Abstract
Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken bland amerikaner 65 år eller äldre 1. Livskvaliteten för patienter som lider av en stroke inte återgå till det normala i en stor majoritet av patienterna 2, vilket främst beror på nuvarande bristen på klinisk behandling av akut stroke. Detta kräver att förstå de fysiologiska effekterna av cerebral ischemi på hjärnvävnad över tiden och är ett viktigt område för aktiv forskning. För detta ändamål har experimentell framsteg gjorts med användning av råttor som en preklinisk modell för stroke, speciellt med användning av icke-invasiva metoder, såsom 18 F-fluordeoxiglukos (FDG) kopplat med positronemissionstomografi (PET) avbildning 3,10,17. Här presenterar vi en strategi för att framkalla cerebral ischemi hos råttor genom mitten cerebral artär ocklusion (kortex) som härmar fokal cerebral ischemi hos människor, och att avbilda dess effekter över 24 timmar med hjälp av FDG-PET i kombination med röntgen datortomografi (CT) med en Albira PET-CT instrumentet. A VOI mall atlas därefter smält till de cerebrala rått data för att möjliggöra en objektiv analys av hjärnan och dess delregioner 4. Dessutom är en metod för 3D visualisering av FDG-PET-CT tidsförloppet presenteras. Sammanfattningsvis presenterar vi ett detaljerat protokoll för att initiera, kvantifiera, och visualisera en inducerad ischemisk stroke händelse i en levande Sprague-Dawley råtta i tre dimensioner med hjälp av FDG-PET.
Introduction
Stroke är en av de vanligaste dödsorsakerna i utvecklade länder, och är direkt ansvarig för döden av 1 av 19 amerikaner en. Det har uppskattats att ungefär 795,000 amerikaner upplever stroke varje år, varav 87% av dessa är ischemisk natur 5. Under en ischemisk händelse, är kontinuerlig tillförsel av syre och glukos till de kortikala neuroner allvarligt nedsatt inducera en hypoxisk miljö, vilket leder till minskad cellulär funktion i de drabbade hjärnregioner. Beroende på svårighetsgraden av stroke, cerebralt blodflöde och glukosupptag varierar spatialt och temporalt.
Skador på grund av stroke kan identifieras genom icke-invasiva metoder, såsom 18 F-fluordeoxiglukos (FDG) positronemissionstomografi 6. FDG är en glukosanalog där hydroxylgruppen vid 2'-positionen har ersatts av den positronemitterande 18 F isotop. 18 F är Advantageous grund av dess långa, 110 minuters halveringstid, vilket gör att den kan användas för att detektera glukoskonsumtionen i hjärnan. FDG PET ger en kvantitativ hög upplösning karta över deoxyglucose konsumtionen i hjärnan 7 som 18 F tenderar att ackumuleras i regioner med hög glukoskonsumtion, vilket tyder på att sådana vävnader är mycket metaboliskt aktiva 8. Den 18 F kärnan genomgår beta-sönderfall, släppa en positron, som snabbt förintar med en närliggande elektron, producerar gammastrålar, som detekteras av instrumentet. FDG PET kan upprepas i samma individ med minst 10 18 F halveringstider, eller cirka 18 timmar, mellan skanningar, vilket ger ett sätt att studera förändringar i hjärnans aktivitet över tid i samma individ.
Prekliniska djurmodeller, såsom råttor, används ofta för att utvärdera effekterna av stroke och hur effektiva behandlingar för stroke. Eftersom FDG PET är icke-invasiv, kan den användas för att mätaeffekterna av stroke över tid utan att störa fysiologi av djuret. Beroende på slaget händelseplatsen kan olika regioner i hjärnan kan påverkas. Men med små djur som råttor, manuellt definiera och kvantifiera aktivitet i specifika regioner i råtthjärna kan vara utmanande. För att jämföra glukos metabolisk aktivitet i specifika regioner i råtthjärna med tiden, måste volymerna av intresse (VOI) kvantifieras konsekvent avgränsas. En exakt atlas i råtthjärna har utvecklats för att lindra detta problem 9, och har omvandlats till digital form för användning i kvantifiering av prekliniska FDG-PET-data. Här presenterar vi en metod för att klassificera stroke vävnadsskador på ett konsekvent, metodisk sätt. Metoden detaljer det kirurgiska ingreppet för att inleda cerebral ischemi i en djurmodell, kvantifiera specifika hjärn delregioner som drabbats av stroke, och producera en tredimensionell visualisering av omfattningen och lokaliseringen av strokevävnadsskador med hjälp av lämpliga metoder och verktyg. Använda den metod som beskrivs i denna studie, kan forskarna konsekvent initiera cerebral ischemi hos råttor, genomföra PET imaging, och kvantifiera förändringar i FDG upptag använder definierade områden i hjärnan i prekliniska strokemodeller över tid.
Protocol
Djurhantering och alla experiment med dem var strängt utföras enligt protokoll som godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame (Protokoll nummer 14-086).
