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Imagem não invasivo e Análise de Isquemia Cerebral em Ratos de Vida Usando Positron Emission Tomography com Published: December 28, 2014 doi: 10.3791/51495
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 4, 1,2, 3,4,5
1W. M. Keck Center for Transgene Research, University of Notre Dame, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 3Notre Dame Integrated Imaging Facility, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame

Abstract

O AVC é a terceira principal causa de morte entre os americanos de 65 anos ou mais de idade 1. A qualidade de vida dos pacientes que sofrem de um acidente vascular cerebral não consegue voltar ao normal na grande maioria dos pacientes 2, que é principalmente devido à atual falta de tratamento clínico para o AVC agudo. Isto exige a compreensão dos efeitos fisiológicos de isquemia cerebral em tecido cerebral ao longo do tempo e é uma importante área de pesquisa ativa. Para este fim, o progresso experimental foi feito com ratos como modelo pré-clínico de acidente vascular cerebral, particularmente, através de métodos não-invasivos, como 18 F-fluorodeoxyglucose (FDG), juntamente com Positron Emission Tomography (PET) 3,10,17. Aqui apresenta-se uma estratégia para induzir isquemia cerebral em ratos por oclusão da artéria cerebral média (MCAO) que imita isquemia cerebral focal em seres humanos, e imagiologia seus efeitos ao longo de 24 h utilizando FDG-PET acoplado com tomografia computorizada de raios X (CT) com um Albira PInstrumento ET-CT. A voi atlas modelo foi posteriormente fundida com os dados de ratos cerebrais para permitir uma análise imparcial da suas sub-regiões do cérebro e 4. Além disso, um método para a visualização 3D da evolução no tempo de FDG-PET-CT é apresentado. Em resumo, nós apresentamos um protocolo detalhado para iniciar, quantificar e visualizar um evento induzido derrame isquêmico em ratos Sprague-Dawley vivendo em três dimensões usando FDG-PET.

Introduction

O AVC é uma das principais causas de morte nos países desenvolvidos, e é diretamente responsável pela morte de 1 em cada 19 americanos 1. Estima-se que cerca de 795.000 americanos experimentam AVC a cada ano, dos quais 87% são de natureza isquêmica 5. Durante um evento isquémico, fornecimento contínuo de oxigénio e glicose para os neurónios corticais esteja gravemente comprometida induzir um ambiente hipóxico, que leva à diminuição da função celular nas regiões do cérebro afectadas. Dependendo da gravidade do acidente vascular cerebral, o fluxo sanguíneo cerebral e a absorção de glicose varia espacialmente e temporalmente.

Os danos causados ​​por acidente vascular cerebral podem ser identificadas através de métodos não-invasivos, como a 18 F-fluorodeoxyglucose (FDG) Positron Emission Tomography 6. FDG é um análogo da glicose em que o grupo hidroxilo na posição 2 'foi substituído pelo emissor de positrões isótopo 18F. 18F é advantageous devido à sua, meia-vida longa 110 minutos, permitindo que seja usada para detectar o consumo de glucose no cérebro. FDG PET produz um mapa de alta resolução quantitativa do consumo desoxiglucose no interior do cérebro como 18 F 7 tende a acumular-se nas regiões de consumo de glicose, indicando que tais tecidos são altamente activos metabolicamente 8. A 18 F núcleo sofre decaimento beta, liberando um pósitron, que aniquila rapidamente com um elétron nas proximidades, produzindo raios gama, que são detectadas pelo instrumento. Scans FDG PET pode ser repetido no mesmo indivíduo com pelo menos 10 18 F meias-vidas, ou cerca de 18 horas, entre scans, proporcionando, assim, uma forma de estudar mudanças na atividade cerebral ao longo do tempo em um mesmo indivíduo.

Modelos animais pré-clínicos, tais como ratos, são frequentemente utilizados para avaliar os efeitos de derrames e da eficácia dos tratamentos para o AVC. Dado que a FDG PET é não-invasiva, que pode ser usado para mediros efeitos de derrame ao longo do tempo, sem perturbar a fisiologia do animal. Dependendo do local do evento acidente vascular cerebral, diferentes regiões do cérebro pode ser afectada. No entanto, com pequenos animais tais como ratos, definir manualmente e quantificar a atividade em regiões específicas do cérebro de ratos pode ser um desafio. A fim de comparar a actividade metabólica de glucose em regiões específicas do cérebro de rato ao longo do tempo, os volumes de interesse (ISV) para ser quantificado deve ser consistentemente delineados. Um atlas precisas do cérebro de rato foi desenvolvida para aliviar este problema 9, e foi convertida para a forma digital para uso na quantificação dos dados FDG-PET pré-clínicos. Aqui apresentamos um método para classificar os danos nos tecidos do curso em uma forma metódica consistente. O método detalha o procedimento cirúrgico para iniciar isquemia cerebral em um modelo animal, quantificando cérebro sub-regiões específicas afectadas por acidente vascular cerebral, e produzir uma visualização tridimensional da extensão e localização do AVCdanos do tecido, utilizando as técnicas e ferramentas apropriadas. Usando a metodologia descrita no presente estudo, os investigadores podem iniciar de forma consistente isquemia cerebral em ratos, realizar imagiologia de PET, e quantificar as alterações na FDG regiões do cérebro utilizando definidos em modelos pré-clínicos de AVC ao longo do tempo.

