Summary
私たちは、水生生物の周波数の動きを調査し、特徴づけるためにプラズモニックナノ粒子の光学式トラッキングを使用しています。
Abstract
私たちは、光ピンセット、小さな水生生物の移動により発生する流体振動を解析するための高感度なツールを提供してもよい方法を示しています。光ピンセットによって保持され、単一の金ナノ粒子は、水サンプルにノープリウス幼生（ アルテミア·サリナ ）のリズミカルな運動を定量化するためのセンサとして使用されている。これは、ノープリウス活性の結果として、捕捉されたナノ粒子の時間依存性の変位を監視することによって達成される。ナノ粒子の位置のフーリエ解析を観察した種の動きに特徴的な周波数スペクトルが得られる。この実験は、それらを直接観察し、トラップされた粒子についての幼虫の位置に関する情報を得るために必要とせず、小さな水生幼虫の活性を測定し、特徴づけるため、このメソッドの機能を示しています。全体的に、このアプローチは、水生Eで見つかった特定の種の活力に洞察力を与えることができるcosystemおよび水試料を分析するための従来の方法の範囲を広げることができる。
Introduction
化学的および生物学的指標に基づく水質評価は、水生生態系1-3の状態や環境条件に洞察を得るために基本的に重要である。水化学分析のための古典的な方法は、官能的性質又は物理化学的パラメータの決定に基づいている。生物学的指標は、他の一方で、その存在および生存能力、彼らは生物指標の典型的な例インチ起こる生態系のための環境条件や汚染物質の影響に関する洞察を提供することができますカイアシ類、小さな水の甲殻類のグループである動物種であるほぼすべての水の生息地4,5に記載されてい。水試料からのこれらの種の活性及び生存率を観察し、したがって生態系5の全体的な状態に関する情報を得るために使用することができる。ノープリウスと呼ばれているカイアシ類の幼虫は、そのアンテナのリズミカルなストロークを使用します（それぞれの幼虫がappendaの3組を持っている自分の頭領域におけるGES）は、水6で泳ぐ。これらのストロークの頻度と強度は、それによって、年齢、フィットネス、および動物7月10日の環境条件の直接的な指標である。これらの標本上の任意の調査は通常、直接ノープリウスのアンテナストロークを観察し、カウントすることにより、顕微鏡を用いて行われます。そのサイズ（〜100〜500ミクロン）11には、これは多くの場合、測定を行うために必要とするいずれか1つずつ、または基板への単一ノープリウスを修正する。
ここでは、超高感度検出器として、光学的にトラップされた金ナノ粒子を用いて水試料中カイアシ類幼虫の活性を観察するための新たなアプローチを実証する。光ピンセットは、通常、ピコニュートンの範囲12から14まで分子間力を加えるか、測定するための細かい実験ツールとして、多くのグループによって使用されています。さらに最近では、光ピンセットのための応用範囲は、音響振動を観察し、解決するために拡張されました光学トラップ15内に閉じ込められるナノおよびマイクロ粒子の動きを監視することにより、液体培地でのNTの変動。液体中に浸漬される粒子は、ブラウン運動に供される。光トラップの内側に、しかし、この運動は、部分的に強く、レーザ誘起勾配力によって減衰される。したがって、光トラップの剛性およびレーザ光の焦点内の粒子の局在は、レーザーパワーによって調整することができる。同時に、それはトラップポテンシャルに関する特性を明らかにするために、トラップ内の時間依存性の粒子運動を監視することにより、粒子と分子の相互作用を分析することが可能である。このアプローチにより、周波数、強度、及びその液体環境中で移動する物体によって生成された流体運動の方向をピックアップしてレンダリングする。我々は、この一般的な考えは必要条件ではなく、個々のノープリウスの運動の周波数スペクトルを得るために適用することができる方法を示して直接試料に干渉する。この実験的なアプローチは、非常に敏感な方法で水生標本の運動性行動の観察のための新しい一般的な概念が導入されています。生物指標種の観察のために、これは水の分析のための現在の方法論を展開することができ、健康や水生生態系の保全についての情報を得るために適用することができる。
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Protocol
1。実験装置
