Summary
Usamos rastreamento óptico de nanopartículas plasmonic para investigar e caracterizar os movimentos de organismos aquáticos de freqüência.
Abstract
Demonstramos como pinças ópticas podem proporcionar um instrumento sensível para analisar as vibrações geradas fluídicos pelo movimento de pequenos organismos aquáticos. Uma única nanopartícula de ouro mantida por uma pinça óptica é usado como um sensor para quantificar o movimento rítmico de uma larva Nauplius (Artemia salina) em uma amostra de água. Isto é conseguido através da monitorização do tempo de deslocamento dependente da nanopartícula preso, como consequência da actividade Nauplius. Uma análise de Fourier da posição da nanopartícula proporciona então um espectro de frequência, que é característica para o movimento das espécies observadas. Esta experiência demonstra a capacidade deste método para medir e caracterizar a actividade de pequena larvas aquático sem a necessidade de observar directamente e para obter informações sobre a posição das larvas no que diz respeito à partícula aprisionada. No geral, esta abordagem poderia dar uma visão sobre a vitalidade de certas espécies encontradas em um e aquáticocosystem e poderia ampliar o leque de métodos convencionais para análise de amostras de água.
Introduction
Avaliação da qualidade da água com base em indicadores químicos e biológicos é de fundamental importância para obter insights sobre as condições de estado e ambientais de um ecossistema aquático 1-3. Os métodos clássicos de análise química de água baseiam-se em propriedades organolépticas ou a determinação dos parâmetros físico-químicos. Os indicadores biológicos, por outro lado, são as espécies animais cuja presença e viabilidade fornecer informações sobre as condições ambientais e os efeitos de poluentes para um ecossistema que elas ocorrem dentro Exemplos típicos de bioindicadores são copépodes, um grupo de pequenos crustáceos de água, que pode ser encontrados em praticamente qualquer habitat de água 4,5. Observando-se a actividade e a viabilidade destas espécies a partir de uma amostra de água pode assim ser utilizada para obter informação sobre as condições gerais de um ecossistema 5. As larvas de copépodes, que são chamados Nauplii, use traços rítmicos de suas antenas (cada larva tem três pares de appendages em sua região da cabeça) para nadar em água 6. A freqüência ea intensidade desses cursos é, assim, um indicador direto de idade, fitness, e as condições ambientais do animal 7-10. Quaisquer investigações sobre estes espécimes são geralmente feito com um microscópio, observando e contando os cursos de antena do Nauplii diretamente. Devido ao seu tamanho (~ 100-500 mm) 11, isso muitas vezes requer a fazer medições de um por um, ou para corrigir um único Nauplius a um substrato.
Aqui, nós demonstramos uma nova abordagem para observar a atividade de Copépode larvas em amostras de água usando uma nanopartícula de ouro opticamente preso como um detector ultra-sensível. As pinças ópticas são geralmente usados por muitos grupos como uma ferramenta experimental multa a aplicar ou medir forças entre as moléculas até a faixa piconewton 12-14. Mais recentemente, a gama de aplicações para pinça óptica foi expandida para observar vibrações acústicas e resolverflutuações nt em meios líquidos, monitorando o movimento de nano e micropartículas que estão confinados em uma armadilha óptica 15. As partículas que são imersos num líquido são submetidos a movimento Browniano. Dentro de uma armadilha óptica, no entanto, este movimento é parcialmente amortecido por um laser induzida, força forte, gradiente. Por conseguinte, a rigidez da armadilha óptica e a localização da partícula no interior do foco do feixe de laser pode ser afinado pela potência de laser. Ao mesmo tempo, é possível revelar características sobre o potencial de captura e a análise da interacção de moléculas com o de partículas através da monitorização do movimento das partículas em função do tempo na armadilha. Esta abordagem torna possível para pegar a freqüência, intensidade e direção do movimento fluídico que é gerado por um objeto em movimento em seu ambiente líquido. Demonstramos como esta ideia geral pode ser aplicada para obter um espectro de o movimento de um indivíduo Nauplius frequência sem o requisitode interferir diretamente com o modelo. Esta abordagem experimental apresenta um novo conceito geral para a observação do comportamento de motilidade das amostras aquáticas de uma forma muito sensível. Para observações sobre as espécies bioindicadoras, isso poderia expandir a atual metodologia para análise de água e pode ser aplicado para obter informações sobre a saúde ea integridade dos ecossistemas aquáticos.