Protocol

Manejo dos animais e todas as experiências com eles foram rigorosamente realizados de acordo com protocolos que foram aprovadas pelo cuidado e uso de animais Comitê Institucional da Universidade de Notre Dame (protocolo número 14-086).

1. Animais

  1. Animais e curso de iniciação: Use macho Sprague Dawley ratos com peso entre 220 e 270 g para todos os estudos de traçado.
  2. Anestesiar ratos com 2,5% de isofluorano (2 L / min em 100% de O 2) usando um cone de nariz.
  3. Colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento. Tape para baixo das pernas dianteiras.
  4. Shave ventralsurface do pescoço. Prep a área rapada com 70% de EtOH, seguido por solução de iodo a 10% providona.
  5. Instrumentos estéreis são utilizados para este procedimento; luvas são substituídos depois da preparação do animal. São empregadas técnicas de ponta estéril.
  6. Com uma tesoura, faça um 2-2,5 cm incisão paralela à traqueia, 0,5 cm à direita da traqueia. Usando dissectio contuson localizar a artéria carótida.
  7. Use afastadores para ajudar a visualizar o recipiente. Coloque um grampo micro na artéria carótida comum (ACC).
  8. Localize o primeiro ponto de ramificação que será a artéria carótida externa (ECA) e da artéria carótida interna (ACI). Cauterizar pequenos ramos ligados ao ECA, como a artéria occipital.
  9. Ligadura da ECA perto do ramo da artéria tireóide com uma sutura de seda 4-0. As suturas devem ter comprimento extra para permitir hemostats para realizar a sutura.
  10. Cauterizar o ECA acima da sutura (cranial). Para prender a sutura com os hemostats, puxe o ECA caudal e será paralelo com o CCA.
  11. Localize o ICA e usar outra braçadeira micro para ocluir esta artéria.
  12. Faça um pequeno furo no ECA usando uma tesoura pequena mola. Insira a prótese no ECA e amarrar uma sutura em torno da prótese para impedir o fluxo de sangue.
  13. Retire o grampo micro no ICA e fazer avançar a prótese até sentir resistência.
    NOTA Certifique-se os avanços de oclusão para o ICA e não a artéria pterygopalatin. A prótese deve avançar de forma harmoniosa e a ponta branca não deve ser visto, se a prótese é colocada corretamente.
  14. Retire o grampo micro do CCA. Cortar qualquer oclusor excesso ou sutura.
  15. Coloque 9 milímetros Auto Clips para fechar a incisão na pele.
  16. Retirar o animal de anestesia e permitem animais para despertar. Depois de 2 horas:
    1. Anestesiar rato com isoflurano.
    2. Retire os agrafos.
    3. Localizar o fim do oclusor e removê-la a partir da artéria cerebral média, puxando suavemente sobre ela até que a ponta branca do oclusor entra em contacto com as suturas. Não puxe-o todo o caminho, isso irá causar sangramento.
    4. Substitua os agrafos à incisão.
    5. Retirar o animal de anestesia e permitem animais para despertar.

2. Aquisição de Imagem

Realize três PET e CT slatas para cada rato. Tome um pré digitalização 1-2 dias antes de induzir a acidente vascular cerebral, para fornecer uma linha de base para 18 F-FDG. Digitalizar cada rato 1,5 horas após o curso, antes da reperfusão é realizada (imagem com oclusor ainda no animal). Digitalizar cada rato 26 horas pós acidente vascular cerebral (24 horas após reperfusão) para quantificar os danos tecido cerebral devido a uma lesão acidente vascular cerebral.
NOTA: O ponto de tempo 24 horas mencionado no resto do manuscrito refere-se ao tempo pós-reperfusão, quando os ratos foram verificados.

  1. Anestesiar ratos sob 2,5% de gás isoflurano em câmara de anestesia.
  2. Injectar aproximadamente 500 uCi de 18 F-desoxiglucose (FDG) (volume total de 200 ul) na veia da cauda de rato.
  3. Esperar 1 hora.
  4. Coloque rato anestesiado na cama rato standard, sob anestesia isoflurano nariz cone. Meça a distância em mm entre o nariz de rato e borda da cama rato para deslocamento horizontal.