1. Djur
- Djur och Stroke initiering: Använd Sprague Dawley väger mellan 220 och 270 g för alla strokestudier.
- Söva råttor med 2,5% isofluoran (2 L / min i 100% O 2) med hjälp av en noskon.
- Placera djuret i rygg VILA på en värmedyna. Tejpa ner frambenen.
- Raka ventralsurface av halsen. Prep det rakade området med 70% EtOH, följt av 10% providon jodlösning.
- Sterila instrument används för detta förfarande; handskar ersätts efter prep av djuret. Sterila spetsteknik används.
- Med sax, gör en 2-2,5 cm snitt parallellt med luftstrupen, 0,5 cm till höger om luftstrupen. Använda trubbig dissection lokalisera halspulsådern.
- Använd upprullningsdon att hjälpa visualisera kärlet. Placera en mikro klämma på den gemensamma halspulsådern (CCA).
- Lokalisera den första förgreningspunkten som kommer att vara den yttre halsartären (ECA) och den inre halsartären (ICA). Bränna mindre grenar knutna till revisionsrätten, såsom nackartären.
- Ligate ECA nära vägskälet till sköld artär med en 4-0 silkessutur. Suturerna bör ha extra längd för att möjliggöra peanger för att hålla suturen.
- Bränna ECA ovanför suturen (cranially). Spänn fast sutur med peanger, dra ECA kaudalt och det blir parallellt med CCA.
- Leta reda på ICA och använda en annan mikro klämma för att täppa denna artär.
- Gör ett litet hål i ECA använda små våren sax. Sätt i ockluderingsanordning i ECA och knyt en sutur runt ockluderingsanordningen att förhindra blodflödet.
- Ta mikroklämman på ICA och avancera tilltäppningsanordningen tills motstånd känns.
OBS Se till att ockluderingsanordning förskott till ICA och inte pterygopalatin artären. Den ockluderingsanordning bör avancera smidigt och den vita spetsen bör inte ses om ockluderingsanordningen är korrekt placerad. - Ta mikro klämman från CCA. Klipp eventuellt överskott ockluderingsanordning eller sutur.
- Placera 9 mm Auto Clips för att stänga snittet huden.
- Ta bort djuret från anestesi och låt djuret att vakna. Efter 2 timmar:
- Bedöva råtta med isofluran.
- Ta bort sårklämmor.
- Lokalisera änden av tillslutningsanordningen och avlägsna den från den mellersta hjärnartären genom att försiktigt dra i den tills den vita spets tilltäppningsanordningen kommer i kontakt med suturer. Dra inte i den hela vägen ut, kommer detta orsaka blödningar.
- Byt sårklämmor till snittet.
- Ta bort djuret från anestesi och låt djuret att vakna.
2. Image Acquisition
Utför tre PET och CT sburkar för varje råtta. Ta en pre scan 1-2 dagar innan inducera stroke, för att ge en grund för 18 F-FDG upptag. Skanna varje råtta 1,5 timmar efter stroke, innan reperfusion utförs (bilden med ockluderingsanordning fortfarande i djuret). Skanna varje råtta 26 timmar efter stroke (24 timmar efter reperfusion) att kvantifiera hjärnvävnadsskada på grund av stroke skada.
OBS: 24 tim tidpunkt nämns i resten av manuskriptet avseende den tjänst reperfusion då råttorna skannats.
- Söva råttor under 2,5% isofluoran gas i anestesi kammaren.
- Injicera omkring 500 ^ Ci 18 F-deoxiglukos (FDG) (200 pl total volym) i svansvenen av råtta.
- Vänta en timme.
- Placera nedsövd råtta på standard rått säng under noskon isofluoran anestesi. Mät avståndet i mm mellan näsan av råtta och kant rått säng för horisontell förskjutning.
3. Image Acquisition
- Öppen Albira Suite software.
- Välj förvärvaren.
- Namn ny studie.
- Enligt PET eller SPECT klicka på Lägg till> Välj PET-protokollet. Klicka på Lägg till.
- Enligt CT klicka på Lägg till> Välj CT-protokollet. Klicka på Lägg till.
- Klicka nummer under Initial Horisontell position inom PET. Ställ nummer till uppmätta avståndet i mm mellan näsan av råtta och framför rått säng. Upprepa för CT.
- Ställ förbehåll för råtta och ange vikten i gram.
- Ställ Förening till FDG.
- Ställ Injektion Tid och Injektion Datum och Dos.
- Klicka på Start Studie knappen.
OBS: Efter avslutad PET datortomografi, data kommer att sparas automatiskt. - Öppna Albira Reconstructor.
- ChanGE Väntar till sista 10 eller Alla.
- Välj skannings filnamn.
- Klicka på Lägg till.
- Klicka på Start återuppbyggnad. OBS: Arkiv sparas i MicroPET format.
4. Bildanalys
- Utför bildanalys med hjälp av PMOD analysprogram i samband med W. Schiffer Brain Atlas.