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Protocol
1. Setup Experimental
- Use um microscópio de up-direito e um óleo de condensador de campo escuro com uma abertura numérica (NA) = 1,2 para a iluminação de campo escuro. Utilize uma objectiva de imersão em água com aumento de 100X e uma NA = 1.0 para observações de partículas e trapping. Use um objetivo ar com aumento de 10x e uma NA = 0,2 para seguir o movimento do Nauplius.
- Use uma configuração de pinça óptica com 1.064 nm laser de onda contínua acoplado ao microscópio vertical. Defina a potência do laser da armadilha óptica a 100 mW (medido com um medidor de energia após a objetiva).
- Use uma câmera de alta velocidade CMOS ou uma reflex digital de lente única (DSLR) para detectar e imagem do movimento de partículas de ouro na armadilha óptica e o movimento do Nauplius.
- Usar um filtro de entalhe para evitar que o laser de entrar na câmara.
- Use um medidor de potência para medir a potência do laser após a objetiva.
2. Preparação de Amostras
3. Particle Experiment Rastreamento
- Armadilha uma nanopartícula de ouro com a pinça óptica. Portanto, trazer a 1.064 nm armadilhas a laser perto de uma nanopartícula de ouro que está difundindo em solução movendo o estágio do microscópio. As forças ópticas atraentes puxar a nanopartícula de ouro para o ponto focal do the feixe de laser. A partícula aprisionada não está a difundir mais e em vez mantém a sua posição. Faça um fluxo de vídeo da nanopartícula preso com a câmera DSLR em uma taxa de quadros de 50 Hz por 30 segundos.
- Desligue o laser da pinça óptica e solte a nanopartículas de ouro da armadilha.
- Use um programa de rastreamento de partículas para a leitura da posição da partícula de ouro opticamente preso em cada quadro do fluxo de vídeo. Uma transformação rápida de Fourier (FFT) de xy-posição da partícula ao longo do tempo revela um espectro de freqüência.
NOTA: Aqui, um "IGOR PRO 'código de programa de computador auto-escrito foi utilizado para analisar a posição central da partícula no plano xy com o tempo e para a análise FFT. - Como uma alternativa a um código IGOR auto-escrita usar o programa livremente disponível 'Spots Rastreio' para controlar a partícula no vídeo. Use o software comercial "Origin" para executar a transformação de Fourier dos dados de rastreamento:
- Clique do mouse sobre a partícula visto na primeira foto do fluxo de vídeo e uma região circular de aparecer juros.
- Escolha "simétrica" e "otimizar" na janela do prompt de comando top para otimizar o acompanhamento da partícula.
- Clique do mouse "logging" na janela do prompt de comando superior e escolha uma pasta para guardar os dados. Os dados de monitoramento serão guardados como uma planilha de dados.
- Clique do mouse "video jogo" no prompt de comando janela esquerda do programa de rastreamento e espere até que são analisados todos os quadros do vídeo.
- Feche o programa e abra a planilha de dados salvos com 'Origem'. Defina os valores de coluna como "y 1" e "y 2".
- Definir intervalos de tempo para cada quadro do vídeo como "x" da planilha de dados 'Origem'.
- Marque a x-Posição da coluna e realizar uma FFT, escolhendo "Análise de Dados" e "FFT" na janela do prompt de comando top. Repita o passo para a coluna posição y.
- Traçar as amplitudes do sinal FFT calculado em x-e y-direção em relação a freqüência.
4. Simulação Numérica
- Calcular as α polarizabilidade da partícula de ouro de 60 nm, utilizando o programa de computador 'Mathematica'.
- Utilizar a equação (1) para calcular a polarizabilidade de acordo com Kuwata et al 16.:
(1) - Definir os seguintes três parâmetros no código do programa: a função dielétrica complexa dependente do comprimento de onda da partícula de ouro, o raio de nanopartículas, eo índice de refração do meio circundante.
- Utilizar a equação (1) para calcular a polarizabilidade de acordo com Kuwata et al 16.:
- Use a descrição dos elecdistribuição de campo tric de um feixe focalizado de acordo com Gaussian Agayan et al 17 para calcular as forças ópticas que agem em uma partícula de ouro de 60 nm.:
(2) - . Utilização das equações (3) - (6) a partir de Agayan et al 17 para calcular tanto, o gradiente e dispersar as forças que actuam sobre a partícula:
(3) 
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(6) - No código de programa, definir os parâmetros para a potência do laser, a abertura numérica da oobjective, ea polarizabilidade complexo das nanopartículas.