- 開口数（NA）と直立顕微鏡および暗視野オイル冷却器を使用= 1.2暗視野照明のために。粒子観察と捕獲のための100倍の倍率とNA = 1.0と水浸対物レンズを使用してください。ノープリウスの動きに追従するために10倍の倍率とNA = 0.2と空気の目的に使用します。
- 直立顕微鏡に接続された1064 nmの連続波レーザーと光ピンセットのセットアップを使用してください。 （対物後の電力計で測定）は100mWに光トラップのレーザーパワーを設定します。
- 光トラップとノープリウスの動きに金粒子の動きを検出し、映像にCMOS高速カメラやデジタル一眼レフ（DSLR）カメラを使用してください。
- カメラに入るのを防止するために、レーザノッチフィルタを使用する。
- 対物レンズの後にレーザパワーを測定するパワーメータを使用する。
2。サンプル調製
3。粒子追跡実験
- 光ピンセットでトラップ1金ナノ粒子。このため、顕微鏡ステージを移動することによって溶液中に拡散されて、金ナノ粒子の近くに1064 nmのレーザートラッピングをもたらす。魅力的な光の力は、目の焦点に向けた金ナノ粒子を引っ張る電子レーザービーム。トラップされた粒子は、その位置を維持し、もはや、むしろ拡散されていません。 30秒間、50Hzのフレームレートでデジタル一眼レフカメラで捕捉されたナノ粒子のビデオストリームを取る。
- 光ピンセットのレーザーをオフにして、トラップから金ナノ粒子を解放する。
- ビデオストリームの各フレームで光学的にトラップされた金粒子の位置を読み出しに粒子追跡プログラムを使用します。経時的に、粒子の位置のxyの高速フーリエ変換（FFT）は、周波数スペクトルを明らかにする。
注記：ここでは、自己形成 'IGOR PRO'コンピュータプログラムコードは、経時的及びFFT分析のためのxy平面での粒子の中心位置を分析した。 - 自己書かれたIGORコードの代替として、映像中の粒子を追跡するための自由に利用できる「ビデオスポットトラッカー」プログラムを使用します。追跡データのフーリエ変換を実行するために、商用ソフトウェア「起源」を使用します。
- ビデオストリームと関心が現れるの円形領域の最初の写真で見られる粒子をマウスでクリック。
- 「対称」を選択して、粒子の追跡を最適化するためにtopコマンドプロンプトウィンドウで「最適化」。
- マウスは、topコマンドプロンプトウィンドウに「ログイン」をクリックして、データを保存するフォルダを選択します。追跡データは、データスプレッドシートとして保存される。
- マウスは、追跡プログラムの左側のコマンドプロンプトウィンドウの「動画再生」をクリックし、ビデオのすべてのフレームが分析されるまで待ちます。
- プログラムを終了し、「起源」で保存されたデータのスプレッドシートを開きます。 「Y 1」と「Y 2」と、列の値を設定します。
- 「原点」データスプレッドシートの「X」などの各映像フレームの時間ステップを設定します。
- マークX-位置欄とtopコマンドプロンプトウィンドウに「データ解析」と「FFT」を選択することで、FFTを実行する。 y位置列の手順を繰り返します。
- 周波数に対するx方向及びy方向に計算されたFFT信号の振幅をプロットする。
4。数値シミュレーション
- コンピュータプログラム「Mathematicaを 'を使用して60 nmの金粒子の分極率αを計算する。
- ：式（1）桑田らによれば分極率を算出し16を使用
（1） - 金粒子、ナノ粒子の半径、および周囲の媒質の屈折率の波長依存性複合誘電関数：プログラムコードで、次の3つのパラメータを定義します。
- ：式（1）桑田らによれば分極率を算出し16を使用
- 電気の記述を使用Agayan らによると、集束ガウスビームのトリC電界分布17 60 nmの金粒子に作用する光学力を計算する。：
（2） - 利用方程式（3） - （6）Agayan ら 17の両方を計算するために、勾配及び粒子に作用する力を散乱させる。
（3） 
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（6） - プログラムコードは、レーザパワーのパラメータを定義し、開口数のobjective、およびナノ粒子の複雑な分極率。
- 光トラップ中の金粒子に作用する全光力を計算するために、勾配力と散乱力をまとめる。
- 利用方程式（3） - （6）Agayan ら 17の両方を計算するために、勾配及び粒子に作用する力を散乱させる。
- 同時に「制御」を押して、シミュレーションを実行し、 "Enter"を。