- Öppna PMOD> Fusion.
- Öppna fliken coregistration Förbehandling överst på skärmen.
- Öppna Load Referens rullgardinsmenyn i mitten av skärmen och välj nifti. Navigera till C: //PMOD3.2/resources/templates/usertemplates. Välj Rat (W.Schiffer) -FDG.nii och klicka på Öppna.
- Öppna Load Input rullgardinsmenyn till höger på skärmen och välj MicroPET. Navigera till den önskadeMicroPET fil. Markera den och klicka på Öppna.
- Öppna fliken Manuell coregistration längst upp på skärmen.
- Välj den fjärde fliken i mitten grupp flikarna på höger (Reslicing).
OBS: Två knappar visas på MicroPET skannar. - Använd den öppna vita rektangeln att rotera MicroPET skannar och den fyllda vita rektangeln för att flytta MicroPET skannar. Rikta de två scanningar. För att göra detta, leta sevärdheter som de harderian körtlar, och topp och bakre cerebrala funktioner som kan användas för att matcha MicroPET scan med hjärnan modell. Justera därefter MicroPET sökningen tills den matchar upp med hjärnatlas (W. Schiffer).
OBS: Till exempel harderian körtlar visas ljusa på både MicroPET skannar och hjärnatlas (W. Schiffer), och kan användas som en referens för uppriktning. - Om det behövs, rotera MicroPET scanna 180 ° i koronala vyn och höja skann avsevärt i the sagittalvy, tillsammans med andra mindre orienteringsändringar.
- Navigera till fliken Helskärm Fusion (vois) längst upp på skärmen.
- Välj Källa A längst upp till höger på skärmen.
- Gå till mall> Atlas längst ned på sidan.
- Välj Rat (W. Schiffer) från rullgardinsmenyn.
OBS: (Valfritt) Återgå till manuell fliken coregistration där atlas ska visas på det hjärnatlas (W. Schiffer). Atlasen kan användas för att hjälpa anpassa MicroPET skanna och hjärnatlas (W. Schiffer). Efter justering, återgå till fliken Helskärm Fusion (vois). En mall visas på hjärnan, som anger vilka delar av hjärnan kommer att mätas för VIO statistik. - Välj Källa B längst upp till höger på skärmen.
- Välj VOI Statistik knappen längst upp right av skärmen.
OBS: Ett kalkylblad visas. - Välj Spara.
OBS: En Write Som [VOI Statistik] fönster visas. - Välj Spara till fil System.
OBS: En PMOD (spara): välj komponenter fönster visas. - I filnamnsfältet skriver önskat filnamn.
- Välj Spara.
- Utför dataanalys med hjälp av Microsoft Office Excel 2010.
- Öppna Excel.
- Välj Arkiv> Öppna.
- Ändra filtyp från All Excel-filer till alla filer.
- Navigera till de sparade VIOSTAT filerna. Välj önskad fil.
OBS: En trollkarl import visas. - Välj Slutför. Om du använder en Mac, dubbelklicka på VOISTAT filen och det kommer direkt öppen som en Excel-fil.
- Markera kolumnen med fältet VoiName (REgion). Kopiera informationen och klistra in den på ett nytt Excel-fil.
- Välj den kolumn som innehåller fälten Averaged och [1/1]. Kopiera informationen och klistra in den nya Excel-fil.
- Upprepa denna process för alla VOISTAT filer.
- Börja en ny flik för varje datauppsättning.
- Återgå till den första fliken. Välj en ny cell. Beräkna förhållandet av den högra sidan av en hjärna sektion till den vänstra sidan av en hjärnsektion genom att dividera värdet av den högra sidan av hjärnan genom den vänstra sidan av hjärnan. Avsnittet hjärnan hör till den högra sidan av hjärnan är noterat innan det avsnitt som hör till den vänstra sidan av hjärnan. Upprepa detta för alla hjärnan sektioner.
- Välj en ny cell. Använd funktionen MEDEL för att beräkna medelvärdet av varje av de tidigare beräknade nyckeltal inom alla mössen.
- Välj en ny cell. Beräkna SEM av varje hjärna sektion med hjälp av funktionen STDAV och dividera it med kvadratroten av antalet möss.
- Upprepa detta för varje datauppsättning.
5. Bild Visualisering
- Konvertera bilder till analysera filformat använder PMOD analysprogram.
- Öppna PMOD> View.
- Öppna fliken Vy överst på skärmen.
- Öppna Load rullgardinsmenyn till höger på skärmen och välj MicroPET. Navigera till önskad MicroPET eller CT-fil. Välj den och tryck Öppna.
- Öppna rullgardinsmenyn Spara till höger på skärmen och välj Analysera. Navigera till önskad destination. Skriv önskat namn i fältet Filnamn. Välj Spara.
- Skapa bildsekvenser med hjälp VolView bildbehandlingsprogram.
- Öppen VolView.