3. Aquisição de Imagem

  1. Abrir Albira Suíte software.
  2. Selecione Adquirente.
  3. Nome novo estudo.
  4. Sob PET ou SPECT clique em Adicionar> Selecionar protocolo PET. Clique em Adicionar.
  5. Sob CT clique em Adicionar> Selecionar protocolo CT. Clique em Adicionar.
  6. Clique sob número inicial Posição Horizontal sob PET. Defina o número de distância medida em mm entre o nariz do rato e da frente da cama de rato. Repita o procedimento para CT.
  7. Definir Sujeito a Rat e inserir o peso em gramas.
  8. Jogo Composto de FDG.
  9. Definir Tempo de injeção e injeção Data e Dose.
  10. Clique no botão Iniciar Study.
    NOTA: Após a conclusão do PET TC, os dados serão salvos automaticamente.
  11. Abra Albira Reconstrutor.
  12. Change Pendente para durar 10 ou All.
  13. Escolha um nome de arquivo de digitalização.
  14. Clique em Adicionar.
  15. Clique em Iniciar Reconstrução. NOTA: O arquivo será salvo no formato MicroPET.

Análise 4. Imagem

  1. Executar análise de imagem utilizando o software de análise de PMOD em conjunto com o W. Schiffer Atlas Cerebral.
    1. Abrir PMOD> Fusão.
    2. Navegue até a guia coregistration Preprocessing na parte superior da tela.
    3. Abra o menu drop-down carga de referência no centro da tela e selecione NIfTI. Navegue até C: //PMOD3.2/resources/templates/usertemplates. Selecione Rat (W.Schiffer) -FDG.nii e clique em Abrir.
    4. Abra o menu drop-down carga de entrada à direita da tela e selecione MicroPET. Navegue até o desejadoArquivo MicroPET. Selecione-o e clique em Abrir.
    5. Navegue até a guia coregistration manual na parte superior da tela.
    6. Selecione a quarta página no grupo do meio de guias da direita (Reslicing).
      NOTA: Dois botões aparecerão nas scans MicroPET.
    7. Utilize o retângulo branco aberto para rodar os scans MicroPET e do retângulo branco preenchido para mover os scans MicroPET. Alinhe os dois scans. Para fazer isso, localizar pontos de referência como as glândulas Harderiana e superior e características cerebrais traseiros que podem ser usados ​​para combinar a digitalização MicroPET com o modelo do cérebro. Em seguida, ajuste a digitalização MicroPET até que combina com o atlas do cérebro (W. Schiffer).
      NOTA: Por exemplo, as glândulas Harderiana parecem brilhantes em ambos os exames MicroPET e o atlas do cérebro (W.) Schiffer, e pode ser usado como uma referência para o alinhamento.
    8. Se necessário, gire o MicroPET digitalizar 180 ° no plano coronal e aumentar a digitalização de forma significativa em the vista sagital, junto com outras mudanças de orientação menores.
    9. Navegue até a guia de Fusão Full Screen (VOIs) no topo da tela.
    10. Selecione Source A no canto superior direito da tela.
    11. Navegue até Modelo> Atlas, na parte inferior da página.
    12. Selecione Rat (W. Schiffer) a partir do menu drop-down.
      NOTA: (Opcional) Volte ao separador coregistration manual onde os atlas deve aparecem sobrepostos no atlas do cérebro (W. Schiffer). Os Atlas pode ser usado para ajudar a alinhar a verificação MicroPET e o atlas do cérebro (W. Schiffer). Após o alinhamento, retornar à guia Fusão Full Screen (VOIs). A modelo aparece no cérebro, indicando que seções do cérebro serão medidos para os VIO Statistics.
    13. Selecione Fonte B no canto superior direito da tela.
    14. Selecione o botão VOI Statistics no topo right da tela.
      NOTA: A planilha será exibida.
    15. Selecione Salvar.
      NOTA: A Write Como [VOI Statistics] janela irá aparecer.
    16. Selecione Salvar para File System.
      NOTA: A PMOD (guardar): escolha componentes janela irá aparecer.
    17. No campo Nome do arquivo, digite o nome do arquivo desejado.
    18. Selecione Salvar.
  2. Realizar análise de dados usando o Microsoft Office Excel 2010.
    1. Abra o Excel.
    2. Selecione File> Open.
    3. Alterar o tipo de arquivo de todos os arquivos Excel para todos os arquivos.
    4. Navegue para os arquivos VIOSTAT salvos. Selecione o arquivo desejado.
      Nota: Um assistente de importação aparecerá.
    5. Selecione Concluir. Se estiver usando um Mac, clique duas vezes no arquivo VOISTAT e vai abrir diretamente como um arquivo Excel.
    6. Selecione a coluna que contém o VoiName campo (Região). Copie as informações e colá-lo em um novo arquivo Excel.
    7. Selecione a coluna que contém os campos calculados e [1/1]. Copie as informações e colá-lo para o novo arquivo Excel.
    8. Repita esse processo para todos os arquivos VOISTAT.
    9. Comece uma nova guia para cada conjunto de dados.
    10. Voltar para a primeira guia. Selecione uma nova célula. Calcula-se a razão entre o lado direito de uma secção do cérebro para o lado esquerdo de uma secção de cérebro dividindo o valor do lado direito do cérebro, pelo lado esquerdo do cérebro. A secção de cérebro pertencente ao lado direito do cérebro está listada antes da secção pertencente ao lado esquerdo do cérebro. Repita esse procedimento para todas as seções do cérebro.
    11. Selecione uma nova célula. Utilizar a função MÉDIA para calcular a média de cada uma das proporções previamente calculadas em todos os ratinhos.
    12. Selecione uma nova célula. Calcule a SEM de cada seção do cérebro, usando a função STDEV e dividindo iT pela raiz quadrada do número de ratos.
    13. Repita esse procedimento para cada conjunto de dados.

