Summary
Мы используем оптический отслеживание плазмонных наночастиц, чтобы исследовать и охарактеризовать частотные движения водных организмов.
Abstract
Мы показываем, как оптический пинцет может обеспечить тонкий инструмент для анализа жидкостных вибрацию от движения мелких водных организмов. Один наночастиц золота проводится с помощью оптического пинцета используется в качестве датчика для количественного ритмические движения личинки науплиуса (Артемия Салина) в образце воды. Это достигается путем мониторинга зависящее от времени перемещение захваченного наночастицы как следствие активности науплиуса. Фурье-анализ позиции наночастицы затем дает частотный спектр, что характерно для движения наблюдаемых видов. Этот эксперимент демонстрирует возможности этого метода для измерения и характеризуют активность небольшой водных личинок без необходимости наблюдать их непосредственно и для получения информации о положении личинок по отношению к ловушке частицы. В целом, этот подход может дать представление о жизнеспособности некоторых видов, обитающих в водной еcosystem и может расширить спектр традиционных методов анализа проб воды.
Introduction
Оценка качества воды на основе химических и биологических показателей имеет принципиальное значение, чтобы получить представление о государственных и экологических условиях водной экосистеме 1-3. Классические методы химического анализа воды основаны на органолептические свойства или определения физико-химических параметров. Биологические индикаторы, с другой стороны, виды животных, чье присутствие и жизнеспособность дают возможность судить о условий окружающей среды и влияния загрязняющих веществ на экосистемы, что они происходят дюйма Типичные примеры биоиндикаторов являются Веслоногие, группа мелких ракообразных воды, которые могут можно найти в практически любой 4,5 вода обитания. Наблюдая за активность и жизнеспособность этих видов из образца воды, таким образом, могут быть использованы для получения информации о общих условий экосистемы 5. Личинки копепод, которые называются Nauplii, использовать ритмические удары своими антеннами (каждый личинка имеет три пары appendaГЭС в их области головы) плавать в воде 6. Частота и интенсивность этих ударов является самым прямым показателем возраста, фитнес, и условий окружающей среды животного 7-10. Любые исследования по этих образцов, как правило, делается с помощью микроскопа путем наблюдения и подсчета антенные ударов науплии напрямую. Благодаря своим размерам (~ 100-500 мкм) 11, это часто требует сделать измерения либо по одному или исправить один науплиуса на подложку.
Здесь мы демонстрируем новый подход для наблюдения за активностью копепода личинок в пробах воды с помощью оптически захваченного наночастиц золота в качестве ультра-чувствительный детектор. Оптический пинцет обычно используются многими группами в виде мелкого экспериментальной инструмента для применения или измерения силы между молекулами до диапазона piconewton 12-14. В последнее время область применения для оптического пинцета была расширена, чтобы наблюдать акустические колебания и решитьNT колебания жидких сред, контролируя движение нано-и микрочастиц, которые ограничены в оптической ловушке 15. Частицы, погруженные в жидкость подвергаются броуновского движения. Внутри оптической ловушке, однако, это движение частично затухает сильным, индуцированный лазерным, градиент силы. Таким образом, жесткость оптической ловушки и локализация частицы в фокусе лазерного луча может быть настроен по мощности лазера. В то же время, можно выявить характеристики относительно захвата потенциала и анализировать взаимодействие молекул с частицей путем мониторинга нестационарного движение частиц в ловушке. Такой подход делает возможным подобрать частоту, интенсивность и направление жидкостного движения, который генерируется движущегося объекта в ее жидкой среде. Покажем, как это общая идея может быть применена, чтобы получить частотный спектр движения отдельной Навплия без необходимостинапрямую вмешиваться в образце. Этот экспериментальный подход вводит новую общую концепцию для наблюдения подвижных поведения водных образцов в очень чувствительным способом. Для наблюдений на биоиндикатора видов, это может расширить существующую методологию для анализа воды и может применяться для получения информации о состоянии здоровья и целостности водных экосистем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Экспериментальная установка
- Использование последнюю правой микроскоп и темного масла конденсатор поле с числовой апертурой (NA) = 1,2 для темного поля. Используйте погружения в воду цели с 100-кратном увеличении и NA = 1,0 для наблюдений частиц и захвата. Используйте воздушный цели с 10-кратным увеличением и NA = 0,2 следовать движение Навплия.