- Välj Öppna fil
- Navigera till analysera versionen av CT-datafil för önskad scan. Välj den och tryck Öppna.
OBS: Ett öppet Wizard fil visas. - Använd standardinställningarna genom att trycka på Nästa i popup-fönster.
- Välj fliken Insticks till vänster på skärmen.
- Öppna Plugin rullgardinsmenyn och välj Verktyg> Merge volymer.
- Avmarkera Rescale Components.
- Välj Tilldela andra ingången.
- Gå till analysera versionen av MicroPET datafil för samma avsöknings. Välj den och tryck Öppna.
OBS: Ett öppet Wizard fil visas. - Använd standardinställningarna genom att trycka på Nästa i varje fönster.
OBS: MicroPET scan kommer att visas överlagras på datortomografi. - Välj Inställning Färg / Opacitets fliken längst till vänster på skärmen.
- Öppna Komponentrullgardinsmenyn längst ner till höger på skärmen. Välj 1.
OBS: Detta kommer att säkerställa att datortomografi är den enda bilden påverkas av följande anvisningar. - I Skalär Color Mapping, välj mittpunkten. Ta bort det genom att dra det ur av reglaget området.
- Välj den vänstra punkten.
OBS: Ett Färgväljaren fönster visas. - Ändra färg på den punkt till svart.
- Välj rätt punkt.
OBS: Ett Färgväljaren fönster visas. - Ändra färg på den punkt till vitt.
- I Skalär Opacitet Mapping avsnittet lägga till en punkt genom att klicka någonstans i rutan.
- Justera avsnitt tills CT-bilden visar endast skelettet hos råttan.
- Markera Aktivera Skuggning.
- Välj Ridning fliken till vänster på skärmen.
- Ändra Antal ramar till 72.
- Ändra X rotation till 360.
- Välj Skapa.
- Navigera till önskad destination. Skapa en ny mapp för att lagra bilder genom att högerklicka på tomt utrymme och välja Nytt> Mapp.
- Skriv önskat namn i fältet Filnamn. Välj Spara.
OBS: En Frame Size fönster visas. - Välj OK.
- Volview kommer att generera bilderna. När den är klar, visas ett fönster som anger "Din film har skapats!" Välj OK.
- Återgå till fliken Färg / opacitetsinställningar.
- Enligt Komponent Vikt (s), justera reglaget för komponent 1 så det har value från 0.
OBS: Endast MicroPET scan visas. - Upprepa steg 5.2.21-28 att skapa en andra bildsekvens.
- Återgå till fliken Färg / opacitetsinställningar.
- Enligt Komponent Vikt (s), justera reglaget för komponent 2 så det har värdet 0.
OBS: Endast datortomografi visas. - Upprepa steg 5.2.21-28 att skapa en tredje bildsekvens.
- Generera rotations filmer (som visas i videon) med hjälp av ImageJ programvara.
- Öppen ImageJ.
- Välj Arkiv> Importera> Bildsekvens.
- Navigera till den fil som innehåller de bilder som enbart se CT-data för pre scan. Välj den första bilden och tryck på Välj.
OBS: En sekvens Fönstret Alternativ visas. - Välj OK.
- Välj Arkiv &# 62; Importera> Bildsekvens.
- Navigera till den fil som innehåller de bilder som enbart se MicroPET data för pre scan. Välj den första bilden och tryck på Välj.
OBS: En sekvens Fönstret Alternativ visas. - Välj OK.
- Välj Arkiv> Importera> Bildsekvens.
- Navigera till den fil som innehåller de bilder som visa både data CT och MicroPET för pre scan. Välj den första bilden och tryck på Välj.
OBS: En sekvens Fönstret Alternativ visas. - Välj OK.
- Välj Bild> Staplar> Verktyg> Kombinera.
OBS: En Combiner fönster visas. - Välj i rullgardinsmenyn STACK 1. Välj den stapel som innehåller de CT-data.
- Välj i rullgardinsmenyn Stack2. Välj den stapel som innehåller MicroPET data. Välj OK.
OBS: En ny bunt med båda scanningar visas. - Välj Bild> Staplar> Verktyg> Kombinera.
OBS: En Combiner fönster visas. - Välj i rullgardinsmenyn STACK 1. Välj stapeln som innehåller de kombinerade stackar.
- Välj i rullgardinsmenyn Stack2. Välj den stapel som innehåller både CT-data och de MicroPET data. Välj OK.
OBS: En ny bunt med alla tre scanningar kommer att visas. - Håll de kombinerade stackar öppna. Upprepa steg 5.3.2-16 för 1,5 timmar efter skanning och 24 timmar efter scan bildstaplar.
- Välj Bild> Staplar> Verktyg> Kombinera.
OBS: En Combiner fönster visas. - Välj i rullgardinsmenyn STACK 1. Välj den stapel som innehåller samtliga föranavsökningsdata.
- Välj Stack2
- Kontrollera Kombinera Lodrätt.
