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Engineering

Analizando el movimiento de la Nauplio ' Published: July 15, 2014 doi: 10.3791/51502

Summary

Utilizamos el seguimiento óptico de nanopartículas plasmónica para investigar y caracterizar los movimientos de frecuencia de los organismos acuáticos.

Abstract

Se demuestra cómo pinzas ópticas pueden proporcionar una herramienta sensible para analizar las vibraciones de fluidos generados por el movimiento de pequeños organismos acuáticos. Una sola nanopartícula de oro en poder de un pinzas ópticas se utiliza como un sensor para cuantificar el movimiento rítmico de una larva nauplio (Artemia salina) en una muestra de agua. Esto se consigue mediante el control de desplazamiento dependiente del tiempo de la nanopartícula atrapados como consecuencia de la actividad Nauplio. Un análisis de Fourier de la posición de la nanopartícula a continuación, se obtiene un espectro de frecuencias que es característica para el movimiento de las especies observadas. Este experimento demuestra la capacidad de este método para medir y caracterizar la actividad de pequeña larvas acuáticas sin el requisito para observar directamente y para obtener información acerca de la posición de las larvas con respecto a la partícula atrapada. En general, este enfoque podría dar una idea de la vitalidad de ciertas especies que se encuentran en un acuático ecosystem y podría ampliar la gama de métodos convencionales para el análisis de muestras de agua.

Introduction

Evaluación de la calidad del agua sobre la base de indicadores químicos y biológicos es fundamental para obtener una perspectiva de las condiciones estatales y ambientales de un ecosistema acuático 1-3. Los métodos clásicos para el análisis químico de agua se basan en las propiedades organolépticas o la determinación de los parámetros fisicoquímicos. Los indicadores biológicos, por otro lado, son las especies animales cuya presencia y viabilidad dar una idea de las condiciones ambientales y el efecto de los contaminantes de un ecosistema que se producen pulg ejemplos típicos de bioindicadores son copépodos, un grupo de pequeños crustáceos de agua, que puede pueden encontrar en casi cualquier hábitat de agua 4,5. La observación de la actividad y la viabilidad de estas especies a partir de una muestra de agua de este modo se puede utilizar para obtener información sobre las condiciones generales de un ecosistema 5. Las larvas de copépodos, que son llamadas nauplios, utilice golpes rítmicos de sus antenas (cada larva tiene tres pares de appendabios en su región de la cabeza) para nadar en el agua 6. La frecuencia y la intensidad de estos golpes es por lo tanto un indicador directo de la edad, condición física y las condiciones ambientales del animal 7-10. Cualquier investigación sobre estos especímenes se hacen generalmente con un microscopio observando y contando los golpes de antena del Nauplii directamente. Debido a su tamaño (~ 100-500 m) 11, esto a menudo requiere hacer mediciones, ya sea uno a uno o de fijar una sola Nauplio a un sustrato.

Aquí, nos demuestran un nuevo enfoque para observar la actividad de las larvas de copépodos en muestras de agua mediante el uso de una nanopartícula de oro atrapada ópticamente como detector ultrasensible. Las pinzas ópticas suelen ser utilizados por muchos grupos como una herramienta experimental bien aplicar o medir fuerzas entre las moléculas hasta el rango picoNewton 12-14. Más recientemente, la gama de aplicaciones para las pinzas ópticas se ha ampliado para observar las vibraciones acústicas y resolverfluctuaciones nt en medios líquidos mediante el control del movimiento de las nano-y micropartículas que están confinados en una trampa óptica 15. Las partículas que están inmersas en un líquido se someten a movimiento browniano. Dentro de una trampa óptica, sin embargo, este movimiento está parcialmente amortiguado por una, inducida por láser, fuerza del gradiente fuerte. Por lo tanto, la rigidez de la trampa óptica y la localización de la partícula dentro del foco del haz de láser pueden ajustarse por la potencia del láser. Al mismo tiempo, es posible revelar características sobre el potencial de atrapamiento y para analizar las interacciones de moléculas con la partícula mediante el control de la movimiento de las partículas en función del tiempo en la trampa. Este enfoque hace posible recoger la frecuencia, la intensidad y la dirección del movimiento de fluido que es generada por un objeto en movimiento en su entorno líquido. Se demuestra cómo esta idea general se puede aplicar para obtener un espectro de frecuencia de movimiento de un nauplio individuo sin el requisitopara interferir directamente con la muestra. Este enfoque experimental introduce un nuevo concepto general para la observación del comportamiento de la movilidad de los especímenes acuáticos de una manera muy sensible. Para las observaciones sobre las especies bioindicadores, esto podría ampliar la actual metodología para el análisis de agua y podría ser aplicado para obtener información sobre la salud y la integridad de los ecosistemas acuáticos.

