Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

doi: 10.3791/51510 Published: February 21, 2014

Abstract

Bottom-up syntetisk biologi præsenterer en ny tilgang for at undersøge og rekonstituere biokemiske systemer og potentielt minimale organismer. Dette nye område engagerer ingeniører, kemikere, biologer og fysikere til at designe og samle grundlæggende biologiske komponenter i komplekse og velfungerende systemer fra bunden op. Sådanne bottom-up-systemer vil kunne føre til udvikling af kunstige celler til grundlæggende biologiske undersøgelser og innovative behandlinger 1,2. Giant unilamelvesikler (GUVs) kan tjene som en model platform for syntetisk biologi på grund af deres celle-lignende membran struktur og størrelse. Mikrofluid jetting eller microjetting, er en teknik, der giver mulighed for generering af GUVs med kontrolleret størrelse, membranens sammensætning, transmembrant protein inkorporering og indkapsling 3. Det grundlæggende princip i denne metode er brugen af ​​flere, højfrekvente væske pulser genereret af en piezo-aktiverede inkjet-enhed til at deformere et ophængt lipid dobbeltlaget i en GUV. Processen er beslægtet med at blæse sæbebobler fra en sæbe film. Ved at variere sammensætningen af ​​jetted opløsning sammensætningen af ​​omfattende opløsning og / eller komponenter, der indgår i dobbeltlaget, kan forskerne anvende denne teknik til at oprette tilpassede vesiklerne. Dette papir beskriver den procedure, til at generere simple vesikler fra en dråbe grænseflade dobbeltlaget ved microjetting.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er blevet mere og mere klart, at cellebiologi er en multi-skala problem, der involverer integration af vores forståelse fra molekyler til celler. Derfor vide præcis, hvordan molekyler arbejder individuelt, er ikke tilstrækkeligt til at forstå komplekse cellulære adfærd. Dette skyldes til dels eksistensen af emergente adfærd af multi-komponent systemer, som eksemplificeret ved rekonstituering af actin netværk interaktion med lipiddobbeltlagsvesikler 4, mitotiske spindel samling i Xenopus ekstrakt 5, og rumlige dynamik bakterielle celledeling machineries 6. En måde at supplere reduktionistiske tilgang af dissekere de molekylære processer i levende systemer er at tage den modsatte tilgang rekonstituering cellulære adfærd ved hjælp af et minimalt sæt af biologiske komponenter. En kritisk del af denne tilgang indebærer pålidelig indkapsling af biomolekyler i et begrænset volumen, et centralt element i en celle.

e_content "> Der findes flere strategier for at indkapsle biomolekyler til at studere biomimetiske systemer. Den mest biologisk relevant system er lipiddobbeltlagsmembraner, der efterligner de biokemiske og fysiske begrænsninger, som cellens plasmamembran. Dannelse af gigantiske unilamellare vesikler (GUVs) ved electroformation 7, en af de mest udbredte teknikker til GUV generation 14, har typisk en dårlig indkapsling udbytte på grund af dets uforenelighed med højsaltbuffer 8. electroformation kræver også store prøvevolumener (> 100 ul), som kunne være et problem for arbejdet med oprensede proteiner og ineffektivt inkorporerer store molekyler på grund af vanskeligheden ved diffusion mellem tætliggende lipidlag. Adskillige mikrofluide fremgangsmåder til generering af lipidvesikler er blevet udviklet. De dobbelte emulsions metoder, der passerer komponenter gennem to grænseflader mellem lag vand-olie-vand (W / O / W), afhængig af fordampning af en volatile opløsningsmiddel til at drive lipiddobbeltlag dannelse 9. Andre har brugt en mikrofluid samlebånd der producerer en kontinuerlig strøm af lipiddobbeltlagsvesikler 10 eller i to uafhængige trin 11. Vi har udviklet en alternativ teknik baseret på hurtigt at anvende væske pulser mod en dråbe-interface-dobbeltlag 12 til at producere GUVs af kontrolleret størrelse, sammensætning og indkapsling. Vores tilgang, der er kendt som microfluidic jetting tilbyder de kombinerede fordele fra flere eksisterende vesikel generation teknikker, som giver en metode til at skabe funktionelle biomolekylære systemer til at undersøge en række biologiske problemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Piezoelectric Inkjet MicroFab Technologies MJ-AL-01-xxx xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller MicroFab Technologies CT-M3-02
High-speed camera Vision Research MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform Avanti 850356C Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm Fisher Scientific SLGV033RS
1 ml Syringes Fisher Scientific 14823434
n-Decane Acros Organics 111871000
Glucose Acros Organics 410950010
Sucrose Sigma-Aldrich S7903-1KG
Methylcellulose Fisher Scientific NC9084958
1/8 in Acrylic McMaster Carr 8560K239 CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic Astra Products Clarex clear 001
Acrylic Cement TAP Plastics 10693
Loctite 495 Superglue Fisher Scientific NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive Strobels Supply 30765
Natural rubber McMaster Carr 85995K14
Custom stage homemade N/A CAD designs are available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).More

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter