Abstract
キイロショウジョウバエの胚および幼虫において行われた研究は、このような細胞の運命仕様と器官形成などの発生過程に重要な洞察を提供する。免疫染色は、組織および器官の開発の可視化を可能にする。しかし、胚発生の最後に形成した保護キューティクルは後期胚および幼生への抗体の浸透を防ぐことができます。免疫染色の前に切開を定期的にショウジョウバエ幼虫の組織を分析するために使用される小さな組織を見つけて単離することは困難であるので、それはいくつかの分析のために非効率的な証明する。超音波処理は、幼虫ショウジョウバエの免疫染色プロトコルにおける解剖の代替手段を提供します。これは、後期胚および幼虫の大量の迅速、同時処理を可能にし、 その場で 、形態に維持します。ホルムアルデヒドで固定した後、試料を超音波処理する。次いで、試料を、抗原特異的な一次蟻で免疫染色が施されるibodiesおよび蛍光標識した二次抗体は、蛍光顕微鏡を介して標的細胞型および特定のタンパク質を可視化した。超音波処理の過程で、上記サンプル音波処理プローブ、ならびに超音波処理の持続時間および強度の適切な配置は重要である。標準免疫染色プロトコルへのadditonal小さな変更は、高品質の汚れのために必要とされ得る。対雑音比が低い信号を有する抗体については、より長いインキュベーション時間は、典型的には必要である。この超音波処理促進性プロトコルのためのコンセプトの証明として、発達段階の範囲で3の組織型（精巣、卵巣、および神経組織）の免疫染色を示している。
Introduction
ショウジョウバエの胚および幼虫は多くの器官および組織中の発達過程を研究するための優れたモデルを提供する。個別の細胞のイメージングは、細胞が発達する複雑な環境を確認するために、これらの研究においてしばしば必要である。組織中の細胞の可視化は、免疫染色により達成することができる。プロトコルは17時間産卵（AEL）1-3の後、胚ショウジョウバエ組織 <のために存在する免疫染色よく記載。有効な抗体の浸透を防止胚発生の終了に向かったが、保護キューティクルフォーム、。したがって、これらの免疫染色のプロトコルは、後期胚における組織の分析においてと幼虫の発育（ 第 1齢（L1）、2 番目の齢（L2）、及び第3齢（L3））のその後の段階で非効率的である。この非効率性は、この拡張された発育期間4中に発生した動的プロセスの理解に対する障壁を課している。 TISSUE郭清はこの障壁5-7を回避するために広く使用される技術である。しかし、解剖は非効率的な証明することができます。抽出は、胚および幼虫の組織を配置するか、単離することの難しさによって妨げてもよい。また、標的組織の物理的除去は、それらを破壊するか、またはその全体でそれらを抽出するために失敗することによって損傷を与える可能性がある。
超音波処理は、分子間相互作用を妨害するために音波を用いる方法である。これは、神経細胞型6を開発する免疫染色するために、 ショウジョウバエの幼虫クチクラの完全性を破壊するために使用されている。このプロトコルは、直径8〜10には50μmと小さくすることができ、後期胚および幼虫の生殖腺を、免疫染色するようになってきた。このような研究により、男性生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチ形成のプロセスは、後期に特徴づけられた幹細胞の発生とのdifを調節するショウジョウバエ胚 8-10とメカニズム後期胚性生殖腺と幼虫ferentiationは9-12解明されている。このように、超音波処理が原因組織サイズが難しいかもしれ組織切開への効率的な代替手段を提供します。さらに、生物全体のコンテキスト内のセルを残してその場の形態で維持し、 その場でショウジョウバエ組織の免疫染色を可能にします。ここでは、 その場での初期/中期のL3組織を後期胚の蛍光免疫染色のためのステップバイステップのプロトコルを記述します。 ショウジョウバエの生殖腺組織および神経組織の分析は、このプロトコルの有効性を実証する代表的な結果に示されている。さらに、この免疫染色プロトコルは、外側のキューティクルと他の生物において他のショウジョウバエ組織ならびに組織を分析するように適合され得る。
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Protocol
コレクションケージの調製
- CO 2で、若い、肥沃なハエを麻酔。ケージに麻酔をかけたハエを転送します。最適な収率を得る4で生後2-7日に至るまで、100〜120大人のハエを使用するには、次の男性に、女性の1の割合。許可前固定のための試料を得るに〜24時間、適切な順応期間を飛ぶ。 48時間順応期間 - ケージは処女雌で設定されている場合は、使用36、オスと交配。