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Protocol

1. Configuración Experimental

  1. Utilice un microscopio-encima de la derecha y un condensador de campo oscuro de aceite con una apertura numérica (NA) = 1,2 para la iluminación de campo oscuro. Utilice un objetivo de inmersión en agua con un aumento de 100X y un NA = 1,0 para las observaciones de partículas y atrapamiento. Utilice un objetivo de aire con un aumento de 10X y una NA = 0,2 para seguir el movimiento de la Nauplio.
  2. Utilice una configuración de pinzas ópticas con una nm láser de onda continua 1064 acoplada al microscopio-encima de la derecha. Establecer la potencia del láser de la trampa óptica a 100 mW (medido con un medidor de potencia después de que el objetivo).
  3. Utilice una cámara CMOS de alta velocidad o una réflex digital de lente única (DSLR) para detectar e imagen del movimiento de las partículas de oro en la trampa óptica y el movimiento de la Nauplio.
  4. Utilice un filtro de muesca para impedir que el láser entra en la cámara.
  5. Utilice un medidor de potencia para medir la potencia del láser después de que el objetivo.

2. Preparación de la muestra

  • Pipetear una gota de agua (180 l) en un portaobjetos de vidrio de microscopio y la posición de la muestra en el microscopio de campo oscuro.
  • Pipetear una Nauplio de un pequeño tanque de agua a la gota de agua.
  • Utilice un objetivo de aire 10 veces para observar el movimiento de la Nauplio en la solución y grabar una secuencia de vídeo.
  • Utilice una nanopartícula de oro con un diámetro de 60 nm como un detector para observar el movimiento del fluido generada por el nauplio. Por lo tanto, añadir 5 l de una solución de partículas altamente diluido en la gota de agua, de manera que aproximadamente una partícula se puede ver en el campo de visión con un objetivo de inmersión en agua 100X.
  • 3. Experimento de seguimiento de partículas

    1. Trampa una nanopartícula de oro con las pinzas ópticas. Por lo tanto, llevar el 1,064 nm láser atrapando cerca de una nanopartícula de oro que se difunde en solución moviendo la platina del microscopio. Las fuerzas ópticas atractivas tiran de la nanopartícula de oro hacia el punto focal de thhaz de láser de correo. La partícula atrapada no se difunde más y más bien mantiene su posición. Tome una secuencia de vídeo de la nanopartícula atrapado con la cámara réflex digital a una velocidad de 50 Hz durante 30 s.
    2. Apague el láser de la pinza óptica y suelte la nanopartícula de oro de la trampa.
    3. Utilice un programa de rastreo de partículas a Lectura de la posición de la partícula de oro atrapada ópticamente en cada fotograma de la secuencia de vídeo. Una transformación rápida de Fourier (FFT) de xy-posición de la partícula en el tiempo revela un espectro de frecuencia.
      NOTA: En este caso, se ha utilizado un código de programa informático 'IGOR PRO' auto-escrito para analizar la posición del centro de partícula en el plano xy con el tiempo y para el análisis FFT.
    4. Como alternativa a un código IGOR auto-escrita utilizar el programa de libre acceso 'Video SPOT Rastreador' para el seguimiento de la partícula en el video. Utilice el software comercial "Origen" para llevar a cabo la transformación de Fourier de los datos de seguimiento: Arrastre el archivo de vídeo en el programa abierto 'Video SPOT Rastreador'.
    5. Pulse con el ratón sobre la partícula se ve en la primera imagen de la secuencia de vídeo y una región circular de que aparezca de interés.
    6. Elija "simétrico" y "optimizar" en la ventana de comandos superior para optimizar el seguimiento de la partícula.
    7. Clic del ratón "tala" en la ventana de comandos superior y seleccione una carpeta para guardar los datos. Los datos de seguimiento se guardarán como una hoja de cálculo de datos.
    8. Clic del ratón "juego de video" en la ventana de comandos izquierda del programa de seguimiento y espere hasta que se analizan todos los fotogramas del vídeo.
    9. Cierra el programa y abrir la hoja de cálculo de datos guardado con 'Origen'. Establezca los valores de columna como "y 1" e "y 2".
    10. Establecer intervalos de tiempo para cada fotograma de vídeo como "x" en la hoja de cálculo de datos 'Origen'.
    11. Marque la x-Posición de la columna y realizar una FFT eligiendo "Análisis de datos" y "FFT" en la ventana de comandos de arriba. Repetir el paso de la columna de la posición y.
    12. Trazar las amplitudes de la señal FFT calculada en x-e y-dirección frente a la frecuencia.