- Välj OK.
OBS: En ny bunt med både före skanning och 1,5 timmar efter skanning visas. - Välj Bild> Staplar> Verktyg> Kombinera.
OBS: En Combiner fönster visas. - Välj i rullgardinsmenyn STACK 1. Välj stapeln som innehåller de kombinerade stackar.
- Välj i rullgardinsmenyn Stack2. Välj den stapel som innehåller alla de 24 h efter avsökningsdata.
- Kontrollera Kombinera Lodrätt.
- Välj OK.
OBS: En ny bunt med alla nio scanningar kommer att visas. - Välj Arkiv> Spara som> AVI.
- Välj OK.
- Navigera till önskad destination. Skriv önskat namn i Filnamn Spara.
Representative Results
Cerebral ischemi initierades i levande Sprague-Dawley via ocklusion av arteria cerebri media, med efterföljande kärnkrafts avbildning för att upptäcka dess effekter. Levande råttor avbildades 24 h före stroke induktion, såväl som 1,5 h och 24 h efter ischemi, var och en med oberoende injektioner av ca 500 | iCi av 18 F-FDG som fullständigt sönderfaller inom 18 tim. De tre detektorringen Albira system som används för dessa studier har en känslighet på 9%, vilket gör 500 xCi en rimlig dos för råttorna. Representativa avbildningsdata för PET och röntgen datortomografi visas för en råtta vid 24 h före och 24 h efter reperfusion tidpunkter i figur 1, övre och nedre rader respektive. Den tvärgående (paneler A och E), sagittal (paneler B och F), och koronala (paneler C och G) skivor för varje skanning presenteras med FDG-PET-data färgade i en & #8220; rainbow "intensitetsskala, och överlagras på CT i gråskala. Notera att CT användes för anatomisk co-registrering av PET-data inom djur skalle, och ingen radiodensiteten förändringar i hjärnvävnaden noterades under dessa experiment. Vid 24 h var det en dramatisk minskning i glukosupptag till den ipsilaterala hemisfären, vilket tyder på utbredd vävnadsskada på grund av den inducerade ischemisk stroke. En 3D-rendering av overlay data presenteras i figur 1D och H. När roteras på skärmen, dessa utförda uppgifter ger en förbättrad visualisering av stroke-inducerade minskning av FDG upptag.
För att kvantifiera förändringar i cerebral glukosupptag på grund av stroke hos en spatiotemporal sätt, var en VOI hjärnatlas tillämpas för pre-stroke baslinjen, 1,5 tim, och 24 timmar (efter reperfusion) för varje skanning. Detta åstadkoms med användning av PMOD programpaket i samband med W. Schiffer råtthjäma mall och ATLAs. Först PMOD används för att omvandla varje råtthjärna PET dataset till lämplig plats och geometri via manuell co-registrering använder flytta och rotera verktyg under fliken Reslicing. Observera att skalan verktyget finns även att justera den totala hjärnstorlek, om det behövs. Även om användningen av de Schiffer atlas är överlägsen manuell ritning vois inom hjärnan utrymme, kan det finnas experimentellt fel induceras från felaktig hjärna fusion. Således, i vissa fall en ökning av antalet djur kan behövas för att uppnå statistisk signifikans. Därefter de W. Schiffer VOI hjärnatlas automatiskt tillämpas för att mäta FDG ackumulering, i standardupptagsheter, inom definierade delregioner i råtthjärna (Figur 2). Hjärnan VOI atlas kan också användas på ett iterativt sätt med standardhjärnmodellen för att ytterligare optimera den manuella sammansmältning av de experimentella data. Eftersom stoke händelsen isolerades till högra hjärnhalvan i varje djur, skadan to varje region kvantifierades genom att beräkna ett förhållande av glukosupptag aktivitet mellan kontralaterala regioner (figur 2). Användningen av dessa förhållanden ger en bekväm normalisering mellan höger och vänster hjärnhalva, och tar bort variabilitet som kan uppstå när man jämför PET signalintensitetsvärden mellan olika skanningar. Vid 1,5 timmar efter stroke, fick 18 F-FDG upptag påverkas inte i ischemiska området. Därför togs inga kvantitativa förändringar observeras i glukosupptag mellan de kontra och ipsilaterala halvklot (Figur 3, blå och gröna staplar). Detta kan bero på hyper-glukosupptaget den peri-ischemisk region eller ökad glukosmetabolism vid denna tidpunkt för att kompensera för förlusten av cellulär ATP 10,11. Dock var signifikant minskning av glukosupptag i specifika regioner i ipsilaterala halvklotet observeras över flera djur (n = 5) vid 24 h efter reperfusion (Figur 3, röda staplar). Other hjärnregioner visade liten eller ingen skada i ipsilaterala halvklotet.