- ケージの開放端には、ケージの開口部に中央に酵母ペーストのダイムサイズのドロップで事前に準備されたリンゴジュース寒天プレートを配置。その後、テープで固定します。リンゴジュース寒天プレートとパラフィルムとケージとの間の接合部をシール。
- ベースとしてリンゴジュース寒天プレートと第2の容器にケージを置き、ハエが、実験によって決定される適切な期間のために定義温度で再現することができます。
注：サンプル収集時間のWI変化しちゃう。後期胚/早期のL1幼虫収集する際に、例えば、（17から24時間）、ハエは25℃で17時間前に、サンプルの老化に25℃で7時間、リンゴジュース寒天プレート上に卵を産むことができます。同様に、半ば後半最初の幼虫の収集のため（36から48時間）ハエが25℃で36時間前に、サンプルの老化に25℃で12時間、卵を産むことができます。 - 期間が完了するとハエは麻酔なし離れリンゴジュース寒天プレートからドロップするように、テーブルの上にケージをタップします。すばやく酵母ペーストの低下を含む新鮮なものに用いられるプレートを交換してください。テープとパラフィルムで新しいプレートを固定し、ベースとしてリンゴジュース寒天プレートとケージを保管してください。
- 慎重に金属スパチュラで使用されるプレートから酵母のドロップを削除します。使用リンゴジュースプレートに置き、蓋と実験的に必要であれば、年齢にレイド胚を可能にする。
注：サンプルをエージングしながら、より高い温度は、エクスペリない限り、このプレートを25℃で保存することができるLLY必要です。上記に記載されているコレクションのための胚を熟成する方法の例として（ステップ1.3のための注を参照）。老化をサンプリングする前に酵母ペーストの除去は、酵母にクロールおよびその下の寒天を分割から幼虫を防止するために行われる。残りのリンゴジュース寒天及び酵母ペースト残基は幼虫の成長のための栄養素を提供する。酵母ペーストに直接敷設胚酵母ペーストの除去によって失われているが、この損失は、染色効率を低下させることができ、サンプル中の酵母および寒天残留することが好ましい。一つは、酵母ペーストを除去しないことを選択すべきは、酵母はペイントブラシと混合し、リン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）で液化し、その後、固定前に、細胞ストレーナーを試料から除去することができる。
2。固定
- リンゴジュース寒天プレート上に置か胚は所望の時点に老化したら、慎重に目からサンプルを除去するためにリン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）水溶液で湿らせ、小さな絵筆を使う電子版。
注：古い幼虫がモバイルであり、蓋の内側にクロールすることができる。このサンプルは、絵筆で除去することによって、同様に収集することができる。 - セルストレーナーの内側に面した尾根に対してサンプルを含んだ絵筆を拭きます。その後、PBTx溶液を含む噴霧ボトルとストレーナーの壁や絵筆をすすぐ。 PBTxソリューションをキャプチャするために、ストレーナの下にペトリ皿のカバーを置きます。
- すべてのサンプルは、ストレーナに転送された後に、メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐ。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。
- 酵母を除去し、サンプルと一緒に転送されている可能性があり、廃棄物を飛ぶために繰り返して、ステップ2.3三回。
- メッシュから幼虫を高めるために、ストレーナに十分な、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）/水（のddH 2 O）水溶液を注ぐ。幼虫は5分間溶液に座ってできるようにします。その後、ストレーナを持ち上げ、tは注ぐ彼液体廃棄物容器内のペトリ皿の内容。
注： - 絨毛膜を除去するために、22時間ブリーチのみ0歳胚のサンプルが必要である。古いサンプルへの漂白剤の塗布を省略することができるが、その含有は有害ではない。省略を希望する場合は、PBTxと、この工程で漂白剤を交換してください。希薄化後漂白剤は溶液調製の24時間以内に使用する必要があります。 - メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐことにより、PBTxとストレーナでサンプルを洗浄します。サンプルは3分間溶液に座ってできるようにします。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。
- 繰り返しステップ2.6の5倍。
- デイブセルストレーナーの乾燥の下部には、絵筆を使ってPEMS液1.75 mlを含むシンチレーションバイアルにサンプルを移す。