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（6） Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
実験装置の概略図を図1Aに示されている。暗視野構成では、光学的トラップ15における60nmの金粒子の変位を検出する必要がある。トラッピング用レーザ波長1064nm、検出器12,14の金粒子の安定な閉じ込めを保証するために選択される。顕微鏡のビームスプリッタは、対物レンズを通してトラッピングビームを集束するために使用され、ノッチフィルタは、実験の検出素子内に入るトラッピングレーザを防止する。ノープリウスは、光学的にトラップされた金ナノ粒子（ 図1B）を囲む水溶液中で運動を行っていた。動物によって生成される流体振動は、液体媒体中を伝播し、光学的にトラップされた粒子と相互作用します。
図2Aは、bはトラップされ、単一の60nmの金ナノ粒子の暗視野像を示すYレーザービーム。暗視野照明の下で緑がかった色は、その波長範囲での散乱周波数を示す。デジタル一眼レフカメラで捕捉された粒子の色を観察すると、第二の粒子の捕捉によるプラズモンカップリングの色の変化をもたらすので、ちょうど1プラズモニックナノ粒子集束レーザによってトラップされることを保証する。トラップに閉じ込められた粒子を保持し、全光学力の計算された分布を図2（b）に示している。任意の外部流体振動せずに、捕捉されたプラズモンナノ粒子の移動は、その移動がブラウン運動（ 図2C）にのみ対象となるので、ガウス分布を示している。できるだけ早く1ノープリウスを試料に添加されると、その動きが検出粒子と流体の相互作用を作成する。光トラップ中のナノ粒子は、100nmの振動振幅（ 図2Dまでの流体相互作用の方向に振動し始める）。
いくつかのノープリウス幼生の動きは、独立して、高速CMOSカメラでそれらの遊泳行動を監視することによって分析した。一例が図3Aに示されている。大型アンテナのメインアームの周期運動の一つの完全な振動は周りの6.75ヘルツの周波数に対応し、148ミリ秒かかります。我々は、数秒の時間をかけて同じノープリウスを観察し、また、同じサンプルからノープリウス異なる。直接観察から、我々は4.1と7.2 Hzの範囲内のアンテナストロークのための周波数を観察した。
図3B及び図3Cは、（黒い曲線）せずにトラップされた金ナノ粒子の周波数スペクトルを示し、（赤線）が観察水滴中にノープリウスのプレゼントに。ほとんど信号は、粒子のフーリエスペクトルのx方向に見ることができる。対照的に、周波数スペクトルのy方向は、強いRESPを示すオンセ。これは、粒子トラップに対してノープリウスの相対位置によって説明することができる。ナノ粒子は、生物によって生成されたもののみ振動を検出します。 y方向に強い信号は、従って、流体振動、また、動物の位置（cp. 図2D）の方向を示している。フーリエ空間内に時間依存性の粒子変位軌跡を形質転換し、したがって周波数スペクトルの信号強度の方向依存性の差につながる。我々の測定に存在する広範な周波数範囲は、ネット生物の運動性と一致している。ノープリウスの2主なアンテナの動きは、液体変位の独占的供給源ではありません。小さいアンテナペアと他の身体突起の動きも観測信号に寄与。すべての測定のために、我々は直接観測frequにもぴったり応じたノープリウスの移動のための3.0および7.2 Hzの周波数の最大値を見つけましたまた、生物学的な微生物のenciesとは幼虫期6,8-10でのノープリウスの期待周波数範囲によく合います。
図1。実験装置の模式図。ア）ダークフィールド構成と光ピンセット。顕微鏡のビームスプリッタは、暗視野顕微鏡のステージにトラッピングビーム（1064nmで、連続波）を集束するために使用される。ノッチ·フィルタは、高速やデジタル一眼レフカメラに入るのレーザーを防ぐことができます。b）1つの金ナノ粒子は、周囲の媒体に1ノープリウスのマイクロ流体振動を検出するために、光ピンセットでトラップされる。 これの拡大バージョンを表示するには、こちらをクリックしてください図。
