Summary
Nous utilisons suivi optique de nanoparticules plasmoniques à sonder et à caractériser les mouvements de fréquence d'organismes aquatiques.
Abstract
Nous montrons comment pinces optiques peuvent fournir un outil sensible pour analyser les vibrations fluidiques générées par le mouvement de petits organismes aquatiques. Une nanoparticule d'or unique détenu par une pince optique est utilisé comme un capteur de quantifier le mouvement rythmique d'une larve Nauplios (Artemia salina) dans un échantillon d'eau. Ceci est réalisé en surveillant le déplacement dépendant de la nanoparticule piégé de temps comme une conséquence de l'activité Nauplios. Une analyse de Fourier de la position de la nanoparticule obtient ainsi un spectre de fréquence qui est caractéristique pour le mouvement des espèces observées. Cette expérience démontre la capacité de cette méthode pour mesurer et caractériser l'activité des petites larves aquatiques sans l'obligation de les observer directement et à obtenir des informations sur la position des larves par rapport à la particule piégée. Dans l'ensemble, cette approche pourrait donner un aperçu de la vitalité de certaines espèces trouvées dans un e aquatiquecosystem et pourrait élargir l'éventail des méthodes classiques d'analyse des échantillons d'eau.
Introduction
évaluation de la qualité de l'eau basée sur des indicateurs chimiques et biologiques est d'une importance fondamentale pour mieux comprendre les conditions de l'Etat et de l'environnement d'un écosystème aquatique 1-3. Les méthodes classiques d'analyse chimique de l'eau sont basées sur les propriétés organoleptiques ou la détermination des paramètres physico-chimiques. Les indicateurs biologiques, d'autre part, sont des espèces animales dont la présence et la viabilité donner un aperçu sur les conditions environnementales et l'effet des polluants pour un écosystème qui se produisent po exemples typiques de bio-indicateurs sont copépodes, un groupe de petits crustacés d'eau, qui peut être trouvé dans presque toutes les 4,5 de l'habitat de l'eau. Observer l'activité et la viabilité de ces espèces à partir d'un échantillon d'eau peut ainsi être utilisée pour obtenir des informations sur les conditions générales de l'écosystème 5. Les larves de copépodes, qui sont appelés Nauplii, utilisez coups rythmiques de leurs antennes (larve possède trois paires de appendages à leur région de la tête) de nager dans l'eau 6. La fréquence et l'intensité de ces coups est ainsi un indicateur direct de l'âge, la condition physique, et les conditions environnementales de l'animal 7-10. Toutes les enquêtes sur ces spécimens sont généralement effectués avec un microscope par l'observation et le comptage des coups d'antenne de l'Nauplii directement. En raison de leur taille (~ 100-500 um) 11, cela nécessite souvent de faire des mesures soit un par un ou de fixer un seul Nauplios à un substrat.
Ici, nous démontrons une nouvelle approche pour observer l'activité de copépodes larves dans les échantillons d'eau à l'aide d'une nanoparticule d'or optiquement piégé comme un détecteur ultra-sensible. Pinces optiques sont généralement utilisés par de nombreux groupes comme un outil expérimental amende à appliquer ou mesurer des forces entre les molécules jusqu'à la plage de piconewton 12-14. Plus récemment, la gamme d'applications pour les pinces optiques a été élargie pour observer les vibrations acoustiques et résoudrefluctuations nt en milieu liquide en surveillant le mouvement de nano-et microparticules qui sont confinés dans un piège optique 15. Les particules qui sont immergés dans un liquide sont soumis à un mouvement brownien. L'intérieur d'un piège optique, cependant, cette motion est partiellement atténué par une forte, induite par laser, la force de gradient. Par conséquent, la rigidité du piège optique et la localisation de la particule dans le foyer du faisceau laser peuvent être réglées par la puissance du laser. Dans le même temps, il est possible de révéler des caractéristiques concernant le potentiel de piégeage et d'analyser les interactions des molécules avec la particule en surveillant le mouvement des particules en fonction du temps dans le piège. Cette approche rend possible de récupérer la fréquence, l'intensité et la direction du mouvement fluidique qui est généré par un objet en mouvement dans son environnement liquide. Nous montrons comment cette idée générale peut être appliquée pour obtenir un spectre de fréquence du mouvement d'un individu Nauplios sans l'exigenced'interférer directement avec le spécimen. Cette approche expérimentale introduit un nouveau concept général pour l'observation du comportement mobiles de spécimens aquatiques d'une manière très sensible. Pour les observations sur les espèces bio-indicatrices, ce qui pourrait élargir la méthodologie actuelle pour l'analyse de l'eau et pourrait être appliqué pour obtenir des informations sur la santé et l'intégrité des écosystèmes aquatiques.