- Используйте настройки оптического пинцета с нм лазера непрерывного излучения в 1064 в сочетании в до-правой микроскоп. Установите мощность лазера оптической ловушке до 100 мВт (измеряется с помощью измерителя мощности после цели).
- Используйте высокоскоростную камеру CMOS или Цифровая зеркальная (DSLR) камеры для обнаружения и изображение движение золота частиц в оптической ловушке и движения Навплия.
- С помощью режекторного фильтра, чтобы предотвратить лазера от входа в камеру.
- Используйте измеритель мощности для измерения мощности лазера после цели.
2. Подготовка образца
3. Частиц Отслеживание Эксперимент
- Ловушка один наночастиц золота с оптическим пинцетом. Таким образом, принести 1064 нм образующих лазерных тесную к золотой наночастицы, который диффундирующего в раствор, перемещая столик микроскопа. Привлекательные оптические силы тянуть наночастиц золота к фокальной точке гоэ лазерный луч. Ловушке частиц не распространяющей больше, и скорее держит свои позиции. Возьмем видеопоток захваченного наночастицы с цифровой камерой с частотой кадров 50 Гц в течение 30 сек.
- Выключите лазер оптического пинцета и отпустите наночастиц золота из ловушки.
- Используйте программу отслеживания частиц до считывания положение оптически ловушке частицы золота в каждом кадре видеопотока. Быстрое преобразование Фурье (БПФ) из ху положении частицы с течением времени показывает частотный спектр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, самостоятельно написал "ИГОРЬ PRO" компьютер программный код был использован для анализа центральную частиц положение в плоскости ху с течением времени, а также для анализа FFT. - В качестве альтернативы самостоятельной написано ИГОРЬ кода использовать свободно распространяемый программу 'видеоролик Tracker' для отслеживания частицу в видео. Используйте коммерческое программное обеспечение «происхождение», чтобы выполнить преобразование Фурье отслеживания данных:
- Щелчок мышкой на частицы видели в первой картине видеопотока и круговой области появится интерес.
- Выберите "симметричный" и "оптимизировать" в верхнем окне командной строки для оптимизации отслеживания частицы.
- Щелчок мышью "Вход" в верхнем окне командной строки и выберите папку для сохранения данных. Данные отслеживания будут сохранены в виде электронной таблицы данных.
- Щелчок мышью "Play Video" на левом окне командной строки программы слежения и ждать, пока все кадры из видео не анализируются.
- Закройте программу и открыть сохраненный таблицу данных с 'происхождения'. Установите значения столбцов как "у 1" и "у 2».
- Установите временные шаги для каждого кадра, как "х" в данных таблицы «происхождение».
- Марк х-Положение колонки и выполнить БПФ, выбрав "Анализ данных" и "БПФ" в верхнем окне командной строки. Повторите шаг для столбца Y-положении.
- Участок амплитуды расчетного сигнала FFT в х-и у-направлении в зависимости от частоты.
4. Численное моделирование
- Рассчитать поляризуемость α на 60 нм частицы золота с помощью компьютерной программы "Mathematica".
- С помощью уравнения (1) для вычисления поляризуемости в соответствии с Kuwata и др. 16.:
(1) - Определите следующие три параметра в тексте программы: зависит от длины волны комплексная диэлектрическая функция частицы золота, радиус наночастиц, и показателя преломления окружающей среды.
- С помощью уравнения (1) для вычисления поляризуемости в соответствии с Kuwata и др. 16.:
- Используйте описание электроновэлектрического распределение поля сфокусированного гауссова пучка в соответствии с Agayan и др. 17 для расчета оптических сил, действующих на 60 нм золотых частиц.:
(2) - . Использование уравнения (3) - (6) от Агаян и др. 17 для расчета как, градиент и рассеяния силы, действующие на частицу:
(3) 
(4) 
(5) 
(6) - В коде программы, определить параметры для мощности лазера, числовую апертуру оЕЛЬ, а комплекс поляризуемость наночастицы.