- Soma-se a força do gradiente ea força de dispersão para calcular a força óptica total atuando sobre a partícula de ouro em uma armadilha óptica.
- . Utilização das equações (3) - (6) a partir de Agayan et al 17 para calcular tanto, o gradiente e dispersar as forças que actuam sobre a partícula:
- Execute a simulação pressionando simultaneamente "Control" e "Enter".
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Representative Results
Uma ilustração esquemática da configuração experimental é mostrado na Figura 1A. A configuração de campo escuro é necessário para detectar opticamente a deslocação de uma partícula de ouro de 60 nm de uma armadilha óptica 15. O comprimento de onda de 1.064 nm para o laser trapping é escolhido para garantir um confinamento estável do detector de partículas de ouro 12,14. Um divisor de feixe no microscópio é utilizado para focar o feixe através de aprisionamento do objectivo e um filtro de entalhe evita que o laser de aprisionamento de entrar no dispositivo de detecção do ensaio. O Nauplius estava realizando movimentos na solução de água em torno do nanopartícula de ouro opticamente preso (Figura 1B). As vibrações fluídicos que são gerados pelo animal propagar através do meio líquido e interagir com a partícula opticamente preso.
Figura 2A mostra uma imagem de campo escuro de uma única nanopartícula de ouro de 60 nm que está preso by o feixe de laser. A cor esverdeada sob iluminação de campo escuro indica sua freqüência de espalhamento em que faixa de comprimento de onda. Observando-se a cor da partícula aprisionada com uma câmara DSLR assegura que apenas uma nanopartícula plasmônica é preso pelo laser focado desde aprisionamento de uma segunda partícula iria resultar numa alteração de cor devido ao acoplamento plasmônica. A distribuição calculado da força óptica total que mantém as partículas confinadas na armadilha é mostrado na Figura 2B. Sem qualquer vibração fluídica externo, o deslocamento das nanopartículas plasmonic preso mostra uma distribuição de Gauss, uma vez que o seu movimento é exclusivamente sujeitos a movimento Browniano (Figura 2C). Assim que um Nauplius é adicionado à amostra, o seu movimento cria uma interacção fluídica com o detector de partículas. A nanopartícula na armadilha óptica começa a oscilar no sentido da interacção do fluido até uma amplitude de oscilação de 100 nm (Figura 2D).
Os movimentos de várias larvas Nauplius foram analisados de forma independente, monitorando seu comportamento de natação com uma câmera CMOS de alta velocidade. Um exemplo é mostrado na Figura 3A. Uma oscilação completa do movimento periódico do braço principal das grandes antenas tem 148 ms, o que corresponde a uma frequência de cerca de 6,75 Hz. Observou-se o mesmo Nauplius durante um período de vários segundos e também diferente Náuplios partir da mesma amostra. A partir da observação direta observamos freqüências para os cursos antenas na faixa entre 4,1 e 7,2 Hz.
Figura 3B e 3C mostram o espectro de uma nanopartícula de ouro preso sem freqüência (curva preta) e com (curva vermelha) um Nauplius presente na gota de água observado. Quase nenhum sinal pode ser visto na direcção x do espectro de Fourier da partícula. Em contraste, a direcção y do espectro de frequências mostra uma resp forteonse. Isto pode ser explicado pela posição relativa do Nauplius com respeito à armadilha de partícula. A nanopartícula detecta apenas as vibrações que são gerados pelo organismo. Um sinal forte na direcção y, portanto, indica a direcção das oscilações fluídicos e também a posição do animal (cf. Figura 2D). Transformando o deslocamento das partículas trajectória dependente do tempo para o espaço de Fourier, por conseguinte, conduz a uma direcção diferença dependente da intensidade de sinal do espectro de frequência. A faixa de freqüência ampla presente em nossas medições é consistente com a motilidade organismo net. Os movimentos dos dois principais antenas da Nauplius não são a fonte exclusiva de deslocamento de líquidos. Movimentos de pares de antenas mais pequenas e outras saliências do corpo também contribuir para o sinal observado. Para todas as medições, encontramos máxima de frequência entre 3,0 e 7,2 Hz, para o movimento Nauplius, o que está em bom acordo com a frequ directamente observadafolhear transparências do microrganismo biológica e também se encaixa bem para a faixa de freqüência esperada para um Nauplius em um estágio larval 6,8-10.