- 換気されたドラフト内で作業する、シンチレーションバイアルに37％ホルムアルデヒド250μlの試薬グレードのヘプタン8ミリリットルを追加します。
- バイアルを20分間200回転または同様の適度なスピードで振るようにします。
- 前の水相を除去することなく、シンチレーションバイアルに10mlのメタノールを加え、バイアルを1分間500rpmで激しく振りすることができます。
注意：メタノールは危険です。換気されたドラフト内で作業し、適切な手袋を着用し続けます。 - シェーカーからバイアルを取り出し、すぐにフード内の液体廃棄物容器の上にセルストレーナーに内容を注ぐ。バイアルに余分なメタノールを追加し、すべてのサンプルが削除されていることを確認するために、必要に応じてセルストレーナーを介して実行。
注：セルストレーナーがゆっくりと排出することができる。これを解決するには、より迅速にストレーナーを通して溶液を引くために、セルストレーナーの底に実験室の組織をタッチします。メタノール、ホルムアルデヒド、およびヘプタンであるべき施設のガイドラインに従って適切に廃棄するまで、適切な廃棄物容器に格納されている。 - 実験室の組織を用いて細胞ストレーナーの乾燥底部は、次いでメタノール0.5 mlを含む1.5mlのマイクロチューブにストレーナに取り込まれたサンプルを転送するために絵筆を使用しています。
セルストレーナー上での乾燥からサンプルを防ぐために、一度に2.12と2.13 1バイアル複数のシンチレーションバイアルが使用されている場合は、手順：注意してください。 - 試料が微量遠心管に添加された後、ピペットを用いて、メタノールを除去。サンプルは、チューブの底に沈殿していることを確認してください。
- 試験管にメタノール約0.5ミリリットルを添加することにより微量遠心管中に試料をすすぐ。その後落ち着くピペットでメタノールを除去するためのサンプルのを待ちます。
- 繰り返しステップ15三回。
- 試験管にメタノールを0.5ミリリットルを追加し、後で使用するために℃の冷凍庫-20℃で保存する。
3。再水和および免疫染色用サンプルの調製
- チューブ内のサンプルを残して、ピペットを用いてマイクロチューブからメタノールを除去します。適正処理するまで、適切な廃棄容器に保管メタノール廃棄物。
、超音波処理効率を向上させるために、試料のせいぜい3ミリメートルを1.5 mlマイクロチューブの底に沈降していない使用します。注意してください。過剰のサンプルは、上記の再水和ステップを始める前に、ピペットを用いて別のチューブに移すことができる。清浄なカミソリの刃でピペットの先端をカットするピペットチップの目詰まりを防止するために使用することができる。 - 3分間、チューブやロックに50％メタノール/リン酸緩衝液のTween（PBTw）溶液1.0mlを追加します。
- 適切な廃棄容器にメタノール水溶液を取り出し、二回PBTwの1.0μlを洗い流してください。各リンス後、サンプルをピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。
- バイアルと岩に混ぜウシ血清アルブミン/リン酸緩衝トゥイーン（BBTw）の1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、SAMPを許可ルを沈降し、ピペットでBBTwを削除します。
- 繰り返しステップ3.4最後の洗浄後のサンプルを失うことなく、可能な限り多くのBBTwを削除するように注意しながら2回。
- チューブにBBTwの0.5ミリリットルを加え、チューブを氷上に置きます。
サンプルの4。超音波処理
- 10％最大振幅の超音波処理装置を設定し、2秒定数の超音波処理の実行時間を指定します。
注：これらの設定は、材料および装置の表に示されている超音波処理装置に固有であり、異なる超音波処理の最適化が必要な場合があります。 - サンプルの超音波処理に先立って、50ミリリットルにプローブを洗浄するために、脱イオン水および実行ソニケーターで満たされたコニカルチューブをプローブ先端を配置することによって、超音波処理器プローブを清掃してください。走行後、実験室組織とドライ超音波処理器プローブ。
- それが位置するように、約3〜4ミリメートルのサンプルの上に試料を含有するマイクロチューブにプローブを浸し、超音波処理を開始します。
- Mを削除するicrocentrifuge管および超音波処理からの熱を放散し、試料を微量遠心チューブの底に沈降させるために、少なくとも30秒間、氷上に置く。
- 処理されているサンプルの年齢に基づいて、必要に応じて繰り返します4.3と4.4を繰り返します。
