no gelo durante a realização da cirurgia sob o microscópio estereoscópico.
- Para realizar a transecção da medula espinal dorsal, mediano, fazer uma incisão longitudinal com um bisturi (# 11) ao nível de 5 ºbranquial para visualizar a medula espinhal. Inicialmente, a pele é aberta por inserção da ponta da lâmina do bisturi voltada para cima e, em seguida, o tecido muscular é cortado muito suavemente até que a coluna vertebral pode ser visto a partir de cima. Moda dois ganchos dos pinos de insetos e usá-los para segurar as paredes do corpo aberta durante a realização da transecção da medula espinhal.
- Completamente transecção da medula espinal ao nível da 5 ª guelras por meio de um par de tesouras (Castroviejo # 8), inserir as tesouras perpendicularmente para a medula espinhal. A medula espinhal tem de ser completamente cortado transversalmente com um corte limpo. Visualizar a medula espinhal extremidades cortadas ao microscópio estereoscópico para confirmar que a espinal medula foi completamente cortado transversalmente. Em seguida, realinhar as extremidades cortadas da medula espinal após a transecção usando um par de pinças (5).
- Depois de realizar a transecção da medula espinal fechar a ferida na parede dorsal do corpo com um par de pinças finas e colocado as larvas em gelo durante 1 h para permitir que a ferida to secar. Coloque um pedaço de papel de filtro entre o gelo e as larvas e mergulhe-o com uma solução de Ringer lampreia. A baixa temperatura mantém os animais vivos ao mesmo tempo que permite que a ferida se secar ao ar e, portanto, ajudar a evitar infecções.
- Em seguida, transferir as larvas para pequenos tanques (1 larva por tanque) com água gelada por 24 horas.
- Examinar o lesionado larvas 1 dia após a transecção espinal para comportamentalmente confirmar que não há movimento caudal ao local da lesão. A transecção da medula espinal é considerada completa se a larva possa mover apenas a sua cabeça rostral para o local da lesão (ao nível dos 5 th guelras). Se este for o caso, as larvas podem ser agora transferidos para tanques (1 larva por tanque) com água doce, à temperatura ambiente (23 ° C) para permitir a sua recuperação para os pontos de tempo seleccionados.
- Durante o período de recuperação de mudar a água a cada 2 a 3 dias.
3. Cérebro Dissecção e Preparação deo cérebro por meio de hibridação in situ
- Nos momentos desejados após a lesão re-anestesiar as lampreias marinhas das larvas e lugar e fixá-los na placa de Petri com solução de Ringer para realizar a dissecação do cérebro como acima.
- Para dissecar o cérebro, em primeiro lugar fazer uma incisão transversal com o bisturi entre a narina eo órgão pineal. A partir daqui, começa a cortar o tecido que envolve o cérebro, utilizando um par de tesouras Castroviejo, mantendo-a com uma pinça.
- Uma vez que o cérebro está exposto, remover o plexo coróide, utilizando um par de pinças e utilizar os ganchos para espalhar a cabeça do animal, e expor os nervos cranianos. Em seguida, corte a forma transversal da medula espinhal com a tesoura Castroviejo. Segurar a medula espinal com um par de pinças, enquanto usando outro par de fórceps para cortar os nervos cranianos a dissecar o cérebro.
- Após a dissecção, colocar o cérebro em um pequeno pedaço de silicone e mantenha-o em posição inserindo dois insect pinos no bulbos olfativos 1 e na medula espinal. Em seguida, corte a parte posterior e comissuras cerebrotectal do cérebro ao longo da linha média dorsal com a tesoura e desviar as placas alar lateralmente e fixá-los plana para o silicone com 4 pinos de insetos (Figura 2).
- Transferir o pedaço de silicone com o cérebro de um tubo contendo 4% de paraformaldeído em tampão fosfato salino (pH 7,4) para ser fixada em temparature ambiente durante 3 horas num rotor.
- Após a fixação usar o cérebro para wholemount hibridação in situ tal como descrito anteriormente (Swain et al., 1994). Os cérebros de animais de controlo ou sham operado deve ser executado sempre em paralelo com os cérebros de animais lesionados. O cérebro de larvas wholemounted pode ser estudada por hibridação in situ devido à sua forma plana e fina, e também devido à ausência de mielina 10, o que faz com que o cérebro relativamente translúcido.