Visualization 5. Imagem

  1. Converter imagens para o formato analisar arquivo usando o software de análise PMOD.
    1. Abrir PMOD> View.
    2. Navegue até a guia Exibir na parte superior da tela.
    3. Abra o menu drop-down de carga no lado direito da tela e selecione MicroPET. Navegue até o MicroPET desejado ou arquivo CT. Selecione-o e pressione Abrir.
    4. Abra o menu drop-down Salvar no canto direito da tela e selecione Analisar. Navegue até o destino desejado. Digite o nome desejado no campo Nome do arquivo. Selecione Salvar.
  2. Criar sequências de imagens, utilizando software de imagem VolView.
    1. Abrir VolView.
    2. Selecione Open File
    3. Navegue até a versão analisar o arquivo de dados de CT para a digitalização desejado. Selecione-o e pressione Abrir.
      Nota: Um Assistente Open File aparece.
    4. Use as configurações padrão pressionando Avançar na janela pop-up.
    5. Selecione a guia Plugins no lado esquerdo da tela.
    6. Abra o menu Plugin drop-down e selecione Utilitário> Mesclar Volumes.
    7. Desmarque a opção Componentes Rescale.
    8. Seleccione Atribuir Segunda Entrada.
    9. Navegue até a versão analisar do arquivo de dados MicroPET para o mesmo exame. Selecione-o e pressione Abrir.
      Nota: Um Assistente Open File aparece.
    10. Use as configurações padrão pressionando Avançar em cada tela.
      NOTA: A varredura MicroPET aparece sobreposto na tomografia computadorizada.
    11. Selecione a configuração de cor / opacidades guia na parte esquerda do ecrã.
    12. Abra o menu drop-down de componentes na parte inferior direita da tela. Selecione 1.
      NOTA: Isto irá assegurar que a tomografia computadorizada é a única imagem afetada pelos seguintes direções.
    13. Na seção Scalar Mapeamento de cores, selecione o ponto médio. Remova-o, arrastando-o para fora da área de controle deslizante.
    14. Selecione o ponto de esquerda.
      NOTA: A janela Color Picker aparecerá.
    15. Mude a cor do ponto de preto.
    16. Selecione o ponto certo.
      NOTA: A janela Color Picker aparecerá.
    17. Mude a cor do ponto de branco.
    18. Na seção Scalar Opacidade Mapping, adicionar um ponto clicando em qualquer lugar na caixa.
    19. Ajustar a secção até que a imagem CT exibe apenas o esqueleto do rato.
    20. Selecione Ativar o sombreamento.
    21. Selecione a Review guia do lado esquerdo do ecrã.
    22. Alterar número de quadros a 72.
    23. Alterar X rotação a 360.
    24. Selecione Criar.
    25. Navegue até o destino desejado. Crie uma nova pasta para armazenar as imagens com um clique direito no espaço vazio e selecione Novo> Pasta.
    26. Digite o nome desejado no campo Nome do arquivo. Selecione Salvar.
      NOTA: A janela Frame Size aparece.
    27. Selecione OK.
    28. Volview vai gerar as imagens. Quando ele for concluído, será exibida uma janela dizendo "Seu filme foi criado com sucesso!" Escolha OK.
    29. Retornar à guia Configurações de cor / opacidade.
    30. Em Componente Peso (s), ajuste o controle deslizante para o componente 1 para que ele tenha o value de 0.
      NOTA: Somente a digitalização MicroPET aparecerá.
    31. Repita os passos 5.2.21-28 para criar uma segunda sequência de imagens.
    32. Retornar à guia Configurações de cor / opacidade.
    33. Em Componente Peso (s), ajuste o controle deslizante para o componente 2 por isso tem o valor de 0.
      NOTA: Somente a tomografia computadorizada aparecerá.
    34. Repita os passos 5.2.21-28 para criar uma terceira sequência de imagens.
  3. Gerar filmes de rotação (mostrado no vídeo), utilizando o software ImageJ.
    1. Abrir ImageJ.
    2. Selecione Arquivo> Importar> Sequência de Imagens.
    3. Navegue até o arquivo que contém as imagens que vêem apenas os dados de CT para o exame de pré. Selecione a primeira imagem e pressione Selecionar.
      NOTA: A janela Opções de seqüência aparece.
    4. Selecione OK.
    5. Selecione Arquivo &# 62; Importar> Sequência de Imagens.
    6. Navegue até o arquivo que contém as imagens que vêem apenas os dados MicroPET para o exame de pré. Selecione a primeira imagem e pressione Selecionar.
      NOTA: A janela Opções de seqüência aparece.
    7. Selecione OK.
    8. Selecione Arquivo> Importar> Sequência de Imagens.
    9. Navegue até o arquivo que contém as imagens que vêem tanto os dados de CT e MicroPET para o exame de pré. Selecione a primeira imagem e pressione Selecionar.
      NOTA: A janela Opções de seqüência aparece.
    10. Selecione OK.
    11. Selecione Imagem> Pilhas> Ferramentas> Combine.
      NOTA: A janela Combiner aparecerá.
    12. Selecione o menu drop-down stack1. Selecione a pilha que contém os dados do CT.
    13. Selecione o menu drop-down stack2. Escolher a pilha que contém o Midados croPET. Selecione OK.
      NOTA: uma nova pilha com as duas varreduras aparecerá.
    14. Selecione Imagem> Pilhas> Ferramentas> Combine.
      NOTA: A janela Combiner aparecerá.
    15. Selecione o menu drop-down stack1. Selecione a pilha que contém os stacks combinados.
    16. Selecione o menu drop-down stack2. Selecione a pilha que contém os dados de CT e os dados MicroPET. Selecione OK.
      NOTA: uma nova pilha com todos os três scans aparecerá.
    17. Mantenha as pilhas combinadas aberto. Repita os passos 5.3.2-16 para o pilar de digitalização 1,5 hr e as pilhas pós 24 hr de digitalização de imagem.
    18. Selecione Imagem> Pilhas> Ferramentas> Combine.
      NOTA: A janela Combiner aparecerá.
    19. Selecione o menu drop-down stack1. Selecione a pilha que contém todos os dados de exame de pré.
    20. Selecione o stack2
    21. Verifique Combine verticalmente.
    22. Selecione OK.
      NOTA: A nova pilha tanto com o exame de pré e 1,5 horas após varredura irá aparecer.
    23. Selecione Imagem> Pilhas> Ferramentas> Combine.
      NOTA: A janela Combiner aparecerá.
    24. Selecione o menu drop-down stack1. Selecione a pilha que contém os stacks combinados.
    25. Selecione o menu drop-down stack2. Selecione a pilha que contém todos os dados pós 24 hr de digitalização.
    26. Verifique Combine verticalmente.
    27. Selecione OK.
      NOTA: uma nova pilha com todos os nove scans aparecerá.
    28. Selecione Arquivo> Salvar como> AVI.
    29. Selecione OK.
    30. Navegue até o destino desejado. Digite o nome desejado para o File Name Salvar.