図2：金ナノ粒子の光トラッピング。シングルトラップされた金粒子のA）の暗視野像。B）光トラップ中の粒子に作用する全体の力の計算。レーザ波長は1064nmであり、100ミリワットのパワーを対物レンズ下で測定した。力は、焦点の周り2μmの領域にプロットされている光学トラップ中の金粒子のC）のxy変位。粒子の動きは、流体の振動によって妨害のみブラウン運動によって引き起こされるものではない。トラップ中の金粒子のD）のxy変位、液体にノープリウスを添加した後。動物によって生成されたマイクロ流体の流れは、y方向の金ナノ粒子変位の周波数依存の歪みを引き起こす。HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg"ターゲット= "_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3：横に泳ぐノープリウスにトラップされた金ナノ粒子の周波数スペクトル。 A）異なる時点での単一ノープリウスの触角ストロークが。メインアンテナの定期的な運動の一つの完全な振動が周囲に148ミリ秒（6.75 Hz）をとり、B）ブラックカーブ：基準としたx方向の邪魔されずに、光学的にトラップされたナノ粒子の変位の周波数スペクトル。赤い曲線：x方向の水泳ノープリウスの隣に金粒子の周波数スペクトル。スペクトルは、光学的にトラップされたparticlにノープリウスの相対的な位置に強いシグナルを示していないE。挿入図：実験中のノープリウスと金ナノ粒子の位置の模式図。 。移動ノープリウスによって生成されたフローは、主にy方向C）、ブラック曲線に向いている：y方向の乱されていない金粒子の基準周波数スペクトル。赤い曲線：ノープリウスの存在下での金ナノ粒子の変位の周波数スペクトルは、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
暗視野顕微鏡は、金属ナノ粒子の散乱断面積は、幾何学的断面積（cp.の図2A）18 を超えているため、光の回折限界以下の寸法を有する金ナノ粒子を可視化するための強力なツールである。ピンセット設定では、このアプローチは、さらに粒子間のプラズモンカップリングプラズモン共鳴周波数が15の赤方偏移を引き起こすためにのみ、単一または複数の金ナノ粒子がレーザービームによって捕捉されるかどうかを区別することを可能にする。光ピンセット構成の暗視野顕微鏡は、したがって、多数の新しい、非常に有用な実験の可能性を提供しますが、組み合わせは自明ではありません。三次元の光トラップの原点は、光電界密度の勾配によって引き起こされるので、安定した光トラッピングのために強く集光されたレーザ光は、必要とされる。通常、高い開口数（NA = 1.3〜1.4）との目標は、ピンセットのために使用されているレーザー19のフォーカシングタイトを達成するためのセットアップ。市販の暗視野オイルコンデンサーの最高NAは、しかし、1.2である。これは、より高いNA対物レンズが散乱されていない問題のみを負担するため、NA <1.2の粒子を捕捉するために使用することができるが、直光は対物レンズにより集光された目的の範囲を制限する。我々のセットアップのために、我々はNA = 1.2 NA = 1.0および暗視野コンデンサと水浸対物レンズを使用することにより、安定した光トラッピングを達成することができる。顕微鏡の前のレーザビームの拡大は、対物の背面開口部への過充填、したがって（偶数のみ1.0のNAを有する）レーザの集束十分につながっているため、これは可能である。
プラズモニック金ナノ粒子の安定したトラップもトラップレーザー12から14の波長に強く依存する。我々の実験では、波長1064nm、粒子トラップベックのために選択したauseこの波長は、遠赤色シフト〜530nmで、粒子のプラズモン共鳴波長である。 、散乱、吸収された光子の運動量の移動から生じる最小限で力を散乱しながら、金粒子に作用する光勾配力は、この波長のために支配的であるので、これは安定した捕獲のために重要である。勾配散乱力の両方は、粒子は異なる方向に移動させるが、それらは、レーザービームの焦点で最大強度の領域に向かって指しているので、唯一の勾配力が安定した光トラッピングをもたらす。力散乱、対照的に、光ビームのエネルギー束の軸に沿って向いている。粒子共鳴に近い波長では、光の散乱が強くなり、支配的な力を散乱。この場合の粒子があっても焦点面20,21を越えて、レーザビームに押されて捕捉されない。