Specifikt, de regioner i den ipsilaterala hemisfären som konsekvent uppvisade förminskade FDG upptag var: amygdala, caudatus putamen, hörsel, entorhinal, ö- lob, paracortex och somatosensoriska regioner i kortex. Kortikala skador orsakade på grund av stroke är förknippade med förlust av neuronala anslutningar och förändrade funktionskartor. Strukturella avvikelser i amygdala grund av stroke leder till psykopatologi och kognitiv dysfunktion 12. Det är inte förvånande att caudatus och putamen regionen påverkades för FDG upptag som den cerebrala blodflödet i den laterala delen av denna region levereras av tilltäppta mellersta hjärnartären 13. Den patologi i denna region av gnagare hjärnan leder till nedsatt diskriminera inlärning, kognitiv behandling, och icke-motoriska funktioner 14. Oförmåga att ta upp FDG observerades också i entorhinal cortex end hörselbarken i mediala temporalloben av ischemisk halvklotet. År 2001, Davis et al. Rapporterade att entorhinal cortex skador hos råttor leder till nedsatt sensorisk integration och ihållande spatial inlärning deificits 15. Auditiv dysfunktion är känd för att förekomma i stroke hos människor, men sällan 16. Men upptag av FDG av sämre colliculus som är en av de stora hörselbanorna har inte påverkats av stroke i vår modell. Det har visats att kortex-inducerade stroke råttor ökar adrenalin, noradrenalin och sympatisk nervaktivitet till följd av infarkt i Insula, en av de regioner i vår modell som visade dålig FDG upptag 17. Detta kan leda till förändringar i autonom funktion som påverkar hjärtsystemet. Dålig FDG upptag observerades också i den somatosensoriska område av frontoparietal cortex. Ischemisk infarkt inom detta område har rapporterats orsaka strukturella avvikelser och förlust av talamiska anslutningar18. Limited FDG upptag observerades också i syncentrum, vilket kan leda till försämrad okulär dominans plasticitet, som rapporterats i rått nyfödda utsatts för hypoxisk ischemi 19. Dock minskade FDG upptag observerades inte i överlägsen colliculi ett område som är involverad i visuell motor vägledning 20. FDG upptag i hippocampus området var också nedsatt, ett område som är viktigt i rumslig minne och navigering. Det observerades genomgående att delregioner i mellanhjärnan, som överlägsna och underlägsna colliculi, ventrala tegmentumområdet (VTA), samt luktbulben av framhjärnan, och den djupa thalamus inte påverkades av ocklusion av mitthalspulsådern (Figur 3).
Taget tillsammans visar dessa resultat att FDG-PET med CT ger en livskraftig, reproducerbar, och icke-invasiv avbildning strategi med vilken att övervaka cerebral ischemi hos råttor i en längsgående sätt.
Figur 1:. PET-CT Uppgifter om råttor före och efter cerebral ischemi Varje rad visar respektive tvär (A, E), saggital (B, F), koronala (C, G), och 3D-renderade (D, H) PET -CT data av en råtta 24 timmar före (övre raden) och 24 timmar efter reperfusion (eller 26 timmar efter induktion av cerebral ischemi, botten). Vita pilar indikerar platsen för minskad FDG upptag pga stroke skador. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PET-data i linje med W. Schiffer råtthjärna atlas använder PMOD De FDG-PET data för.en råtta 24 timmar efter reperfusion (eller 26 timmar efter cerebral ischemi, övre raden) är smält med VOI hjärnan mall atlas för analys (nedersta raden). Färger anger separata vois av hjärnmall atlas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3: Representant Kvantitativ analys av glukosupptaget i råtthjärna av avsnitt Förhållanden mellan höger till vänster hjärnhalva FDG PET-signalen i Standard Upptag Enheter från varje region i W. Schiffer Rat Brain Atlas rapporteras för skanningar som gjorts före ischemisk stroke händelse (pre; blå), 1,5 h (grön) och 24 h (röd) post-reperfusion (eller 26 timmar efter reperfusion). Felstaplar representerar standardfelet för n = 5 råtthjäma stroke händelser, vid varje tidpunkt. ** P ≤ 0,01, * p≤ 0,05 (parat t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Illustration av kortex kirurgi Den röda linjen är ockluderingsanordningen som sätts in i yttre halspulsådern. Den blå ovalen representerar det område av hjärnan.