- Суммируем градиентную силу и силу рассеяния для расчета общей оптической силы, действующей на частицы золота в оптической ловушке.
- . Использование уравнения (3) - (6) от Агаян и др. 17 для расчета как, градиент и рассеяния силы, действующие на частицу:
- Запустите моделирование, одновременно нажав "Control" и "Enter".
(1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематическое изображение экспериментальной установки показано на фиг.1А. Конфигурация темное поле необходимо оптически обнаружить смещение 60 нм частицы золота в оптической ловушке 15. Длина волны 1064 нм для захвата лазера выбирают так, чтобы гарантировать устойчивое удержание детектора 12,14 частиц золота. Светоделитель в микроскоп используется для фокусировки луча от захватывающего через объектив и режекторный фильтр предотвращает образующих лазерных от входа в устройство обнаружения эксперимента. Науплиуса выполнял движения в водном растворе, окружающем оптически ловушке наночастиц золота (рис. 1В). Жидкостного вибрации, которые создаются животного распространяться через жидкую среду и взаимодействовать с оптически запертой частицы.
Рисунок 2А показывает темном поле образ одного 60 нм наночастиц золота, что в ловушке бу лазерный луч. Зеленоватого цвета под темного поля указывает на его частоту рассеяния в этом диапазоне длин волн. Наблюдая цвет запертой частицы с цифровой зеркальной фотокамеры обеспечивает только один плазмонных наночастиц захватывается сфокусированного лазерного поскольку захват второго частицы может привести к изменению цвета из-за плазмонного взаимодействия. Рассчитанное распределение общей оптической силой, что удерживает частицы заключены в ловушку показано на фиг.2В. Без внешнего жидкостного вибрации, смещение захваченного плазмонных наночастиц показывает распределение Гаусса, так как его движение исключительно при условии броуновского движения (рис. 2С). Как только один науплиуса добавляют к образцу, ее движение создает жидкостный взаимодействие с детектора частиц. Наночастиц в оптической ловушке начинает колебаться в направлении взаимодействия жидкости до амплитуды колебаний на 100 нм (рис. 2D).
Движения нескольких науплиуса личинок независимо анализируют мониторингом их поведение бассейн с высокоскоростным CMOS камеры. Пример показан на фиг.3А. Один полный колебание периодическое движение главного рычага большого антенн принимает 148 мсек, что соответствует частоте около 6,75 Гц. Мы наблюдали ту же науплиуса в течение периода времени в несколько секунд и также отличается Nauplii из того же образца. Из непосредственного наблюдения мы наблюдали частоты для антенных ходов в диапазоне между 4,1 и 7,2 Гц.
3В и 3С показывают частотные спектры захваченного золота наночастицы без (черная кривая) и с (красная кривая) настоящего науплиуса в наблюдаемом капли воды. Почти никакой сигнал не может рассматриваться в х-направлении спектра Фурье частицы. В противоположность этому, у-направление частотного спектра показывает сильную соотвОНСЕ. Это может быть связано с относительным положением Навплия по отношению к ловушке частиц. Наночастиц обнаруживает только те вибрации, которые создаются организма. Поэтому сильный сигнал в направлении у указывает направление жидкостного колебаний и также положение животного (ср. рис 2D). Преобразование траекторию перемещения частиц зависящих от времени в пространстве Фурье поэтому приводит к зависимой направлении различие в интенсивности сигнала спектров частот. Широкий диапазон частот присутствует в наших измерений согласуется с чистой подвижности организма. Движения двух основных антенн Навплия не единственным источником перемещение жидкости. Движение мелких пар антенн и других выступов тела также вносят вклад в наблюдаемый сигнал. Для всех измерений, мы обнаружили, частоты максимумов между 3,0 и 7,2 Гц для движения науплиуса, который находится в хорошем соответствии с непосредственным наблюдением FREQUencies биологического микроорганизма, а также хорошо вписывается в ожидаемый диапазон частот для Навплия в личиночной стадии 6,8-10.
Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной установки. А) Темный конфигурация поля и оптического пинцета. Делитель луча в микроскоп используется для фокусировки удерживающий луч (1064 нм, непрерывный режим) на этапе темного поля микроскопа. Режекторный фильтр предотвращает лазер от входа в скоростной или DSLR камеры. B) Одна золотая наночастица захваченных в оптической пинцет для обнаружения микрофлюидных колебания одной Навплия в окружающей среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Рисунок 2: Оптический захват золотой наночастицы. А) Темный поле изображения из одного захваченного частицы золота. Б) Расчет полной силы, действующей на частицу в оптической ловушке. Длина волны лазерного излучения является 1064 нм, а мощность 100 мВт измеряли под цели. Усилие нанесены в области 2 мкм вокруг фокальной точки. С) XY-смещение частицы золота в оптической ловушки. Движение частиц не нарушается жидкостных вибраций и только из-за броуновского движения. D) ху-смещение частицы золота в ловушке, после добавления науплиуса к жидкости. Микрожидкостных поток, генерируемый животного вызывает зависит от частоты искажение наночастицы золота перемещения в направлении у.HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Частотные спектры золотой наночастицы ловушке рядом с плавательным Навплия. A) Антенны ходов из одного Навплия в различные моменты времени. . Один полный колебаний периодической движением основного антенн занимает около 148 мс (6,75 Гц) Б) Черная кривая: Частотный спектр смещения ненарушенных оптически ловушке наночастицы в х-направлении, которое было принято в качестве эталона. Красный кривая: Частотный спектр золотой частицы рядом с плавательным Навплия в х-направлении. Спектр не показывает сильный сигнал в связи с относительным положением Навплия к оптически захваченного particlэ. Врезка: Схематическое изображение положения науплиуса и наночастицы золота в ходе эксперимента. Поток, генерируемый движущейся Навплия в основном указывают в у-направлении С) Черный кривой:. Ссылка частотный спектр невозмущенной золотой частицы в направлении у. Красный кривая:. Частотный спектр наночастиц золота перемещения в присутствии Навплия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроскопии в темном поле представляет собой мощный инструмент для визуализации наночастиц золота с размерами ниже предела оптического дифракционного, так как сечение рассеяния наночастиц металлов превышает их геометрического сечения (ср. рис 2A) 18. В установке пинцет, этот подход позволяет даже различать, если только один или несколько наночастицы золота захватываются лазерного луча, потому что плазмонных связи между частицами вызывает красное смещение от плазмонного резонанса частоты 15. Микроскопии в темном поле с оптическим конфигурации пинцет, следовательно, обеспечивает множество новых и очень полезных экспериментальные возможности, но комбинация не является само собой разумеющимся. Для стабильного оптического захвата сильно сфокусированного лазерного луча не требуется, так как происхождение оптической ловушке в трех измерениях обусловлено градиентом плотности оптического поля. Обычно, задачи с высокими численных отверстий (NA = 1,3-1,4) используются для пинцетаустановок по достижению жесткой фокусировки лазера 19. Самая высокая Н.А. коммерчески доступных нефтяных конденсаторов темнопольных, однако, составляет 1,2. Это ограничивает круг задач, которые можно использовать для улавливания частицу NA <1.2, поскольку более высокие цели Н.А. несут проблемы, не только рассеянный, но и прямо свет собирается объективом. В нашей ситуации мы можем добиться стабильного оптического захвата с помощью погружения в воду цели с NA = 1.0 и темное поле конденсатора с NA = 1,2. Это возможно, так как расширение лазерный луч в передней части микроскопа привело к переполнению задней апертуры объектива и, следовательно, достаточно фокусировки лазерного (даже с НС только 1,0).