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Protocol
1. Installation expérimentale
- Utiliser un microscope en haut à droite et un champ sombre condenseur d'huile avec une ouverture numérique (NA) = 1,2 pour l'éclairage de champ sombre. Utilisez un objectif à immersion d'eau avec un grossissement de 100X et un NA = 1,0 pour les observations de particules et le piégeage. Utilisez un objectif de l'air avec un grossissement de 10X et un NA = 0,2 pour suivre le mouvement de la Nauplios.
- Utilisez une configuration de pinces optiques avec un laser nm 1064 à onde continue couplée dans le microscope en haut à droite. Régler la puissance de laser du piège optique à 100 mW (mesurée avec un appareil de mesure de puissance après l'objectif).
- Utilisez un appareil photo à haute vitesse CMOS ou un reflex numérique unique objectif (DSLR) de la caméra pour détecter et l'image du mouvement de particules d'or dans le piège optique et le mouvement de la Nauplios.
- Utiliser un filtre coupe-bande pour éviter que le laser de pénétrer dans l'appareil.
- Utiliser un wattmètre pour mesurer la puissance du laser après l'objectif.
2. Préparation de l'échantillon
3. Particules Suivi Expérience
- Piège une nanoparticule d'or avec la pince optique. Par conséquent, amener le laser de piégeage de 1064 nm à proximité d'une nanoparticule d'or qui se diffuse dans la solution en déplaçant la platine du microscope. Les forces optiques intéressantes tirent la nanoparticule d'or vers le point focal du ee faisceau laser. La particule piégée est pas plus diffuse et plutôt maintient sa position. Prenez un flux vidéo de la nanoparticule piégé avec l'appareil photo reflex numérique à un taux de 50 Hz pour 30 sec de cadre.
- Éteignez le laser de la pince optique et libérer la nanoparticule d'or du piège.
- Utilisez un programme de suivi de particules à la lecture de la position de la particule d'or optiquement piégé à chaque trame du flux vidéo. Une transformation de Fourier rapide (FFT) de xy-position de la particule au cours du temps montre un spectre de fréquences.
NOTE: Ici, un code de programme informatique 'IGOR PRO' auto-écrite a été utilisé pour analyser la position de centre de la particule dans le plan xy au fil du temps et de l'analyse FFT. - Comme une alternative à un code IGOR auto-écrite utiliser le programme gratuit "Vidéo spot Tracker» pour le suivi de la particule dans la vidéo. Utilisez le logiciel commercial «Origine» pour effectuer la transformation de Fourier des données de suivi:
- Clic de souris sur la particule vu dans la première image du flux vidéo et une région d'intérêt circulaire apparaît.
- Choisissez "symétrique" et "optimiser" dans le haut commandement fenêtre d'invite à optimiser le suivi de la particule.
- Clic de souris "exploitation forestière" dans le haut commandement fenêtre d'invite et choisir un dossier pour enregistrer les données. Les données de suivi seront enregistrés comme une feuille de données.
- Clic de souris "jeu vidéo" sur la fenêtre de commande gauche du programme de suivi et de patienter jusqu'à ce que tous les cadres de la vidéo sont analysés.
- Fermez le programme et ouvrir la feuille de calcul des données enregistrées avec «Origine». Définissez les valeurs de colonne comme "y 1" et "2 y".
- Situé pas de temps pour chaque image vidéo comme "x" dans la feuille de calcul de données 'origine'.
- Mark xPosition colonne et effectuer une FFT en choisissant "Analyse des données" et "FFT" dans le haut commandement fenêtre d'invite. Répétez l'étape pour la colonne de la position y.
- Tracer les amplitudes du signal FFT calculé en x et la direction y par rapport à la fréquence.
4. Simulation numérique
- Calculer les α de polarisabilité de la particule 60 nm d'or en utilisant le programme informatique «Mathematica».
- Utiliser l'équation (1) pour le calcul de la polarisabilité selon Kuwata et al 16.:
(1) - Définir les trois paramètres suivants dans le code de programme: la fonction diélectrique complexe dépendant de la longueur d'onde de la particule d'or, le rayon de la nanoparticule, et l'indice de réfraction du milieu environnant.
- Utiliser l'équation (1) pour le calcul de la polarisabilité selon Kuwata et al 16.:
- Utiliser la description des élecdistribution du champ trique d'un faisceau gaussien focalisé selon Agayan et al 17 pour le calcul des forces optiques agissant sur une particule d'or de 60 nm.:
(2) - . Utilisation des équations (3) - (6) à partir de Agayan et al 17 pour calculer à la fois, et le gradient de diffusion des forces agissant sur la particule:
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(6) - Dans le code de programme, de définir les paramètres de la puissance du laser, l'ouverture numérique de l'objectif, et la polarisabilité complexe de la nanoparticule.