    4. Simulación

    1. Calcular los α polarizabilidad de la partícula de oro de 60 nm mediante el uso del programa de ordenador 'Mathematica'.
      1. Utilizar la ecuación (1) para calcular la polarizabilidad de acuerdo con Kuwata et al 16.:
        Ecuación 1 (1)
      2. Definir los tres parámetros siguientes en el código de programa: el complejo de función dieléctrica dependiente de la longitud de onda de la partícula de oro, el radio de nanopartículas, y el índice de refracción del medio circundante.
    2. Utilizar la descripción de los elecdistribución del campo tric de un haz gaussiano centrado según Agayan et al 17 para el cálculo de las fuerzas ópticas que actúan sobre una partícula de oro de 60 nm.:
      Ecuación 2 (2)
      1. . Usar ecuaciones (3) - (6) de Agayan et al 17 para calcular tanto, el gradiente y la dispersión de las fuerzas que actúan sobre la partícula:
        Ecuación 3 (3)
        Ecuación 4 (4)
        Ecuación 5 (5)
        Ecuación 6 (6)
      2. En el código del programa, definir los parámetros para la potencia del láser, la apertura numérica de la OBJETIVO, y el complejo polarizabilidad de la nanopartícula.
      3. Sumar la fuerza del gradiente y la fuerza de dispersión para calcular la fuerza óptica total que actúa sobre la partícula de oro en una trampa óptica.
    3. Ejecutar la simulación pulsando simultáneamente "Control" y "Enter".

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    Representative Results

    Una ilustración esquemática de la configuración experimental se muestra en la Figura 1A. Una configuración de campo oscuro es necesario detectar ópticamente el desplazamiento de una partícula de oro de 60 nm en una trampa óptica 15. La longitud de onda de 1064 nm para el láser de captura se elige para garantizar un confinamiento estable del detector de 12,14 partícula de oro. Un divisor de haz en el microscopio se utiliza para enfocar el haz de captura a través de la objetivo y un filtro de muesca evita que el láser de captura de entrar en el dispositivo de detección del experimento. El Nauplio estaba realizando movimientos en la solución de agua que rodea la nanopartícula de oro atrapada ópticamente (Figura 1B). Las vibraciones de fluidos que se generan por el animal se propagan a través del medio líquido e interactuar con la partícula atrapada ópticamente.