Стабильный захват плазмонных наночастиц золота также сильно зависит от длины волны захвата лазерного 12-14. В наших экспериментах, длина волны 1064 нм была выбрана для захвата частиц БЭКAuSe эта длина волны гораздо красное смещение от плазмонного резонанса волны частицы в ~ 530 нм. Это важно для стабильного захвата с оптических сил градиентные, действующие на частицы золота являются доминирующими для этой длины волны в то время как рассеяние силы, которые исходят из передачи импульса рассеянных и поглощенных фотонов, минимальны. Оба, и градиент рассеяния сила, вызывают частицы двигаться в различных направлениях, но только градиентные силы приводят к стабильной оптического захвата, так как они должны быть обращены к области наивысшей интенсивности, которая является направлением лазерного луча. Рассеяние силы, напротив, указывают вдоль оси потока энергии светового пучка. При длине волны, близкой к резонансу частиц, рассеяние света становится сильным и рассеяния силы доминирующим. Частицы в этом случае выталкиваются, а не в ловушке лазерным лучом, даже вне фокальной плоскости 20,21.
Очень стабильный захват частицыТребование, чтобы обнаружить любой небольшой внешнее возмущение микрофлюидных и достичь повышенную отношение сигнал-шум в спектре частот от времени зависимым перемещением частиц в оптической ловушки. В то же время, высокий мощность лазера может привести к значительному нагреву наночастицы, которые могут вызвать нежелательные тепловые эффекты, включая нагрев всего образца воды. Для достижения отчетливый сигнал в пространстве Фурье частицы оба фактора должны быть рассмотрены и эксперимент оптимизированы таким образом, что нагревательные эффекты сведены к минимуму, но достаточно стабильным захвата достигается. Важно также отметить, что условия пробы воды, такие как температура и рН, может оказать влияние на жизнеспособность личинок во время измерения, и что эти факторы, следовательно, должны быть под контролем и постоянным. Поэтому все измерения выполнены при комнатной температуре (~ 20 ° C) и при рН около 7,5.
В целом, тон метод для обнаружения движения науплиуса личинок, отслеживая положение одной золотой наночастицы в оптической ловушке представляет собой неинвазивный способ анализа деятельности водных образца без необходимости нарушать или даже увидеть науплиуса во время измерения. Кроме того, направление микрофлюидальных колебаний может быть определено путем анализа зависит от направления спектр Фурье перемещения наночастиц в. Конфигурация оптического пинцета, таким образом, делает возможным обнаружить даже небольшие жидкостных вибрации в водном растворе с высокой чувствительностью. В будущем такой подход может быть распространен на различие между различными видами организмов в одном образце воды и в то же время. Кроме того, этот подход с использованием наночастиц золота в качестве чувствительного детектора не ограничивается измерением только науплиуса личинок и в принципе может быть применен для измерения любой поток, генерируемый гораздо более мелких объектов, таких как отдельных клеток и роssibly даже бактерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Финансовая поддержка со стороны ERC через Расширенный следователь Грант HYMEM, со стороны DFG через Наносистемы инициатива Мюнхене (NIM) и через Sonderforschungsbereich (SFB1032), проект А8 с благодарностью. Мы благодарны д-ром Александром Ohlinger, доктор Sol Carretero-Паласиос и Спас Nedev за поддержку и плодотворные дискуссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Zeiss Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | 490035-0012-000 | dark field illumination |
| Water objective Achroplan | Carl Zeiss | 440087 | 100X magnification, NA = 1.0 |
| Air objective Epiplan | Carl Zeiss | 442934 | 10X magnification, NA = 0.2 |
| Dark field oil condenser | Carl Zeiss | 445323 | NA = 1.2 |
| Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL | Cobolt | 1064-05-01-2000-500 | 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00 |
| Beam expander | Edmund Optics | Part no. 1064 2-8X 64414 | |
| High Speed Camera Dimax HD | PCO. Germany | ||
| Color Camera Canon EOS 500 D | Canon | FAQ-ID: 8201395700 | |
| Notch filter StopLine 532/1064 | Semrock | A11149-711265 | Part no. NF01-532U |
| Water | |||
| Nauplius Artemia salina | |||
| Gold colloid | BBInternational | Batch 13741 | Diameter 60 nm |
| MQMie Version 3.2 | Dr. Michael Quinten | ||
| Mathematica 8.0 | Wolfram | ||
| Comsol Multiphysics 4.0 | COMSOL, Inc. |
References
- Hellawell, J. M. Biological indicators of freshwater pollution and environmental management. , Elsevier Applied Science Publishers. (1986).