- Résumer la force de gradient et la force de diffusion pour calculer la force optique totale agissant sur la particule d'or dans un piège optique.
- . Utilisation des équations (3) - (6) à partir de Agayan et al 17 pour calculer à la fois, et le gradient de diffusion des forces agissant sur la particule:
- Lancer la simulation en appuyant simultanément sur "Control" et "Enter".
(1) 
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Representative Results
Une illustration schématique du dispositif expérimental est représenté sur la Figure 1A. Une configuration de champ foncé est nécessaire pour détecter optiquement le déplacement d'une particule d'or de 60 nm dans un piège optique 15. La longueur d'onde de 1064 nm pour le laser de piégeage est choisie pour garantir un confinement stable du 12,14 de particules d'or de détecteur. Un diviseur de faisceau dans le microscope est utilisé pour focaliser le faisceau de piégeage à travers l'objectif et un filtre coupe-bande empêche le laser de piégeage d'entrer dans le dispositif de détection de l'expérience. Le Nauplios effectuait des mouvements dans la solution d'eau entourant la nanoparticule d'or optiquement piégé (figure 1B). Les vibrations fluidiques qui sont générés par l'animal se propagent à travers le milieu liquide et d'interagir avec les particules piégées optiquement.
La figure 2A représente une image de champ sombre d'une seule nanoparticule d'or de 60 nm qui est piégée by du faisceau laser. La couleur verdâtre sous éclairage en fond noir indique sa fréquence de diffusion dans cette gamme de longueur d'onde. En observant la couleur de la particule piégée avec un appareil photo reflex numérique assure que seulement une nanoparticule plasmonique est piégé par le laser focalisé depuis le piégeage d'un deuxième particule se traduirait par un changement de couleur dû à un couplage plasmonique. La distribution calculée de la force optique totale qui maintient la particule confinée dans le piège est représenté sur la Figure 2B. Sans aucune vibration fluidique externe, le déplacement de la nanoparticule plasmonique piégée présente une distribution gaussienne, puisque son mouvement est uniquement soumise à un mouvement brownien (Figure 2C). Dès que l'on Nauplios est ajouté à l'échantillon, son déplacement crée une interaction fluidique avec la particule de détection. La nanoparticule dans le piège optique commence à osciller dans la direction de l'interaction du fluide jusqu'à une amplitude d'oscillation de 100 nm (Figure 2D).
Les mouvements de plusieurs larves Nauplios ont été analysés indépendamment par le contrôle de leur comportement de nage avec une caméra CMOS haute vitesse. Un exemple est montré sur la figure 3A. Une oscillation complète du mouvement périodique du bras principal de la grande antenne prend 148 ms, ce qui correspond à une fréquence d'environ 6,75 Hz. Nous avons observé le même Nauplios sur une période de temps de plusieurs secondes, et également différente Nauplii à partir du même échantillon. De l'observation directe, nous avons observé des fréquences pour les coups d'antennes dans la plage comprise entre 4,1 et 7,2 Hz.
Figure 3B et 3C montrent figure le spectre de fréquence d'une nanoparticule d'or piégé sans (courbe noire) et avec (courbe rouge) un Nauplios de présent dans la goutte d'eau observé. Presque aucun signal ne peut être vu dans la direction x du spectre de Fourier de la particule. En revanche, la direction y du spectre de fréquence montre un fort response. Ceci peut être expliqué par la position relative de la Nauplios par rapport au piège à particules. La nanoparticule détecte uniquement les vibrations qui sont générées par l'organisme. Un fort signal dans la direction y indique donc la direction des oscillations fluidiques et également la position de l'animal (cf. figure 2D). La transformation de la trajectoire de déplacement des particules en fonction du temps dans l'espace de Fourier par conséquent conduit à une différence de direction dépendant de l'intensité de signal du spectre de fréquence. La large gamme de fréquence présent dans nos mesures est conforme à la motilité organisme net. Les mouvements des deux antennes principales de la Nauplios ne sont pas la seule source de déplacement de liquide. Les mouvements de petites paires d'antennes et d'autres protubérances du corps contribuent également au signal observé. Pour toutes les mesures, nous avons trouvé des maxima fréquence comprise entre 3,0 Hz et 7,2 pour le mouvement Nauplios, ce qui est en bon accord avec l'observation directe magnetoencies du micro-organisme biologique et aussi correspond bien à la gamme de fréquence prévue pour un Nauplios dans un stade larvaire 6,8-10.