    La Figura 2A muestra una imagen de campo oscuro de una sola nanopartícula de oro de 60 nm que está atrapado By el haz de láser. El color verdoso bajo iluminación de campo oscuro indica su frecuencia de dispersión en ese rango de longitud de onda. Observando el color de la partícula atrapada con una cámara DSLR se asegura de que sólo uno de nanopartículas plasmónica es atrapada por el láser enfocado desde la captura de una segunda partícula daría lugar a un cambio de color debido al acoplamiento plasmónica. La distribución calculada de la fuerza óptica total que mantiene la partícula confinada en la trampa se muestra en la Figura 2B. Sin cualquier vibración fluídico externa, el desplazamiento de la nanopartícula plasmónica atrapado muestra una distribución gaussiana, ya que su movimiento es exclusivamente sujeto a movimiento browniano (Figura 2C). Tan pronto como se añade un nauplio a la muestra, su movimiento crea una interacción fluida con el detector de partículas. La nanopartícula en la trampa óptica comienza a oscilar en la dirección de la interacción de fluido hasta una amplitud de oscilación de 100 nm (Figura 2D).

    Los movimientos de varias larvas nauplio se analizaron de forma independiente mediante el control de su comportamiento de natación con una cámara CMOS de alta velocidad. Un ejemplo se muestra en la Figura 3A. Una oscilación completa del movimiento periódico del brazo principal de la gran antenas toma 148 mseg, que corresponde a una frecuencia de alrededor de 6,75 Hz. Se observó el mismo nauplio durante un período de tiempo de varios segundos y también diferente nauplios de la misma muestra. A partir de la observación directa se observó frecuencias para los trazos de antenas en el rango entre 4,1 y 7,2 Hz.

    La figura 3B y la figura 3C muestran los espectros de frecuencia de una nanopartícula de oro atrapado sin (curva de negro) y con (curva roja) un presente Nauplio en la gota de agua observado. Casi no hay señal se puede ver en la dirección x del espectro de Fourier de la partícula. En contraste, la dirección y del espectro de frecuencia muestra una fuerte respOnse. Esto se puede explicar por la posición relativa de la Nauplio con respecto a la trampa de partículas. La nanopartícula detecta sólo las vibraciones que se generan por el organismo. Una señal fuerte en dirección-y, por tanto, indica la dirección de las oscilaciones de fluidos y también la posición del animal (cp. Figura 2D). La transformación de la partícula desplazamiento trayectoria dependiente del tiempo en el espacio de Fourier, por lo tanto conduce a una diferencia dependiente de la dirección en la intensidad de la señal de los espectros de frecuencia. El amplio rango de frecuencia presente en nuestras mediciones es consistente con la motilidad neta organismo. Los movimientos de las dos antenas principales de la nauplio no son la fuente exclusiva de desplazamiento de líquido. Movimientos de pares de antenas más pequeñas y otras protuberancias del cuerpo también contribuyen a la señal observada. Para todas las mediciones, encontramos máximos de frecuencia entre 3,0 y 7,2 Hz para el movimiento Nauplio, que está en una buena conformidad a la Frecu observado directamenteparencias del microorganismo biológica y también se adapta bien a la gama de frecuencia esperada para un Nauplio en una etapa larval 6,8-10.