- Diamond, J. M., Barbour, M. T., Stribling, J. B. Characterizing and comparing bioassessment approaches and their results: A perspective. Journal of the North American Benthological Society. 15, 713-727 (1996).
- Carlisle, D. M., et al. The quality of our Nation’s waters—Ecological health in the Nation’s streams, 1993–2005. U.S. Geological Survey Circular. 1391, (2013).
- Boxhall, G. A., Defaye, D. Global diversity of copepods (Crustacea Copepoda) in freshwater. Hydrobiologia. 595 (1), 195-207 (2008).
- Ferdous, Z., Muktadir, A. K. M. A Review: Potentiality of Zooplankton as Bioindicator. American Journal of Applied Sciences. 6 (10), 1815-1819 (2009).
- Andersen Borg, C. M., Bruno, E., Kiørboe, T. The Kinematics of Swimming and Relocation Jumps in Copepod Nauplii. PLoS ONE. 7 (10), (2012).
- Gilchrist, B. M. Growth and Form of the Brine Shrimp Artemia Salina. Journal of Zoology. 134 (2), 221-235 (1960).
- Boone, E., Baas-Becking, L. G. M. Salt Effects on Egga and Nauplii of Artemia Salina L. Journal of General Physiology. 14 (6), 453-763 (1931).
- Drewes, C. Quantitative investigations of hatching in brine shrimp cysts. Association for Biology Laboratory Education. 27, 299-312 (2006).
- Williams, T. A. A model of rowing propulsion and the ontogeny of locomotion in Artemia larvae. Biological Bulletin. 187, 164-173 (1994).
- Croghan, P. C. The Mechanism of Osmotic Regulation in the Artemia Salina (L.): The Physiology of the Branchiae. Journal of Experimental Biology. 35, 234-242 (1958).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
- Svoboda, K., Block, S. M. Optical trapping of metallic Rayleigh particles. Optics Letters. 19 (13), 930-932 (1994).
- Hansen, P. M., Bhatia, V. K., Harrit, N., Oddershede, L. Expanding the Optical Trapping Range of Gold Nanoparticles. Nano Letters. 5 (10), 1937-1942 (2005).
- Ohlinger, A., Deak, A., Lutich, A. A., Feldmann, J. Optically Trapped Gold Nanoparticle Enables Listening at the Microscale. Physical Review Letters. 108 (1), (2012).
- Kuwata, H., Tamaru, H., Esumi, K., Miyano, K. Resonant light scattering particles: Practical analysis beyond Rayleigh approximation. Applied Physics Letters. 83 (22), 4625-4628 (2003).
- Agayan, R. R., Gittes, F., Kopelman, R., Schmidt, C. F. Optical trapping near resonance absorption. Applied Optics. 41 (12), 2318-2327 (2002).
- Klar, T., Perner, M., Grosse, S., von Plessen, G., Spirkl, W., Feldmann, J. Surface-Plasmon Resonances in Single Metallic Nanoparticles. Physical Review Letters. 80, 4249-4252 (1998).
- Ohlinger, A., Nedev, S., Lutich, A. A., Feldmann, J. Optothermal Escape of Plasmonically Coupled Silver Nanoparticles from a Three-Dimensional Optical Trap. Nano Letters. 11 (4), 1770-1774 (2011).
- Urban, A. S., Lutich, A. A., Stefani, F. D., Feldmann, J. Laser Printing Single Gold Nanoparticles. Nano Letters. Nano Letters. 10 (12), 4794-4798 (2010).
- Urban, A. S., Fedoru, K. M., Nedev, S., Lutich, A., Lohmueller, T., Feldmann, J. Shrink-to-fit Plasmonic Nanostructures. Advanced Optical Materials. 1 (2), 123-127 (2013).
