השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting
Summary
jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.
Abstract
ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה מציגה גישה חדשנית לבירור ולבנייה מחדש של מערכות ביוכימיות ו, באופן פוטנציאלי, אורגניזמים מינימאליים. תחום מתפתח זה עוסק מהנדסים, כימאים, ביולוגים, פיסיקאים ולעצב ולהרכיב רכיבים ביולוגיים בסיסיים למערכות מורכבות, פועלות מלמטה למעלה. מערכות מלמטה למעלה כזה יכול להוביל להתפתחות של תאים מלאכותיים לבירורים ביולוגיים בסיסיים וטיפולים חדשניים 1,2. שלפוחית ענקית unilamellar (GUVs) יכולה לשמש כפלטפורמת מודל לביולוגיה סינתטית בשל המבנה שלהם כמו קרום תא וגודל. jetting microfluidic, או microjetting, הוא טכניקה המאפשרת לדור של GUVs עם גודל מבוקר, הרכב קרום, שילוב חלבון הטרנסממברני, ואנקפסולציה 3. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא השימוש בפולסים מרובים, בתדירות גבוהה נוזל שנוצרו על ידי מכשיר הזרקת דיו ומונע piezo כדי לעוות l מושעהbilayer ipid לבוס. התהליך דומה לפיצוץ בועות סבון מסרט סבון. על ידי שינוי בהרכב הפתרון נשפו, ההרכב של הפתרון המקיף, ו / או הרכיבים הנכלל בbilayer, חוקרים יכולים ליישם טכניקה זו כדי ליצור שלפוחית מותאמת אישית. מאמר זה מתאר את ההליך כדי ליצור שלפוחית פשוטה מbilayer ממשק אגל ידי microjetting.
Introduction
זה הפך להיות יותר ויותר ברור שביולוגיה של תא היא בעיה רב היקף שיש בו שילוב של ההבנה שלנו ממולקולות לתאים. כתוצאה מכך, לדעת בדיוק כיצד מולקולות לעבוד בנפרד אינו מספיק כדי להבין התנהגויות הסלולר מורכבות. זה נובע בחלקו על קיומה של התנהגות מתהווה של מערכות מרובות רכיבים, כפי שהודגם על ידי הכינון מחדש של אינטראקציה ברשת אקטין עם שלפוחית bilayer השומנים 4, הרכבה ציר mitotic בXenopus לחלץ 5, ואת הדינמיקה המרחבית של מנגנונים חלוקת תא חיידק 6. דרך אחת כדי להשלים את הגישה של הרדוקציוניסטית לנתח את התהליכים המולקולריים של מערכות חיות היא לקחת את הגישה ההפוכה של בנייה מחדש של התנהגויות הסלולר באמצעות מספר מינימלי של מרכיבים ביולוגיים. חלק קריטי של גישה זו כרוך אנקפסולציה אמינה של ביומולקולות בנפח מוגבל, תכונה מרכזית של תא.
e_content "> מספר אסטרטגיות קיימות לencapsulating ביומולקולות ללימוד מערכות biomimetic. הרלוונטי ביותר מבחינה הביולוגית המערכת היא קרומי bilayer שומנים, המחקים את האילוצים ביוכימי ופיזיים שהוטלו על ידי קרום הפלזמה של התא. היווצרות שלפוחיות ענקית unilamellar (GUVs) על ידי electroformation 7, אחת הטכניקות הנפוצה ביותר לייצור בוס 14, בדרך כלל יש תשואת אנקפסולציה עניים בשל חוסר התאימות שלה עם חיץ מלח גבוה 8. Electroformation גם דורש כמויות מדגם גדולות (> 100 μl), שעלולה להיות בעיה לעבודה עם חלבונים מטוהרים , ולא יעיל משלב מולקולות גדולות בשל קושי של דיפוזיה בין שכבות שומנים צפופות. מספר גישות microfluidic ליצירת שלפוחית שומנים פותחו. שיטות התחליב כפולות, שעוברים רכיבים באמצעות שני ממשקים בין שכבות מים שמן ומים (W / O / W), מסתמך על האידוי של volatile ממס לנהוג היווצרות bilayer שומנים 9. אחרים השתמשו בקו ההרכבה microfluidic שמייצר זרם רציף של שלפוחית השומנים bilayer 10 או בשני שלבים עצמאיים 11. פיתחנו טכניקה חלופית המבוססת על מהירות החלת פולסים נוזל נגד bilayer ממשק אגל 12 לייצר GUVs של גודל מבוקר, קומפוזיציה, ואנקפסולציה. הגישה שלנו, המכונה jetting microfluidic, מציעה את היתרונות בשילוב בין כמה טכניקות דור שלפוחית קיימות, מתן גישה ליצירת מערכות biomolecular פונקציונליות לחקירת מגוון רחב של בעיות ביולוגיות.Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות רבות פותחו עבור דור שלפוחית, כולל electroformation, תחליב, ודור אגל 14-16. עם זאת, ניסיוני בטכניקות חדשות נחוצות כדי לאפשר את העיצוב של מערכות ביולוגיות עם דמיון הולך וגדל למערכות חיות. שיטות microfluidic בפרט הציעו רמה מוגברת של שליטת שלטון unilamellarity קרום, monodispersity של גודל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למייק Vahey ממעבדת פלטשר באוניברסיטת קליפורניה, ברקלי לקבלת ייעוץ על הפרמטרים microjetting. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