Figure 1. Illustration schématique du dispositif expérimental. A) la configuration du Fond noir et pince optique. Un diviseur de faisceau dans le microscope est utilisé pour focaliser le faisceau de piégeage (1064 nm, une onde continue) à l'étape du microscope à fond noir. Un filtre coupe-bande empêche le laser de pénétrer dans le haut débit ou appareil photo reflex numérique. B) Une nanoparticule d'or est piégé dans la pince optique pour détecter les vibrations microfluidiques d'un Nauplios dans le milieu environnant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: le piégeage optique d'une nanoparticule d'or. A) l'image de champ sombre d'une seule particule d'or piégé. B) Calcul de la force totale agissant sur la particule dans un piège optique. La longueur d'onde du laser est 1064 nm et la puissance de 100 mW a été mesurée à l'objectif. La force est représentée graphiquement dans la région de 2 um autour du point. C) xy de déplacement d'une particule d'or dans un piège optique focal. Le mouvement des particules ne soit pas perturbé par des vibrations fluidiques et uniquement provoqué par le mouvement brownien. D) xy-déplacement de la particule d'or dans le piège, après l'ajout d'un Nauplios au liquide. L'écoulement microfluidique produit par l'animal provoque une distorsion dépendante du déplacement des nanoparticules d'or dans la direction y de fréquence.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Les spectres en fréquence d'une nanoparticule d'or piégé à côté d'un Nauplios de natation. A) Antennes caresse d'un seul Nauplios à différents points dans le temps. . Une oscillation complète du mouvement périodique de l'antenne principale prend environ 148 millisecondes (6,75 Hz) B) Courbe noire: spectre du déplacement d'une nanoparticule optiquement non perturbé piégé dans la direction x qui a été pris comme référence la fréquence. Courbe rouge: spectre de fréquence de la particule d'or à côté d'un Nauplios natation dans la direction x. Le spectre ne montre pas un signal fort en raison de la position relative de la Nauplios au particl optiquement piégée. Encart: Représentation schématique de la position Nauplios et nanoparticules d'or lors de l'expérience. Le flux généré par la Nauplios mobile est principalement dirigée dans la direction y, C) de la courbe noire:. Référence spectre de fréquence de la particule d'or non perturbé dans la direction y. Courbe rouge:. Spectre du déplacement de nanoparticules d'or en présence d'un Nauplios Fréquence S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Microscopie en champ sombre est un outil puissant pour la visualisation de nanoparticules d'or avec des dimensions inférieures à la limite de diffraction optique, depuis la section efficace de diffusion des nanoparticules métalliques dépasse leur section géométrique (cf. figure 2A) 18. Dans une configuration de type brucelles, cette approche permet de distinguer même si seulement un seul ou plusieurs des nanoparticules d'or sont piégés par le faisceau laser, car le couplage plasmonique entre les particules provoque un décalage vers le rouge de la fréquence de résonance de plasmon 15. Microscopie en champ sombre avec une configuration de pince optique offre donc de nombreuses nouvelles et très utiles possibilités expérimentales, mais la combinaison n'est pas évident. Pour le piégeage optique stable d'un faisceau laser fortement concentré est requis, étant donné que l'origine d'un piège optique en trois dimensions est provoquée par un gradient de la densité de champ optique. Habituellement, les objectifs avec des ouvertures numériques élevées (NA = 1.3 à 1.4) sont utilisés pour pinceconfigurations pour parvenir à une étroite focalisation du laser 19. Les maximales NA de condensateurs disponibles dans le commerce de pétrole en champ sombre, cependant, est de 1,2. Cela limite la gamme des objectifs qui peuvent être utilisés pour piéger la particule NA <1.2 parce que les objectifs plus élevés NA portent le problème qui non seulement dispersés, mais aussi la lumière est directement collectées par l'objectif. Pour notre configuration, nous sommes en mesure de réaliser un piégeage optique stable en utilisant un objectif à immersion d'eau avec un NA = 1.0 et d'un condenseur à fond noir avec un NA = 1.2. Ceci est possible, car l'expansion de faisceau laser devant le microscope a conduit à une sur-remplissage de l'ouverture arrière de l'objectif et donc pour un nombre suffisant de focalisation du laser (même avec une ouverture numérique de 1,0 seulement).