粒子の非常に安定したトラップがある任意の小さな外部マイクロ流体の乱れを検出し、光トラップにおける時間依存性の粒子変位の周波数スペクトルのノイズ比に対するシグナル増強を達成するために必要。同時に、高いレーザパワーが全体の水試料の加熱を含む、望ましくない熱効果を誘導することができるナノ粒子の実質的な加熱をもたらすことができる。パーティクルのフーリエ空間内の異なる信号を達成するために、両方の因子を考慮しなければならず、加熱効果が最小化されるように最適化された実験が、十分な安定な捕捉が達成される。それは、温度やpHなどの水試料の条件は、測定中の幼虫の生存率に影響を与え、これらの因子は、このように制御され、一定に維持される必要があるかもしれないことを指摘することも重要である。そこで我々は、室温（〜20℃）で、および約7.5のpHで全ての測定を実施した。
全体的に、T彼光学トラップ中の単一金ナノ粒子の位置を追跡することによって、ノープリウス幼生の動きを検出するための方法は、測定中にノープリウスを妨害またはさらに表示することを必要とせずに、水生試料の活性を分析するための非侵襲的な方法を表す。さらに、マイクロ流体振動の方向は、ナノ粒子の変位の方向依存性フーリエスペクトルを分析することによって決定することができる。光ピンセットの構成は、高感度で、水溶液中で小さな流体振動を検出することが可能にする。将来的には、このアプローチは、一つの水サンプル中のと同時に、異なる種類の生物を区別するために拡張することができる。さらに、敏感な検出器として金ナノ粒子を用いたこのアプローチは、唯一のノープリウス幼虫の測定に限定されず、原理的には、単一細胞および経口のような非常に小さい物体によって生成された流量を測定するために適用することができるssiblyさえ細菌。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
ナノシステム·イニシアチブミュンヘン（NIM）を介して、DFGによる高度な研究者グラントHYMEM、通ってSonderforschungsbereich（SFB1032）を通じて、ERCによる財政支援、プロジェクトA8が感謝して承諾されます。私たちは、博士アレクサンダーOhlinger、サポート、実りある議論のための博士ソルCARRETERO-パラシオスやスパNedevに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Zeiss Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | 490035-0012-000 | dark field illumination |
| Water objective Achroplan | Carl Zeiss | 440087 | 100X magnification, NA = 1.0 |
| Air objective Epiplan | Carl Zeiss | 442934 | 10X magnification, NA = 0.2 |
| Dark field oil condenser | Carl Zeiss | 445323 | NA = 1.2 |
| Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL | Cobolt | 1064-05-01-2000-500 | 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00 |
| Beam expander | Edmund Optics | Part no. 1064 2-8X 64414 | |
| High Speed Camera Dimax HD | PCO. Germany | ||
| Color Camera Canon EOS 500 D | Canon | FAQ-ID: 8201395700 | |
| Notch filter StopLine 532/1064 | Semrock | A11149-711265 | Part no. NF01-532U |
| Water | |||
| Nauplius Artemia salina | |||
| Gold colloid | BBInternational | Batch 13741 | Diameter 60 nm |
| MQMie Version 3.2 | Dr. Michael Quinten | ||
| Mathematica 8.0 | Wolfram | ||
| Comsol Multiphysics 4.0 | COMSOL, Inc. |
References
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