Representative Results

A isquemia cerebral foi iniciado em ratos Sprague-Dawley machos ao vivo através de oclusão da artéria cerebral média, com imagiologia nuclear subsequente realizada para detectar os seus efeitos. Ratos vivos foram fotografadas 24 horas antes da indução da acidente vascular cerebral, bem como de 1,5 horas e 24 horas pós isquémia, cada um com injecções independentes de aproximadamente 500 uCi de 18F-FDG que se decompor completamente dentro de 18 horas. O sistema de anel Albira três detector utilizado para estes estudos tem uma sensibilidade de 9%, fazendo com 500 uCi de uma dose razoável, para os ratos. Dados de imagem representativos para PET e de raios-X TC são mostradas para um rato no pré-24 horas e 24 horas pontos no tempo pós-reperfusão na Figura 1, linhas superior e inferior, respectivamente. O transversais (painéis A e E), sagital (painéis B e F) e coronal (painéis C e G) fatias para cada varredura são apresentados com dados FDG-PET coloridas em um & #8220; arco-íris "escala de intensidade, e coberto no CT em escala de cinzentos. Note-se que CT foi utilizado para anatômica co-registo dos dados PET dentro do crânio animal, e nenhuma alteração radiodensidade no tecido cerebral foram anotados durante estas experiências. Às 24 h, houve um declínio dramático na captação de glicose para o hemisfério ipsilateral, sugerindo dano tecidual generalizada devido ao acidente vascular cerebral isquêmico induzido. A renderização em 3D dos dados de sobreposição é apresentado na Figura 1D e H. Quando rodado na tela, esses dados tornados proporcionar uma visualização melhorada da diminuição induzida por AVC em FDG.

Para quantificar as alterações na absorção de glicose cerebral devido a acidente vascular cerebral de forma espaço-temporal, um atlas do cérebro VOI foi aplicado ao pré-curso de base, 1,5 hr e 24 hr (pós-reperfusão) para cada exame. Isto foi realizado utilizando o pacote de software PMOD em conjunto com o W. Schiffer modelo de cérebro de rato e atlas. Primeiro, PMOD foi usada para transformar cada um dos conjuntos de dados de cérebro de rato PET para o espaço adequado e geometria via manual do co-registo usando o Move e ferramentas girar sob a guia Reslicing. Note-se que a ferramenta de escala também está disponível para ajustar o tamanho total do cérebro, se necessário. Enquanto o uso do atlas Schiffer é superior ao desenho VOIs manualmente dentro do espaço do cérebro, pode haver erro experimental induzida a partir de fusão de cérebro impreciso. Assim, em alguns casos, pode ser necessário um aumento do número de animais para alcançar significância estatística. Em seguida, o atlas do cérebro W. Schiffer VOI foi automaticamente aplicado para medir a acumulação de FDG, em unidades padrão de absorção, dentro do sub-regiões definidas do cérebro do rato (Figura 2). Os atlas cerebral VOI também pode ser utilizado de forma iterativa com o modelo do cérebro padrão para optimizar ainda mais a fusão manual dos dados experimentais. Como o evento Stoke foi isolado para o hemisfério cerebral direito, em cada animal, o dano to cada região foi quantificada por cálculo de uma razão de actividade de captação de glicose entre as regiões contralateral (Figura 2). A utilização destes rácios fornece uma normalização conveniente entre o certo eo hemisfério esquerdo, e remove variabilidade que pode ser encontrado na comparação entre valores de intensidade de sinal de PET em diferentes scans. A 1,5 hr pós-AVC, 18 absorções F-FDG não foram afetados na área isquêmica. Portanto, não há alterações quantitativas foram observados na absorção de glucose entre os hemisférios ipsilateral e contralateral (Figura 3, barras azuis e verdes). Isto poderia ser devido a hiper-absorção de glicose pela região peri-isquémico ou aumento do metabolismo da glicose neste ponto de tempo para compensar a perda de ATP celular 10,11. No entanto, a diminuição significativa na incorporação de glicose em regiões específicas do hemisfério ipsilateral foi observada em vários animais (n = 5) às 24 h pós-reperfusão (Figura 3, barras vermelhas). Other regiões cerebrais exibido pouco ou nenhum dano no hemisfério ipsilateral.

Especificamente, as regiões do hemisfério ipsilateral que sempre exibiu absorções FDG diminuídos foram: amígdala, putâmen caudado, o auditivo, entorrinal, lobo insular, paracórtex, e as regiões do córtex somatossensorial. Lesões corticais causadas por acidente vascular cerebral são associados com perda de conexões neuronais e mapas funcionais alteradas. Anormalidades estruturais na amígdala por acidente vascular cerebral levam a psicopatologia e cognitivo disfunção 12. Não é de estranhar que a região do caudado-putâmen foi afetada por FDG como o fluxo sanguíneo cerebral na parte lateral da região é suprido pela artéria cerebral média oclusa 13. A patologia nessa região do cérebro do roedor conduz a alterações da aprendizagem discriminar, processamento cognitivo e funções não-motoras 14. A incapacidade de levar até FDG foi também observada no córtex entorrinal umd córtex auditivo no lobo temporal medial do hemisfério isquêmico. Em 2001, Davis et al. Relataram que os danos córtex entorrinal em ratos leva a integração sensorial prejudicada e aprendizagem espacial persistente deificits 15. Disfunção auditiva é conhecido por ocorrer em acidente vascular cerebral em seres humanos, embora raramente 16. No entanto, a captação de FDG pelo colículo inferior que é uma das principais vias auditivas não foi afetada pelo acidente vascular cerebral em nosso modelo. Tem sido demonstrado que os ratos com AVC induzidas MCAO aumentar a adrenalina, noradrenalina e atividade nervosa simpática devido a enfarte do córtex insular, uma das regiões em nosso modelo que mostraram pobre captação de FDG 17. Isto poderia resultar em alterações na função autonômica que afectam o sistema cardíaco. Pobre captação de FDG também foi observado na área de somatossensorial do córtex fronto-parietal. Infarto isquêmico nesta área tem sido relatado para causar anormalidades estruturais e perda de conexões tálamo18. Limitada FDG foi também observada no córtex visual, o que pode conduzir a alterações da plasticidade dominância ocular, como relatado em recém-nascidos de ratos submetidos a isquemia hipóxica 19. No entanto, diminuiu FDG não foi observada no colículo superior, uma área que está envolvida na orientação do motor 20 visuais. Captação de FDG na área do hipocampo também foi prejudicada, uma área que é importante para a memória espacial e navegação. Foi consistentemente observado que a sub-regiões do cérebro médio, tal como o colículo superior e inferior, área tegmental ventral (VTA), bem como o bolbo olfactivo do cérebro anterior, e o tálamo profunda não foram afectados pela oclusão a artéria carótida média (Figura 3).

Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a FDG-PET com CT proporciona uma estratégia de imagem viável, reprodutível e não-invasiva, com o qual monitorizar a isquemia cerebral em ratos, de uma forma longitudinal.


Figura 1:. PET-CT dados de Rats antes e depois da isquemia cerebral Cada linha exibe a respectiva transversal (A, E), sagital (B, F), coronal (C, G), e rendido 3D (D, H) PET -Ct dados de um rato 24 horas antes (linha superior) e 24 horas após a reperfusão (ou 26 horas após a indução de isquemia cerebral; parte inferior). As setas brancas indicam a localização de diminuição da captação de FDG, devido aos danos acidente vascular cerebral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: dados PET alinhados com os atlas do cérebro W. Schiffer rato utilizando PMOD Os dados FDG-PET de.um rato 24 horas após a reperfusão (ou 26 horas após a isquemia cerebral; fileira de cima) se funde com as VOI atlas modelo cérebro para análise (linha de fundo). As cores indicam a VOIs separada dos atlas modelo cérebro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
. Figura 3: Representante Análise Quantitativa de captação de glicose no cérebro de um rato pela Seção de Relações de direito à hemisfério esquerdo sinal FDG PET no Padrão Captação de Unidades de cada região do cérebro de um rato W. Schiffer Atlas relatou para varreduras tomadas antes do evento acidente vascular cerebral isquêmico (pre; azul), 1,5 hr (verde) e 24 horas (vermelho) de pós-reperfusão (ou 26 horas de pós-reperfusão). As barras de erro representam o erro padrão para eventos de derrame cerebral de rato n = 5, em cada ponto de tempo. ** P ≤ 0,01, * p≤ 0,05 (teste t pareado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Ilustração da cirurgia MCAO A linha vermelha representa a prótese que é inserida na artéria carótida externa. O oval azul representa a área do cérebro.

Discussion

Aqui apresenta-se uma estratégia para a indução detalhada acidente vascular cerebral, a imagiologia de PET, e cérebro medição sub-região padronizada de danos nos tecidos em ratos Sprague-Dawley. Imagiologia de pequenos modelos animais, especialmente na área de acidente vascular cerebral é benéfica, tal como o tratamento de acidente vascular cerebral para ser eficaz depende de um tempo extremamente curto terapêutico. Aqui apresentamos um modelo de lesão e reperfusão, em que o curso foi induzida através de uma oclusão da artéria cerebral média, e de imagem realizados utilizando FDG com PET, ao lado de um CT de raios-X para referência anatômica. Medições regimentada de FDG dentro do cérebro sub-regiões foi possível graças ao mapeamento preciso das atlas modelo VOI para o cérebro de rato dentro do software de análise de imagem PMOD. Valores Raciometrico FDG foram coletadas através da divisão do cérebro correspondente sub-regiões em hemisférios opostos, que permite uma medição direta de dano enquanto normalizar as variações de sinal global de FDG PET entre diferentes animais e tempo points. Estas medições são consistentes com os efeitos esperados de acidente vascular cerebral no cérebro de rato, demonstrando de forma consistente, uma perda significativa de tecido cerebral captação de glicose em certas regiões do hemisfério ipsilateral. Esta metodologia tem o potencial para aumentar a nossa capacidade para comparar grupos de animais submetidos a muitos tipos de trauma cerebral, acidente vascular cerebral isquémico, incluindo dados de FDG PET. Ao padronizar os volumes a serem quantificados através hemisférios do cérebro e em vários animais, este método gera medidas consistentes de diminuição da absorção de glicose do tecido. Observe que outros marcadores de PET com captação no cérebro, como o 11 C-raclopride por receptores D2, pode ser utilizado com este protocolo, bem 21. Finalmente, descrevemos um método para visualizar um acidente vascular cerebral isquêmico em um cérebro de rato dentro de seu esqueleto com alta precisão anatômica em três dimensões. Desde prejuízo fisiológico e funcional induzida por acidente vascular cerebral pode ser transitório ou permanente, este método não-invasivo de imagempermite avaliar dano cerebral no mesmo animal ao longo de um período de tempo. Ele fornece uma maneira de marcar neurologicamente os ratos, bem avaliar os déficits neurológicos de curto e longo prazo, no mesmo animal. A função do modelo do software PMOD permite aos pesquisadores com uma certa quantidade de precisão para mapear a área da lesão e, talvez, se correlacionam com sequelas neurológicas e padrões de comportamento.