Ilustração Figura 1. Esquemática da instalação experimental. A) configuração de campo escuro e pinça óptica. Um divisor de feixe no microscópio é utilizado para focar o feixe de aprisionamento (1.064 nm, de onda contínua) para a fase de microscópio de campo escuro. Um filtro de entalhe impede o laser de entrar na alta velocidade ou câmera DSLR. B) Uma nanopartícula de ouro é preso na pinça óptica para detectar as vibrações microfluídicos de uma Nauplius no meio circundante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A armadilha óptica de uma nanopartícula de ouro. A) imagem de campo escuro de uma única partícula de ouro preso. B) Cálculo da força total atuando sobre a partícula em uma armadilha óptica. O comprimento de onda do laser é 1064 nm e potência de 100 mW foi medida no âmbito do objectivo. A força é representada na região de 2 mm em torno do ponto focal. C) xy-deslocamento de uma partícula de ouro numa armadilha óptica. O movimento das partículas não é perturbado por vibrações fluídicas e apenas causada pelo movimento browniano. D) xy-deslocamento das partículas de ouro na armadilha, após a adição de um Nauplius para o líquido. O fluxo de microfluidos gerado pelo animal causa uma distorção de frequência dependente do deslocamento de nanopartículas de ouro na direcção y.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: espectros de freqüência de uma nanopartícula de ouro preso ao lado de um Nauplius natação. A) Antena pancadas de um único Nauplius em diferentes pontos de tempo. . Uma oscilação completa do movimento periódico das antenas principal leva cerca de 148 milisegundos (6,75 Hz) B) curva de Black: espectro de frequência do deslocamento de uma nanopartícula opticamente preso sem ser perturbado em direção x que foi tomado como referência. Curva vermelha: Espectro de frequências da partícula de ouro ao lado de um Nauplius nadando em direção x. O espectro não mostra um sinal forte, devido à posição relativa do Nauplius ao particl opticamente presoe. Detalhe: Ilustração esquemática da posição Nauplius e nanopartículas de ouro durante o experimento. O fluxo gerado pelo Nauplius movimento é principalmente apontando na direção y C) Black curva:. Referência espectro da partícula de ouro imperturbável na direção y freqüência. Curva vermelha:. Espectro de frequência do deslocamento de nanopartículas de ouro na presença de um Nauplius Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Microscopia de campo escuro é uma poderosa ferramenta para a visualização de nanopartículas de ouro com dimensões inferiores ao limite de difração óptica, uma vez que a seção de espalhamento transversal das nanopartículas metálicas superior à sua seção transversal geométrica (cf. Figura 2A) 18. Em uma configuração de pinça, esta abordagem ainda permite distinguir se apenas um único ou vários nanopartículas de ouro são presos pelo feixe de laser porque acoplamento plasmônica entre as partículas provoca um desvio para o vermelho da freqüência de ressonância de plasma de 15. Microscopia de campo escuro com uma configuração de pinça óptica, portanto, fornece inúmeras possibilidades experimentais novas e muito úteis, mas a combinação não é auto-evidente. Para a captura óptica estável é necessário um feixe de laser focado fortemente, uma vez que a origem de uma armadilha óptica em três dimensões é causada por um gradiente de densidade de campo óptico. Normalmente, com objectivos elevadas aberturas numéricas (NA = 1,3-1,4) são utilizados para pinçaconfigurações para alcançar um apertado de focalização do laser de 19. A mais elevada NA de disponíveis comercialmente condensadores óleo de campo escuro, no entanto, é de 1,2. Isso limita o leque de objectivos que podem ser usados para capturar a partícula NA <1,2 por objetivos maiores NA suportar o problema que não só dispersos, mas também a luz em linha reta são coletados pela lente objetiva. Para nossa configuração, somos capazes de alcançar uma captura óptica estável usando uma objetiva de imersão em água com um NA = 1.0 e um condensador de campo escuro com uma NA = 1.2. Isto é possível, porque a expansão do feixe de laser na frente do microscópio conduziu a um sobre-enchimento da abertura traseira do objectivo e, por conseguinte, para uma quantidade suficiente de focagem do laser (mesmo com uma NA de apenas 1,0).