Discussion
Här presenterar vi en detaljerad strategi för stroke induktion, PET imaging och standardiserad hjärnunderregion mätning av vävnadsskada i Sprague-Dawley-råttor. Imaging av små djurmodeller, i synnerhet inom området för stroke är gynnsam, eftersom behandling för stroke för att vara effektiv beror på en extremt kort terapeutisk tid. Här presenterar vi en skada-reperfusion modell, där stroke inducerades via en ocklusion till mitten cerebral artär, och avbildning fördes med hjälp av FDG PET, tillsammans med en röntgen CT för anatomisk referens. Regimented mätningar av FDG upptag inom hjärn delregioner har gjorts möjlig genom noggrann kartläggning av VOI mall atlas på råtthjärna inom PMOD bildanalysmjukvara. Propportionell FDG-värden saml genom att dividera motsvarande hjärn delregioner i motsatta halvklot, vilket möjliggör en enkel mätning av skador samtidigt normalisera för variationer i den globala FDG PET-signalen mellan olika djur och tids points. Dessa mätningar är i överensstämmelse med den förväntade effekten av stroke på råtthjäma, visar konsekvent, betydande förlust av hjärnvävnad glukosupptag i vissa regioner i den ipsilaterala hemisfären. Denna metodik har potentialen att öka vår förmåga att jämföra FDG PET datauppsättningar av djur som genomgår många typer av hjärntrauma, inklusive ischemisk stroke. Genom att standardisera de volymer som ska kvantifieras över hjärnhalvorna och över flera djur, genererar denna metod konsekventa mätningar av minskad vävnadsglukosupptag. Observera att andra PET spårämnen med hjärnans upptag, liksom 11 C-rakloprid för D2-receptorer, kan användas med detta protokoll samt 21. Slutligen beskriver vi en metod för att visualisera en ischemisk stroke i en råtthjärna inom dess skelett med hög anatomisk noggrannhet i tre dimensioner. Eftersom stroke-inducerade fysiologiska och funktionsnedsättning kan vara övergående eller permanent, denna icke-invasiv metod för avbildninglåter forskare att utvärdera hjärnskador i samma djur under en tidsperiod. Det är ett sätt att neurologiskt poäng råttorna samt bedöma kort- och långsiktiga neurologiska underskott i samma djur. Mallen funktion PMOD programvaran tillåter forskare med en viss mängd av precision för att kartlägga skadeområdet och kanske korrelerar med neurologiska följdsjukdomar och beteendemönster.
För exakt kvantifiering av stroke skada genom hjärnregion, är nyckelfasen inriktningen av PET-data med råtthjärna atlas inom PMOD. Inkonsekvenser i linje kan leda till felaktiga kvantifiering av hjärn delregioner drabbats av ischemi. Som beskrivs i protokollet steg 4.1.7, är det möjligt att använda de harderian körtlar som landmärken för inriktning hjärnatlas med experimentella PET-data. Partiell volymeffekter (PVE) är ett bekymmer under denna typ av analys, och kommer att begränsa den totala upplösningen av hjärnans struktur somkan avbildas. Signalspillover kan inträffa mellan intilliggande volymer, eller VOI självt kan vara för liten i förhållande till instrumentets upplösning, vilket minskar den kvantitativa noggrannheten av metoden 22. Det Albira PET-systemet som används i dessa studier är utrustad med tre detektorringar och ger en upplösning på 1,1 mm, vilket utvecklats från motsvarande snabbringsystem som uppnås 1,5 mm 23. Buvat och medarbetare konstatera att PVE påverkar mätningar av tumörer med en diameter mindre än 2-3x systemets upplösning vid full bredd halv max (FWHM), vilket skulle motsvara en sfärisk volym på 5,6-18,9 mm 3 för 3- ringen Albira. Casteels et al., Uppgav nyligen att större volymer än 8 mm 3 kommer att ha minimala partiella volymeffekter för moderna prekliniska PET-skannrar med upplösning i intervallet 1,1-1,3 mm 24. De Schiffer atlas har omsorgsfullt konstruerade med dessa parametrar i åtanke, och utnyttjar 58 vois, varav 13 faller under 8 mm 3 tröskeln. Dessa inkluderar vois för höger och vänster halvklot av den mediala prefrontala cortex (6,3 mm 3, R / L), den Par A Cortex (7,6 mm 3, R / L), den överlägsna colliculi (7,1 mm 3, R / L) , VTA (5,5 mm 3, R / L), sämre colliculus (5,7 mm 3, R / L), hypofysen (5,9 mm 3), och CB blodflödet (5,1 mm 3). Dessutom kommer mätningar av frontala cortex (1,4 mm 3 R / L) vara den mest känsliga för PVE på grund av sin ringa storlek.
Studier på större djur som råttor, som har en motsvarande ökning av storleken av anatomin, kommer att ha ett större antal hjärn delregioner som kan tillförlitligt kvantifieras jämfört med möss. Ändå är dessa metoder är tillämpbara på hjärnavbildning i möss, som har sin egen hjärna atlas tillgängliga i PMOD som består av 18 underregioner som ärdimensionerad för att minimera PVE. Vidare att med hjälp av PET identifiera även mindre hjärnregioner än beskrivs i denna studie kan kräva användning av alternativa metoder. Den metod som beskrivs här möjliggör likriktat och effektiv kvantifiering av hjärnvävnad skador över tid, segmenteras efter hjärn delregion, i levande råttor. Skada på grund av ischemi demonstreras här som ett exempel, men den metod som presenteras för kvantifiering av förändringar i hjärnans aktivitet kan tillämpas på varje annat tillstånd som påverkar råtthjärnan.
