脂质双层囊泡代使用微流控喷射
1Department of Mechanical Engineering,University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering,University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology,The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering,University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division,Lawrence Berkeley National Laboratory
Summary
对液滴界面脂双层微流体喷射提供了一种可靠的方法来产生囊泡膜多不对称，跨膜蛋白的结合，以及材料的封装控制。该技术可用于研究多种生物系统，其中隔离的生物分子是理想的。
Abstract
自下而上的合成生物学提出了一种新的方法来调查和重构生化系统和潜在的，最小的生物。这一新兴领域从事工程师，化学家，生物学家和物理学家来设计和组装基本生物成分为复杂的，功能从下往上的系统。这种自下而上的系统可能导致人造细胞的基本生物学查询及创新疗法1,2的发展。巨型单层囊泡（GUVs）可以作为一个模型平台合成生物学，由于其细胞样膜的结构和尺寸。微流喷射，或microjetting，是一种技术，它允许GUVs具有控制尺寸，膜组成，膜蛋白掺入和封装3的生成。该方法的基本原理是利用由压电致动器的喷墨变形暂停升产生多个高频流体脉冲IPID双层成GUV。该过程类似于从肥皂膜吹肥皂泡。通过改变喷出的溶液中，涵盖溶液的组成和/或各组分的组合物包括在双层中，研究人员可以应用这种技术来创建定制的囊泡。本文介绍的程序通过microjetting生成简单的小泡从液滴界面双层。
Introduction
它已成为越来越明显，细胞生物学是涉及整合我们的理解从分子到细胞的多尺度问题。因此，知道分子正是如何独立工作并不足以理解复杂的细胞行为。这部分是由于多组分系统的涌现行为的存在，作为例证的肌动蛋白网络的互动与脂质双层囊泡4，有丝分裂纺锤体组装在非洲爪蟾的重建中提取5，和细菌细胞分裂机械6空间动态。补充解剖生命系统的分子过程的还原论的方法的一个办法是采取重构的细胞行为使用一组生物成分最小的相反的做法。这种方法的一个关键部分涉及生物分子在一个密闭容积可靠的封装，细胞的一个关键特征。
e_content“>几种策略，用于封装的生物分子为研究仿生系统存在，最生物学相关的系统是脂质双层膜，它模仿了细胞的质膜上施加的生化和物理约束。巨单层囊泡（GUVs）由electroformation 7组，最广泛使用的技术GUV代14之一，通常具有差的包封收率，由于其不兼容的高盐缓冲液8。Electroformation也需要大体积样品（> 100微升），这可能是一个问题，用纯化的蛋白加工和低效地结合由于紧密间隔的脂质层之间扩散的难度大的分子。已经开发了几种微流体方法，用于产生脂质囊泡的双乳剂的方法，它通过多层水 – 油 – 水之间的两个接口传递部件（W / O型/ W）时，依赖于一个VO的蒸发latile溶剂驱动脂质双分子层形成9。他人已经使用产生的脂质双层囊泡10或在两个独立的步骤11的连续流微流体装配线。我们已经开发了基于快速应用流体脉冲对液滴的界面双层12生产控制规模，组成和封装GUVs的替代技术。我们的做法，被称为微流控喷射，提供了从现有几个小泡生成技术的综合优势，为创建功能生物分子系统研究各种生物问题的方法。Protocol
1。无限制造商会设计的无穷室使用电脑辅助设计（CAD）软件（命名为它的形状），然后保存文件，这样它是用激光切割机兼容。在由中心到中心的距离的0.15英寸在透明的丙烯酸用激光切割器切割腔室从1/8- 3/16创建这种形状，直径0.183分开两个圆。无穷大的形状有利于液滴界面双层的形成和稳定。 通过丙烯酸系室的边缘钻一个1/16英寸的孔到无穷大形井。重复的相反侧。切离为0.2mm的…
Representative Results
我们已经组建了一个微流体喷射建立在传统的倒置荧光显微镜用自定义的阶段，从加工零件和人工微米组装（ 图1）。喷墨表征提供了洞察囊泡生成过程。不同的喷墨喷嘴和脂质双分子层之间的距离会影响所施加的力，以使膜的变形。靠近双层聚焦的喷流，并防止所述膜从分散能量相差囊泡产生点。涡流行程随施加到压电致动器，与我们的预期（ 图2）相一致的电压。囊?…
Discussion
许多技术已被开发为小泡的产生，包括electroformation，乳液和微滴产生14〜16。然而，新的实验技术是必要的，以允许生物系统的不断增长的相似度来生活系统的设计。特别是微流控方法都提供控制水平的增加管膜unilamellarity，尺寸的单分散性和内部内容17,18，使泡囊模型更接近生物学。此外，使用微流体喷射特性和实验表明定向膜蛋白的有效结合，膜的不对称性，以及封装3,13。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢迈克Vahey从弗莱彻实验室在加州大学伯克利分校进行的microjetting参数的建议。这项工作是由赞助国立卫生研究院授予DP2 HL117748-01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
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Cite This Article
Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).