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Representative Results
Como um exemplo dos resultados que podem ser obtidos quando se usa este método, as imagens representativas dos cérebros wholemounted que mostram a expressão dos transcritos neogenin em neurónios projectam-medulares identificáveis de controlo e 2 semanas após a lesão a lampreia mar larvas são mostrados na Figura 2. Os leitores são referidos num estudo anterior 6 relatando a relação entre a expressão de neogenin após uma transecção medular completa ea capacidade de regeneração da medula espinhal identificável projetando neurônios da lampreia do mar para obter mais detalhes. Resumidamente, os resultados mostraram que após a lesão há mudanças na expressão do receptor neogenin em identificáveis neurônios espinhais de projeção. Duas semanas após a transecção da medula espinal completo do receptor neogenin é preferencialmente expressa em más regeneradores, como os M1, I1, I2, I4, ou neurónios Mth (ver Figura 2B) Estes resultados demonstram o resultadodo protocolo e sugerem que o receptor neogenin poderiam estar envolvidos na falha da regeneração destas células.
Figura 1: Desenho esquemático de uma visão dorsal do cérebro lampreia do mar mostrando a localização de neurônios reticulospinais identificáveis. Reproduzido do Barreiro-Iglesias e Shifman. 5 Para as abreviaturas, veja a lista abaixo.
Figura 2. Fotomicrografias de vista dorsal da madura larval lampreia mar cérebro que apresentam a expressão do transcrito em neogenin controlo (A) e 2 semanas após a lesão (B) animais. Nota em B que, após a lesão do neogenin transcrição é preferencialmente expresso em neurônios conhecidos por serem regeneradores ruins (por exemplo, M1, I1, I2, I4 e neurônios MTH). Além disso, notar a presença dos orifícios deixados pelos pinos utilizados para segurar as cerebrais (setas). Os leitores são encaminhados para o estudo prévio de Shifman e colegas de trabalho. 6 Para as abreviaturas, veja a lista abaixo.
SIGLAS
| B (B1-B6) | Células de Müller da região bulbar (meio núcleo reticular rhombencephalic) |
| hab.-ped. tr. | trato habenulopeduncular |
| I1-I6 | Células de Müller da região ístmica |
| EuX | núcleo motor glossofaríngeo |
| inf. | infundibulum |
| ISTH. retic. | formação reticular isthmic |
| M1-M4 | Células de Müller 1-4 |
| Mth | Célula Mauthner |
| MTH | célula auxiliar Mauthner |
| smi | medianus sulco inferior |
| Vm | núcleo motor do trigêmeo |
| X | núcleo motor vagal |
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para executar uma transecção medular completa e dissecção cerebral posterior em lampreias marinhas larvais. Este procedimento permite que as diferenças de análise da expressão gênica entre medula espinhal identificável salientes neurônios após a lesão medular por meio de um cérebro inteiro de montagem de hibridização in situ. O passo crítico no processo é o correcto desempenho de uma completa transecção da medula espinal, o que pode ser controlado através da observação das extremidades cortadas da medula espinal sob a stereomicrocope e 24 horas mais tarde confirmado por tocar suavemente o focinho da larva com um par de fórceps para ver se há qualquer movimento de caudal do local da lesão. Também é importante para a recuperação do animal que a tesoura utilizados para a cirurgia não são sem corte e que um único corte limpo e é feito a transecção completamente a medula espinhal.
A sobrevivência dos animais após a lesão é altamente melhorada, mantendo o animals sobre gelo durante a cirurgia e durante a hora usado para permitir que a ferida se secar ao ar e depois em água gelada para o primeiro 24 hr. Após este período, a ferida é fechada e os animais já podem ser transferidos para tanques de água doce, à temperatura ambiente.
Lampreias larval são permitidos para recuperar a temperatura ambiente e não em sua temperatura fria habitual, porque a grande maioria dos animais recuperar a função do comportamento locomotor completo após a lesão em temperaturas mais altas. 11 A recuperação de um padrão normal de locomoção é observado 8 a 10 semanas após a transecção da medula espinal completa.
Depois de realizar a transecção da medula espinal e do esvaziamento completo do cérebro nos pontos de tempo seleccionados os cérebros larvas podem ser processados, não só para realizar um conjunto de montagem de hibridação in situ conforme mostrado (Figura 2), mas também por outros métodos histológicos (tais como imuno-histoquímica por exemplo, 7 (por exemplo, 8) ou a detecção de caspases activadas usando inibidores de caspases fluorocromo marcado 5.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
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- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
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- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
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