    Figura 1
    Figura 1. Ilustración esquemática de la configuración experimental. A) Configuración de campo oscuro y pinzas ópticas. Un divisor de haz en el microscopio se utiliza para enfocar el haz de captura (1.064 nm, de onda continua) a la platina del microscopio de campo oscuro. Un filtro de muesca evita que el láser de entrar en la alta velocidad o cámara DSLR. B) Una nanopartícula de oro se encuentra atrapada en la pinza óptica para detectar las vibraciones de microfluidos de uno Nauplio en el medio circundante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2
    Figura 2: Trampas ópticas de una nanopartícula de oro. A) Imagen de campo oscuro de una sola partícula de oro atrapado. B) Cálculo de la fuerza total que actúa sobre la partícula en una trampa óptica. La longitud de onda de láser es 1064 nm y la potencia de 100 mW se midió bajo el objetivo. La fuerza se representa en la región de 2 m alrededor del punto focal. C) XY-desplazamiento de una partícula de oro en una trampa óptica. El movimiento de las partículas no es perturbado por las vibraciones de fluidos y sólo causada por el movimiento browniano. D) XY-desplazamiento de la partícula de oro en la trampa, después de la adición de un nauplio al líquido. El flujo de microfluidos generada por el animal provoca una distorsión dependiente de la frecuencia del desplazamiento de nanopartículas de oro en dirección-y.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    Figura 3: espectros de frecuencia de una nanopartícula de oro atrapado al lado de un nauplio de natación. A) Antenas golpes de un solo Nauplio en diferentes puntos de tiempo. . Una oscilación completa del movimiento periódico de las antenas principal toma alrededor de 148 mseg (6,75 Hz) B) curva de Negro: espectro de frecuencia de desplazamiento de un nanopartícula sin perturbaciones atrapado ópticamente en la dirección x que se tomó como referencia. Curva roja: espectro de frecuencia de la partícula de oro junto a un nauplio de natación en la dirección x. El espectro no muestra una fuerte señal debido a la posición relativa de la nauplio a la particl ópticamente atrapadoe. Recuadro: Ilustración esquemática de la posición de Nauplio y de nanopartículas de oro durante el experimento. El flujo generado por la Nauplio movimiento está apuntando principalmente en la dirección-y C) curva de Negro:. Espectro de frecuencia de referencia de la partícula de oro sin perturbaciones en dirección-y. Curva roja:. Espectro de frecuencia del desplazamiento de nanopartículas de oro en presencia de un nauplio Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Microscopía de campo oscuro es una poderosa herramienta para la visualización de las nanopartículas de oro con dimensiones por debajo del límite de difracción óptica, puesto que la sección transversal de dispersión de las nanopartículas de metal excede su sección transversal geométrica (cp. Figura 2A) 18. En una configuración de pinza, este enfoque permite incluso distinguir si sólo un único o múltiples nanopartículas de oro son atrapados por el haz de láser porque acoplamiento plasmónica entre las partículas provoca un desplazamiento hacia el rojo de la frecuencia de resonancia de plasmón 15. Microscopía de campo oscuro con una configuración de pinzas ópticas, por tanto, ofrece numerosas posibilidades de experimentación de nuevas y muy útiles, pero la combinación no es evidente por sí mismo. Para captura óptica estable se requiere un haz de láser enfocado fuertemente, ya que el origen de una trampa óptica en tres dimensiones es causada por un gradiente de la densidad de campo óptico. Por lo general, los objetivos con aperturas numéricas altas (NA = 1.3 a 1.4) se utilizan para la pinzaconfiguraciones para lograr un apretado de enfoque del láser 19. El más alto de NA disponibles comercialmente condensadores de aceite de campo oscuro, sin embargo, es de 1.2. Esto limita la gama de objetivos que pueden ser utilizados para la captura de la partícula a NA <1,2 porque mayores objetivos de NA tienen el problema de que no sólo se dispersa, sino también la luz recta es recogida por la lente del objetivo. Para nuestra configuración, que son capaces de lograr una captura óptica estable utilizando un objetivo de inmersión en agua con un NA = 1,0 y un condensador de campo oscuro con un NA = 1,2. Esto es posible, porque la expansión del haz de láser en frente del microscopio condujo a un llenado excesivo de la abertura posterior de la objetivo y por lo tanto a una suficiente de enfoque del láser (incluso con un NA de sólo 1,0).

    Captura estable de una nanopartícula de oro plasmónica también es fuertemente dependiente de la longitud de onda del láser de 12-14 atrapamiento. En nuestros experimentos, una longitud de onda de 1064 nm fue elegido para el bec atrapamiento de partículasausa esta longitud de onda es mucho rojo pasado de la longitud de onda de resonancia de plasmones de la partícula en ~ 530 nm. Esto es importante para una captura estable desde que las fuerzas de gradiente ópticas que actúan sobre la partícula de oro son dominantes para esta longitud de onda, mientras que la dispersión de fuerzas, que se originan a partir de una transferencia de energía cinética de los fotones dispersados ​​y absorbidos, son mínimas. Ambos, gradiente y la fuerza de dispersión, causan la partícula para mover en diferentes direcciones, pero sólo fuerzas de gradiente conducen a una captura óptica estable desde que están apuntando hacia la región de mayor intensidad que es el foco del haz de láser. Dispersión de las fuerzas, en cambio, están apuntando a lo largo del eje del flujo de energía del haz de luz. En una longitud de onda próxima a la resonancia de las partículas, la dispersión de la luz se vuelve fuerte y dispersando las fuerzas dominantes. Las partículas en este caso son empujados y no atrapados por el haz de láser, incluso más allá del plano focal 20,21.