注：最適な超音波処理のサンプル·ボリュームの場合、より若い17時間を胚は超音波処理を必要としませんが、17および24時間（ステージ17 /早-L1）との間のものが2超音波処理を必要とします。 36（初期/中期L1）、36 - - 48（中期/後期-L1）、48から60（初期/中期L2）、60から72（中期/後期-L2）、72から84（24との間の幼虫早期L3）、84から96（初期/中期L3）、96 - ）108（中期/後期-L3時間はそれぞれ5、9、11、13、15、18、22超音波処理を必要とする。超音波処理時間へのさらなる詳細のための議論を参照してください。 - BBTw回1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。
- バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。</李>
- 繰り返しステップ4.7の2倍。
5。免疫染色
- マイクロ遠心チューブにBBTwで希釈した5％正常血清を添加することにより、サンプルをブロックします。 1時間ロッキング後のブロックを削除します。
注：二次抗体が生成される種から正常血清を使用してください。 - 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な一次抗体を希釈します。
- 4℃で、または（約22°C、室温で少なくとも3時間、一次抗体溶液をOで岩石試料/ N。
注：抗体インキュベーション時間および温度は変更になる場合があります。 O / NをRTで4℃でのインキュベーション、または3時間、典型的には十分である。しかし、2日間のインキュベーション期間は、特に古いサンプルまたは低親和性の一次抗体を使用すると、染色の品質を向上させることができる。より長いインキュベーションは、典型的には4℃で行われる。二次抗体を使用した場合、同様の考察は（5.10を参照）を行う必要があります。 - サンプルはに沈むことを許可マイクロチューブの底。ピペットを用いて一次抗体をオフに描画します。必要に応じて再利用するための抗体を保存します。
- 二回BBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。
- バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。
- 繰り返しステップ5.6の5倍。
- マイクロ遠心チューブに5％正常血清/ BBTw溶液を添加することによって、ブロックのサンプル。 1時間に30分間ロッキング後のブロックを削除します。
注：この追加のブロッキング工程は必須ではありませんが、特異的な抗体の染色品質を向上させることができる。 - 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な二次抗体を希釈する。
- 露光に起因する退色低減するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。 4℃で12時間〜48用の二次抗体溶液中またはRT（約22℃で少なくとも3時間岩石試料。
- サンプルはマイクロチューブの底に沈殿することを許可する。ピペットを用いて二次抗体をオフに描画します。
- 二回PBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。
- バイアルと岩にPBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上で5分後、サンプルをピペットでPBTwを解決して削除することができます。
- 繰り返しステップ5.13三回。
- オプション：PBTw 1,000：DAPIは1に希釈し追加します。岩石試料は、3分間のアルミホイルに包まれ;その後ピペットでDAPI溶液を取り除く。サンプルはピペットでPBTwを削除する前に沈降させ、PBTwの1.0ミリリットルで5回洗浄します。
- -20℃でのマイクロ遠心チューブとストアに1,4 - ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）溶液100μl - 80を追加する。
注：別のグリセロールベースのアンチフェード剤は、置換されていてもよい。
6。分析
- DABCO / P-フェン10μlの - スライド上にサンプルをマウントする前に、余分な5を追加メチレンジアミン（PPD）マイクロチューブに退色防止ソリューションを提供します。
注：サンプルは、切開せずにスライドに添加することができる。スライドに添加された試料体積は、カバースリップの大きさによって変化する。スライド上にサンプルをピペッティングすると、ピペットチップは、試料の剪断を防止するために、カミソリの刃を用いて切断することができる。それは簡単な分析のために列にサンプルを並べることが有用であることが多い。付加的な退色防止剤としてPPDの添加は必要とされないかもしれないが、サンプルは長期間保存した場合、光退色を防止することができる。 - 静かにサンプル上のカバーガラスを配置します。マニキュアを使用して適切な位置で、安全なカバースリップ。