Sammanfattningsvis kan FDG-PET-CT-data för smådjur förvärvas på ett icke-invasivt och ekonomiskt sätt, och kan lämpligen användas för små djur avbildning på ett kvantitativt sätt. Använda Schiffer mallverktyget i PMOD programmet kan ischemiska områden i hjärnan avgränsas och de PET-data mättes. Detta är ett kraftfullt verktyg för den framtida studier av hjärn omorganisation, reparation och nybildning av nervceller efter cerebral ischemi som kommer att främja development av neuro terapier funktionshindrade strokepatienter. Denna visualisering kommer också att vara särskilt användbar vid utvärdering andra fall av hjärntrauma, där vävnadsskada kan anpassas från separata avbildningsmetoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albira PET SPECT CT | Bruker | 3D molecular imaging equipment | |
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | 400 | Animal Subjects |
| 18-F-D-Glucose | Spectron | PET compound | |
| micro clamp | FST | 18055-03 | artery clamp |
| occluder #4037 | Doccol Corp. | 403712PK10 | surgical stroke induction |
References
- Minino, A. M., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D. Deaths: final data for 2008. Natl Vital Stat Rep. 59, 1-126 (2011).
- Niemi, M. L., Laaksonen, R., Kotila, M., Waltimo, O. Quality of life 4 years after stroke. Stroke. 19, 1101-1107 (1988).
- Ter-Pogossian, M. M., Phelps, M. E., Hoffman, E. J., Mullani, N. A. A positron-emission transaxial tomograph for nuclear imaging. 114, 89-98 (1975).
- Schiffer, W. K., et al. Serial microPET measures of the metabolic reaction to a microdialysis probe implant. J Neurosci Methods. 155, 272-284 (2006).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, e2-e220 (2012).
- Heiss, W. D., et al. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
- Foster, N. L., et al. Alzheimer's disease: focal cortical changes shown by positron emission tomography. Neurology. 33, 961-965 (1983).
- Bustamante, E., Pedersen, P. L. High aerobic glycolysis of rat hepatoma cells in culture: role of mitochondrial hexokinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 3735-3739 (1977).
- Toga, A. W., Santori, E. M., Hazani, R., Ambach, K. A 3D digital map of rat brain. Brain Res Bull. 38, 77-85 (1995).
- Yuan, H., et al. Saptiotemporal uptake characteristics of [18]F-2-Fluoro-2-Deoxy-D-Glucose in a rat middle cerebral artery occlusion model. Stroke. 44, (2013).
- Nemoto, E. M., Hossmann, K. A., Cooper, H. K. Post-ischemic hypermetabolism in cat brain. Stroke. 12 (5), 666-676 (1981).
- Sachdev, P. S., Chen, X., Joscelyne, A., Wen, W., Brodaty, H. Amygdala in stroke/transient ischemic attack patients and its relationship to cognitive impairment and psychopathology: the Sydney stroke study. Am. J. Geriatr. Psychiatry. 15, 487-496 (2007).
- Nagasawa, H., Kogure, K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion. Stroke. 20, 1037-1043 (1989).
- Hauber, W., Schmidt, W. J. Differential effects of lesions of the dorsomedial and dorsolateral caudate-putamen on reaction time performance in rats. Behavioral Brain Research. 60, 211-215 (1994).
- Davis, A. E., Gimenez, A. M., Therrien, B. Effects of entorhinal cortex lesions on sensory integration and spatial learning. Nurs. Res. 50, 77-85 (2001).
- Hausler, R., Levine, R. A. Auditory dysfunction in stroke. Acta Otolaryngol. 120, 689-703 (2000).
- Cechetto, D. F., Wilson, J. X., Smith, K. E., Wolski, D., Silver, M. D., Hachinski, V. C. Autonomic and myocardial changes in middle cerebral artery occlusion: stroke models in the rat. Brain Res. 502, 5296-5305 (1989).
- Carmichael, S. T., Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. New patterns of intracortical projections after focal cortical strike. Neurobiol. of Disease. 8, 910-922 (2001).
- Failor, S., et al. Neonatal cerebral hypoxia-ischemia impairs plasticity in rat visual cortex. J. Neurosci. 30, 81-92 (2010).
- Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Ann. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
- Kuhn, F. P., et al. Comparison of PET template-based and MRI-based image processing in the quantitative analysis of C11-raclopride PET. EJNMMI Res. 4 (1), 7 (2014).
- Soret, M., Bacharach, S. L., Buvat, I. Partial-Volume Effect in PET Tumor Imaging. J. Nuc. Med. 48, 932-945 (2007).
- Sanchez, F., et al. ALBIRA: A Small Animal PET/SPECT/CT Imaging System. Med. Phys. 40 (5), 051906 (2013).
- Casteels, C., et al. Construction and Evaluation of Quantitative Small-Animal PET Probabilistic Atlases for [18F]FDG and [18F]FECT Functional Mapping of the Mouse Brain. PLOS One. 8 (6), e65286 (2013).