Piégeage stable d'une nanoparticule d'or plasmonique est également fortement dépendant de la longueur d'onde du laser de 12 à 14 de piégeage. Dans nos expériences, une longueur d'onde de 1 064 nm a été choisie pour le bec de piégeage de particulesause cette longueur d'onde est bien décalée vers le rouge de la longueur d'onde de résonance de plasmons de la particule de ~ 530 nm. Ceci est important pour un piégeage stable depuis que les forces de gradient optiques agissant sur la particule d'or sont dominants pour cette longueur d'onde tout en dispersant les forces qui proviennent d'un transfert de moment de photons diffusés et absorbés, sont minimes. Deux, la pente et la force de diffusion, provoquent la particule de se déplacer dans des directions différentes, mais seules forces gradient conduisent à un piégeage optique stable car ils sont dirigés vers la région de plus forte intensité qui est la focalisation du faisceau laser. Dispersion de forces, en revanche, sont pointant le long de l'axe du flux d'énergie du faisceau de lumière. A une longueur d'onde proche de la résonance des particules, diffusion de la lumière devient forte et diffusion forces dominante. Particules dans ce cas sont poussés et non piégés par le faisceau laser, même au-delà du plan focal 20,21.
Un piégeage très stable de la particule est unexigence de détecter toute perturbation du petit microfluidique externe et pour obtenir un signal amélioré par rapport au bruit dans le spectre de fréquence à partir du déplacement des particules en fonction du temps dans le piège optique. Dans le même temps, une puissance de laser élevée peut conduire à un échauffement important de la nanoparticule qui pourrait provoquer des effets thermiques indésirables, y compris le chauffage de la totalité de l'échantillon d'eau. Pour parvenir à un signal distinct dans l'espace de Fourier de la particule deux facteurs doivent être pris en compte et l'expérience optimisée de façon à ce que les effets de chauffage sont réduites au minimum mais suffisant piégeage stable est obtenu. Il est également important de signaler que les conditions de l'échantillon d'eau, tels que la température et le pH, peuvent avoir un impact sur la viabilité des larves au cours de la mesure, et que ces facteurs doivent donc être contrôlé et maintenu constant. Nous avons donc effectué toutes les mesures à température ambiante (~ 20 ° C) et à un pH d'environ 7,5.
Dans l'ensemble, til méthode pour détecter le mouvement des larves Nauplios par le suivi de la position d'une seule nanoparticule d'or dans un piège optique représente un moyen non invasif pour analyser l'activité de l'échantillon aquatiques sans avoir à déranger ou même voir le Nauplios pendant la mesure. En outre, la direction des oscillations microfluidique peut être déterminée par l'analyse de la personne à charge spectre de déplacement de la nanoparticule de Fourier de direction. La configuration de la pince optique rend ainsi possible de détecter même les petites vibrations fluidiques dans une solution aqueuse avec une grande sensibilité. Dans l'avenir, cette approche pourrait être étendue à la distinction entre différents types d'organismes dans un échantillon d'eau et dans le même temps. En outre, cette approche consistant à utiliser une nanoparticule d'or en tant que détecteur sensible n'est pas limitée à la mesure de larves Nauplios seulement et ne peut en principe être appliquée à mesurer le flux généré par tout beaucoup plus petits objets, tels que des cellules simples et des pobactéries ssibly même.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Le soutien financier par l'ERC par Advanced Investigator Grant HYMEM, par la DFG par la nanosystèmes Initiative Munich (NIM) et par la Sonderforschungsbereich (SFB1032), projet A8 est grandement appréciée. Nous sommes reconnaissants au Dr Alexander Ohlinger, le Dr Sol Carretero-Palacios et spas Nedev de soutien et de discussions fructueuses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Zeiss Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | 490035-0012-000 | dark field illumination |
| Water objective Achroplan | Carl Zeiss | 440087 | 100X magnification, NA = 1.0 |
| Air objective Epiplan | Carl Zeiss | 442934 | 10X magnification, NA = 0.2 |
| Dark field oil condenser | Carl Zeiss | 445323 | NA = 1.2 |
| Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL | Cobolt | 1064-05-01-2000-500 | 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00 |
| Beam expander | Edmund Optics | Part no. 1064 2-8X 64414 | |
| High Speed Camera Dimax HD | PCO. Germany | ||
| Color Camera Canon EOS 500 D | Canon | FAQ-ID: 8201395700 | |
| Notch filter StopLine 532/1064 | Semrock | A11149-711265 | Part no. NF01-532U |
| Water | |||
| Nauplius Artemia salina | |||
| Gold colloid | BBInternational | Batch 13741 | Diameter 60 nm |
| MQMie Version 3.2 | Dr. Michael Quinten | ||
| Mathematica 8.0 | Wolfram | ||
| Comsol Multiphysics 4.0 | COMSOL, Inc. |
References
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