- ビューは、蛍光顕微鏡を使用してサンプルをマウントした。
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Representative Results
その場での後期胚および幼虫の組織の分析において超音波処理ベースの免疫染色の有効性を実証するために、野生型の胚および幼虫は精巣、卵巣、および神経組織の免疫染色のために処理した。サンプルは、共焦点顕微鏡を介して画像化した代表的な結果は、（ 図1及び図2）が示されている。結果は、記述されたプロトコルは、 ショウジョウバエの開発の初期/中期のL3段階を経て、後期胚の間に形態学的特徴だけでなく、 その場における個別の細胞を可視化するために有効であることを明らかにした。
精巣イムノ結果：
精巣の発達は、精巣の成熟が幼虫の発育を通じて動的であるため、プロトコルの有効性を説明するための特に良いシステムです。大人のショウジョウバエの精巣は、13を参照してください（生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチが配置さ1盲端とコイル状の管を形成レビューのための14）。このニッチでは、GSCsは、ハブと呼ばれる非有糸分裂体細胞のタイトなクラスターの周りに配列されている。 GSCsは、ハブに固定されたまま、そのgonialblast娘が離れて幹細胞ニッチからずれているものGSCを生成するように非対称分裂を受ける。 gonialblastが不完全分割したように、細胞質の拡張は、精原細胞内のセルを接続する、fusomesフォームと呼ばれる。 4連続した分裂した後、精原細胞は精子を形成するために、減数分裂を開始します。
精巣形成は胚形成の間の始原生殖細胞（始原生殖）および体性腺前駆細胞（のSGPs）のアソシエーション（レビューのために15,16を参照）から始まる。この関連は、胚発生8-10年末までに機能的なGSCニッチの形成をもたらす。半ばL1で、GSCニッチ内の非対称GSC部門が分岐したfusomes 9精原細胞を分化を生じさせる。非対称GSC部門は、幼虫全体で継続し開発、追加の精原細胞および生殖腺の大きさの漸進的増加の産生をもたらす。生殖細胞、ハブ細胞、およびfusomesに対して免疫後期胚および初期/中期L1、L2、およびL3精巣の代表的な画像は、（ 図1A-D）に示されている。これらの画像は、経時的に精巣で観察された生殖腺のサイズおよび生殖細胞分化の動的変化を示す。
卵巣イムノ結果：
大人のショウジョウバエの卵巣をovarioles（レビューのために17,18を参照）と呼ばれる16〜20の個別の卵を生産する単位で構成されている。各卵巣小管の一端で、構造が胚腺幹細胞ニッチを含んで呼ばれる。キャップ細胞と端末フィラメント細胞（TFS）：卵巣小管ニッチ未分化GSCsおよび体細胞の2集団で構成されている。精巣と同様に、GSCsキャップ細胞と分化する娘細胞に隣接したままで1 GSCを生成する非対称分裂を受ける、ニッチから離れてプッシュさcystoblastと呼ばれる。 cystoblastはその後、分枝状fusomeによって相互接続された生殖系列嚢胞を形成し、細胞分裂の4ラウンドを受ける。各生殖細胞-嚢胞は、それは卵巣小管の長さに沿って移動するときに成熟し続けて卵室を生産する卵胞細胞に囲まれています。
精巣と同様に、卵巣は、まず胚16,18の間に形成される。複数ovariolesは始原生殖細胞とのSGPsで構成される単一の胚性生殖腺から生じる。生殖細胞は、SGP由来混在細胞（ICS）19-22と卵巣後部関連付けるに局在しながら、半ばL3で、SGPsのは、卵巣前方でのTF前駆体を生じさせる。後期L3で、TFの細胞が分化して成体幹細胞ニッチに見られるスタックに編成し、GSCsキャップ細胞が確立されており、生殖細胞嚢胞分化は19,20,23が観察される。後期胚および初期/中期のL3卵巣、immunostaの代表的な画像生殖細胞、SGPsの、ICを、TF前駆体、およびfusomes用INED（ 図1E、F）が示されている。これらのイメージは、自分の年齢のための正常な形態と発達の進行を示している。
ニューラルイムノ結果：
ショウジョウバエ中枢神経系（CNS）の神経幹細胞に由来し、胚神経上皮から生じると呼ばれる神経芽細胞（NBS）は、（レビューのために24,25を参照）。胚および幼虫の格差でのNBSが非対称に今度は、成人の脳と腹側神経索で見られるニューロンとグリア細胞を生成、という神経母細胞（GMC）を生成する。幼虫のNBは、大人のニューロンの大部分を生じさせ、脳内でのそれらの位置に基づいて区別することができるので、幼虫の脳は、NBの行動や神経分化を研究するための重要なモデルとなっている。
L3の脳は、2つのローブと中央に配置され、腹側神経索24で構成されている。NB中、GMCを、未分化神経細胞、未熟および一次ニューロンとグリア細胞について免疫染色半ばL3脳の代表的な画像（ 図2A-C）26〜30 を示している。これらの画像は、脳の葉と腹側神経索内の異なる発現パターンの強い染色を示した。取付姿勢に応じて、撮像が背側表面（ 図2A）から、腹面（ 図2B）、または矢状断面（ 図2C）で脳組織の可視化を可能にする。
染色効率：
当社の代表的な結果は、超音波処理ベースの免疫染色手順は汎用性があることを示している。だけでなく、それは特定の細胞型を同定するために使用できるだけでなく、特定のタンパク質と細胞小器官の存在を示すために使用することができる。しかし、あいまいな結果は、染色効率の期待の変動から生じる場合があります。例えば、抗脈染色された少なくとも一つの性腺抗ELAVは幼虫の86％で中脳を染色した（n = 115）しながら、すべての幼虫の73.2％で調べた（n = 781）。さらに、染色効率はおおよそ反比例発達段階にあることを確認します。後期胚において、抗脈は染色は、それぞれ、L2およびミッドL3でわずか59.8％と幼虫の46.9％に存在していたものの、89.8生殖腺の％（N = 206）を染色した（n = 132および49）。また、超音波処理は、サンプルの損失をもたらす。胚および最適な超音波処理試料体積中に存在する幼虫の数が前および超音波処理後に計数したところ、試料の41.0％の平均が分析た（n = 1165）には適さ決定した。染色効率を最大にするために、プロトコルは、公開された抗体濃度または抗体インキュベーション時間を変更することにより特異的抗体のために最適化されるべきである。
図1：Iその場でのショウジョウバエの生殖腺のmmunostain後期胚（ステージ17 /早-L1）でのその場での精巣の（AD）画像の赤抗ヴァーサ（AD、を用いて免疫染色初期/中期L3幼虫を通して; A'-D '単独で）、抗Fasicilin III（FasのIII）および抗1B1（AD、緑生殖細胞を検出するために、A ' - D'は、それぞれハブ細胞及びfusomesを検出する単独'）、およびDAPI（AD、青、A' '' -D ''核を検出するための）単独の'。（A）ステージ17 /早期のL1精巣の未分化生殖細胞に新たに合体ハブと球状fusomesを示している。（B）アーリー/ミッドL1精巣はGSCs球状fusomesがローカライズを示し生殖細胞は、初期精原分化を示すfusomes細長いハブ近く、いくつかの後方にある。（C）アーリー/ミッドL2と
その場での図2イムノショウジョウバエの神経組織の。アーリー/ミッドL3幼虫（抗ELAVで免疫染色
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Discussion
このプロトコルは、成功したので、解剖の必要性を排除し、 その場でターゲットショウジョウバエ胚および幼虫組織を免疫染色する方法を提供する。初期胚の1,2,3を染色するための従来のプロトコルに従って、絨毛膜は、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）を用いて除去される。サンプルは、ホルムアルデヒドおよびメタノール中で固定されている。幼虫のクチクラ古いサンプルが浮いてしまうため、試料全体はその後幼虫保持を確実にするために、セルストレーナーを通過させる。サンプルは、化学グレードのメタノール中に、必要に応じて、格納されている。再水和した後、適切に実装され、超音波処理プロセスは、幼虫のクチクラの完全性を破壊する。これは免疫染色のために必要な抗体の十分な浸透を可能にするためにキューティクルを形成した後に非常に重要です。 5％正常血清でサンプルを、抗体を適用する前に、ロッキング/ BBTw溶液は、過剰な非特異的抗体結合を防ぎます。一次抗体は、特定のタンパク質EXPRESを検出するために追加される標的組織内のsed。未結合一次抗体を除去するために洗浄した後、フルオロフォアに結合した二次抗体が結合した一次抗体の位置をマークするために使用される。分析は、その後エピ蛍光または共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
いくつかの変更は、個別の状況では、結果を最適化するために必要とされてもよい。具体的には、超音波処理パワーと行わ音波処理の数は、使用ソニケーターに応じて調整する必要があります。サンプルを上記と同様に溶液の体積に超音波処理器プローブの高さの適応は、異なる超音波処理、または十分なサンプルが得られない場合に必要とされてもよい。増大した溶液濁度は、従って、超音波処理があまりにも重篤である場合のゲージを提供し、組織溶解の指標として使用することができる。溶液の濁度が高くなった場合、実験者はsonicatoの高さを上げ、溶液の体積を増加させる、超音波処理を行う回数を減らすことを検討すべきr個のサンプル上記のプローブ、および/または超音波処理器の電力を低減することができる。