Para a quantificação precisa dos danos AVC por sub-região do cérebro, o passo fundamental é o alinhamento dos dados de PET com o atlas do cérebro de rato dentro PMOD. Inconsistências no alinhamento pode levar à quantificação incorreta de sub-regiões do cérebro afetadas pela isquemia. Tal como descrito no passo 4.1.7 protocolo, é possível utilizar as glândulas Harderiana como pontos de referência para o alinhamento com o atlas do cérebro PET dados experimentais. Efeitos de volume parcial (PVE) são uma preocupação durante este tipo de análise, e irá limitar a resolução global da estrutura do cérebro quepode ser trabalhada. Transbordamento de sinal pode ocorrer entre os volumes adjacentes, ou a própria ISV pode ser demasiado pequena em relação à resolução do instrumento, reduzindo assim a precisão do método quantitativo 22. O sistema Albira PET utilizado nestes estudos é equipado com três anéis detectores e produz uma resolução de 1,1 mm, o que evoluíram a partir de um correspondente sistema de anel que alcançou 1,5 milímetros 23. Buvat e co-trabalhadores notar que PVE irá afectar as medições de tumores com um diâmetro menor do que a resolução do sistema de 2-3x na metade completa largura máxima (FWHM), o que corresponderia a um volume esférico de 5,6-18,9 mm 3 para a 3- anel Albira. Casteels et ai. Referido recentemente que volumes superiores a 8 mm 3 terá efeito de volume parcial mínimas para exame de PET pré-clínicos modernos com resolução no intervalo de 1,1-1,3 mm, 24. Os atlas Schiffer foi cuidadosamente construída com esses parâmetros em mente, e utiliza 58 VOIs, dos quais 13 estão abaixo do limiar de 8 mm 3. Estes incluem o VOIs para hemisférios direito e esquerdo do córtex pré-frontal medial (6,3 milímetros 3, R / L), o Par A Cortex (7,6 milímetros 3, R / L), o colículo superior (7,1 milímetros 3, R / L) , o VTA (5,5 mm3, R / L), colículo inferior (5.7 mm 3 R / L), glândula pituitária (5,9 mm3), e o fluxo de sangue CB (5,1 mm3). Além disso, medições do córtex frontal (1,4 mm3 R / G) será o mais susceptível a PVE devido ao seu pequeno tamanho.

Estudos em animais maiores, como os ratos, os quais têm um correspondente aumento no tamanho da anatomia, irá ter um maior número de sub-regiões do cérebro que pode ser quantificada de forma fiável em comparação com os ratinhos. No entanto, estes métodos são aplicáveis ​​a imagem do cérebro em ratos, que têm a sua própria atlas cerebral disponível em PMOD que é composto por 18 sub-regiões que sejamdimensionado para minimizar PVE. Além disso, utilizando PET para identificar regiões do cérebro ainda menores do que são descritas neste estudo podem exigir o uso de metodologia alternativa. O método aqui descrito permite a quantificação rotina rígida e eficiente de danos nos tecidos do cérebro ao longo do tempo, segmentada por sub-regiões do cérebro, em ratos vivos. Lesão por isquemia é demonstrado aqui como um exemplo, mas a metodologia apresentada para a quantificação de alterações na actividade cerebral pode ser aplicado a qualquer outra condição que afecte o cérebro de rato.

Em conclusão, os dados de FDG-PET-CT de animais de pequeno porte pode ser adquirida de um modo não-invasivo e económica, e pode ser convenientemente utilizada para imagiologia pequeno animal numa forma quantitativa. Utilizando a ferramenta de modelo Schiffer do programa PMOD, áreas isquêmicas do cérebro pode ser delineada e os dados PET medido. Esta é uma ferramenta poderosa para o estudo futuro da reorganização cerebral, reparo e neurogênese após isquemia cerebral que irá promover development de neuro-terapias de pacientes com AVC com deficiência. Esta visualização também irá ser particularmente útil na avaliação de outros casos de trauma cerebral, em que o dano no tecido possa ser alinhada de modalidades de imagens separadas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albira PET SPECT CT Bruker 3D molecular imaging equipment
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories 400 Animal Subjects
18-F-D-Glucose Spectron PET compound
micro clamp FST 18055-03 artery clamp
occluder #4037 Doccol Corp. 403712PK10 surgical stroke induction

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References

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Medicina Edição 94 PET Positron Emission Tomography Stroke Isquemia Cerebral FDG modelo Cérebro atlas do cérebro a análise VOI
Imagem não invasivo e Análise de Isquemia Cerebral em Ratos de Vida Usando Positron Emission Tomography com<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG
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Balsara, R. D., Chapman, S. E.,… More

Balsara, R. D., Chapman, S. E., Sander, I. M., Donahue, D. L., Liepert, L., Castellino, F. J., Leevy, W. M. Non-invasive Imaging and Analysis of Cerebral Ischemia in Living Rats Using Positron Emission Tomography with 18F-FDG. J. Vis. Exp. (94), e51495, doi:10.3791/51495 (2014).

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