Aprisionamento estável de nanopartículas de ouro plasmônica também é fortemente dependente do comprimento de onda do laser de aprisionamento 12-14. Em nossos experimentos, um comprimento de onda de 1.064 nm foi escolhido para o bec partícula trappingause este comprimento de onda é muito vermelho-mudou de ressonância de plasma de comprimento de onda da partícula em ~ 530 nm. Isso é importante para um trapping estável desde que as forças de gradiente ópticos que atuam sobre a partícula de ouro são dominantes para este comprimento de onda, enquanto as forças de dispersão, que se originam a partir de uma transferência de momento dos fótons espalhados e absorvidos, são mínimas. Ambos, de gradiente e força espalhando, fazer com que a partícula se mover para diferentes direções, mas só as forças de gradiente levar a uma captura óptica estável, uma vez que estão apontando para a região de maior intensidade, que é o foco do feixe de laser. Scattering forças, em contraste, são aponta ao longo do eixo do fluxo de energia do feixe de luz. Em um comprimento de onda próximo da ressonância das partículas, dispersão da luz torna-se forte e dispersando as forças dominantes. As partículas neste caso são empurrados e não preso pelo feixe de laser, mesmo para além do plano focal 20,21.
Um aprisionamento muito estável das partículas é umrequisito para detectar qualquer pequena perturbação microfluídico externo e para alcançar um sinal melhorado para relação de ruído no espectro de frequência do tempo de deslocamento das partículas dependente na armadilha óptica. Ao mesmo tempo, uma fonte de laser de alta pode conduzir a um aquecimento substancial da nanopartícula, que poderia provocar efeitos térmicos indesejados, incluindo o aquecimento de toda a amostra de água. Para alcançar um sinal distinto no espaço de Fourier da partícula ambos os factores têm de ser considerados e a experiência optimizado de tal forma que os efeitos de aquecimento são minimizados, mas aprisionamento estável suficiente seja atingida. É também importante salientar que as condições da amostra de água, tais como a temperatura e pH, pode ter um impacto sobre a viabilidade das larvas durante a medição, e que estes factores têm, assim, de ser controlado e mantido constante. Por isso, todas as medições realizadas à temperatura ambiente (~ 20 ° C) e a um pH de cerca de 7,5.
Em geral, tele método para detectar o movimento de larvas Nauplius, acompanhando a posição de uma única nanopartícula de ouro em uma armadilha óptica representa uma forma não-invasiva para analisar a atividade da amostra aquáticos sem a necessidade de perturbar ou mesmo ver o Nauplius durante a medição. Além disso, a direcção das oscilações de microfluidos pode ser determinada através da análise do espectro de Fourier dependente direcção do deslocamento da nanopartícula. A configuração da pinça óptica torna assim possível detectar mesmo as pequenas vibrações fluídicos numa solução aquosa com alta sensibilidade. No futuro, esta abordagem poderia ser estendida para distinguir entre diferentes tipos de organismos, a uma amostra de água e, ao mesmo tempo. Além disso, esta abordagem de utilização de nanopartículas de ouro como um detector sensível não é restrito à medição de apenas larvas Nauplius e pode, em princípio, ser aplicados para medir o fluxo gerado por qualquer objectos muito pequenos, tais como células isoladas e possibly até mesmo bactérias.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O apoio financeiro pela ERC através da avançada Investigator Grant HYMEM, pelo DFG através da Iniciativa Nanosystems Munich (NIM) e através do Sonderforschungsbereich (SFB1032), projeto A8 é reconhecido agradecimento. Somos gratos ao Dr. Alexander Ohlinger, Dr. Sol Carretero-Palacios e Spas Nedev de apoio e discussões frutíferas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Zeiss Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | 490035-0012-000 | dark field illumination |
| Water objective Achroplan | Carl Zeiss | 440087 | 100X magnification, NA = 1.0 |
| Air objective Epiplan | Carl Zeiss | 442934 | 10X magnification, NA = 0.2 |
| Dark field oil condenser | Carl Zeiss | 445323 | NA = 1.2 |
| Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL | Cobolt | 1064-05-01-2000-500 | 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00 |
| Beam expander | Edmund Optics | Part no. 1064 2-8X 64414 | |
| High Speed Camera Dimax HD | PCO. Germany | ||
| Color Camera Canon EOS 500 D | Canon | FAQ-ID: 8201395700 | |
| Notch filter StopLine 532/1064 | Semrock | A11149-711265 | Part no. NF01-532U |
| Water | |||
| Nauplius Artemia salina | |||
| Gold colloid | BBInternational | Batch 13741 | Diameter 60 nm |
| MQMie Version 3.2 | Dr. Michael Quinten | ||
| Mathematica 8.0 | Wolfram | ||
| Comsol Multiphysics 4.0 | COMSOL, Inc. |
References
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