改変はまた、画像品質を向上させるために免疫染色プロトコルで必要とされ得る。ほとんどの免疫染色手順と同様に、信号対雑音比を、抗体希釈、時間とサンプルとの抗体インキュベーションの温度を改変する、および/または使用する試薬を遮断することによって変更することができる。各抗体は、独立して考慮されなければならないが、特に抗体の希釈に関しては、より長い期間のために4℃でのインキュベーションは、特に低い信号対雑音比、および時古い幼虫が検査されると抗体を、超音波処理後の染色の品質を向上させることができることを見出した。これらの例では、染色の質は、二次抗体希釈のわずかな減少から利益を得ることができる。このプロトコルでは、ブロッキング試薬としてBSAおよび血清の両方を含む、試料を染色品質を高めるために二次抗体の添加の前にブロックされ直される。抗体の使用に応じてdは、両方のブロッキング試薬の再閉塞及び包含は、または染色を増強するために必要とされなくてもよい。再ブロッキング工程を省略した場合、長い洗浄およびすすぎは、よりクリーンな画像を生成することができる。最後に、予備吸収ポリクローナル抗体は、シグナル対ノイズ比を増加させることができる。予備吸収は、再水和胚または免疫染色1で使用する前に幼虫を、所望の抗体をインキュベートすることによって行われる。
当社の代表的な結果に示されるように、超音波処理は、その場で標的組織の明確な可視化を可能にするため、免疫染色プロトコルにおける組織切開への合理的な代替手段を提供します。解剖が原因、位置単離し、損傷していない標的組織を抽出するのが困難にショウジョウバエの胚および幼虫に面倒です。別の方法として超音波処理は、組織が生物全体のコンテキストで維持することができます。超音波処理は、スライドとカバーSLIの間で組織を抽出し、取り付け避けるのでpは、より正確インサイチュ形態で保存する。多くの生物が同時に超音波処理することができるので、実質的に、試料の大量の、将来の分析のため、より迅速に処理することができる。
超音波処理は、解剖に大きな選択肢を提供しますが、それが考慮されなければならない制限があります。超音波処理は、有益に幼虫キューティクルの完全性を崩壊させるが、（代表的な結果を見てください）過程でいくつかのサンプルを破壊する。生物学的破片を除去するすすぎは、さらにサンプルサイズを減らすことができ、超音波処理プロセスは、次の必要とされる。また、全体の胚および幼虫を免疫染色すると、周囲の組織に埋め込まれた目的の組織を残す。これらの周辺組織は、正に染色するか、最終的な画質を低減し、非特異的抗体結合を示すことができる。最後に、染色効率を可変することができます。この変動は、サンプルの年齢、超音波処理の有効性および抗体特異性に依存してもよい。その結果、超音波処理、Baなどホールマウント組織のsedの免疫染色は常に好ましくない場合があります。後期-L3幼虫に大きな組織を研究する際に特に、解剖ベースの免疫染色は、より効率的な場合があります。さらに、超音波処理は、早発および中間段階の胚をせん断することができます。これらの制限にもかかわらず、超音波処理ベースの免疫染色は、初期/中期L3幼虫を通して後期胚におけるさまざまな組織の発展を分析するのに適している高効率な手法である。私たちの研究室では、定期的にショウジョウバエの胚および幼虫9,10において生殖腺の形態形成を研究するために、このプロトコルを使用しています。さらに、私たちはこのプロトコルの実装は保護クチクラとショウジョウバエの他の組織の発達を研究すると、他の生物においても同様に実りを証明することを期待しています。
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Acknowledgments
私たちは親切ヴァーサとトラフィック·ジャム抗体を供給ルースリーマンとDorthea Godtに感謝しています。私たちは、NICHDの後援の下で開発し、アイオワ大学によって維持提供株式や発達研究ハイブリドーマバンクを維持するためのインディアナ大学ブルーミントンストックセンターを承認したいと思います。私たちは、彼らのアドバイスとサポートのためにWawersikラボのすべてのメンバーに感謝します。この作品は、モンロー学者プログラムグラントとNSF（AFとLBに）（MW）のIOS0823151を付与することによって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
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