    Una captura muy estable de la partícula es unarequisito para detectar cualquier pequeña perturbación de microfluidos externa y para lograr una señal mejorada a ruido en el espectro de frecuencias a partir del desplazamiento de partículas dependiente del tiempo en la trampa óptica. Al mismo tiempo, un alto poder de láser puede provocar un calentamiento sustancial de la nanopartícula, que podría inducir efectos térmicos no deseados incluyendo la calefacción de toda la muestra de agua. Para lograr una señal distinta en el espacio de Fourier de la partícula ambos factores tienen que ser considerados y el experimento optimizado de tal manera que los efectos de calentamiento se reducen al mínimo, pero se logra suficiente atrapamiento estable. También es importante señalar que las condiciones de la muestra de agua, tales como la temperatura y el pH, podrían tener un impacto en la viabilidad de las larvas durante la medición, y que por lo tanto estos factores necesitan ser controlada y se mantiene constante. Para ello hemos realizado todas las mediciones a temperatura ambiente (~ 20 º C) y a un pH de alrededor de 7,5.

    En general, tél método para detectar el movimiento de las larvas de nauplio mediante el seguimiento de la posición de una única nanopartícula de oro en una trampa óptica representa una manera no invasiva para analizar la actividad de la muestra acuáticos sin el requisito de perturbar o incluso ver el nauplio durante la medición. Además, la dirección de las oscilaciones de microfluidos se puede determinar mediante el análisis de la dirección espectro de Fourier depende del desplazamiento de la nanopartícula. Así pues, la configuración de pinzas ópticas hace posible detectar incluso pequeñas vibraciones de fluidos en una solución acuosa con alta sensibilidad. En el futuro, este enfoque podría ser extendido para distinguir entre diferentes tipos de organismos en una muestra de agua y, al mismo tiempo. Además, este enfoque de la utilización de una nanopartícula de oro como un detector sensible no se limita a la medición de sólo larvas de nauplio y puede, en principio, aplicarse a medir cualquier flujo generado por objetos mucho más pequeños, tales como células individuales y PObacterias ssibly incluso.

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    Disclosures

    Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

    Acknowledgments

    El apoyo financiero de la ERC a través del Advanced Investigator subvención HYMEM, por la DFG a través de la Iniciativa de nanosistemas Múnich (NIM) ya través de la Sonderforschungsbereich (SFB1032), proyecto A8 se agradece. Estamos agradecidos con el Dr. Alexander Ohlinger, Dr. Sol Carretero-Palacios y spas Nedev de apoyo y fructíferos debates.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Microscope Zeiss Axio Scope.A1 Carl Zeiss 490035-0012-000 dark field illumination
    Water objective Achroplan Carl Zeiss 440087 100X magnification, NA = 1.0
    Air objective Epiplan Carl Zeiss 442934 10X magnification, NA = 0.2
    Dark field oil condenser Carl Zeiss 445323 NA = 1.2
    Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL Cobolt 1064-05-01-2000-500 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00
    Beam expander Edmund Optics Part no. 1064 2-8X 64414
    High Speed Camera Dimax HD PCO. Germany
    Color Camera Canon EOS 500 D  Canon FAQ-ID: 8201395700
    Notch filter StopLine 532/1064 Semrock A11149-711265 Part no. NF01-532U
    Water 
    Nauplius Artemia salina
    Gold colloid BBInternational Batch 13741  Diameter 60 nm
    MQMie Version 3.2  Dr. Michael Quinten
    Mathematica 8.0 Wolfram
    Comsol Multiphysics 4.0  COMSOL, Inc.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Kirchner, S. R., Fedoruk, M.,More

    Kirchner, S. R., Fedoruk, M., Lohmüller, T., Feldmann, J. Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (89), e51502, doi:10.3791/51502 (2014).

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