Abstract
Studien in Drosophila melanogaster Embryonen durchgeführt und Larven stellen eine wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse wie Zell Schicksal Spezifikation und Organogenese. Immunfärbung ermöglicht die Visualisierung von sich entwickelnden Geweben und Organen. Eine Schutz Kutikula, die am Ende der Embryogenese bildet Jedoch verhindert die Permeation von Antikörpern in der späten Phase Embryonen und Larven. Während Dissektion vor der Immunfärbung wird regelmäßig verwendet werden, um Drosophila Larven Gewebe zu analysieren, erweist es sich als ineffizient für einige Analysen, weil kleine Gewebe kann schwierig sein, zu lokalisieren und zu isolieren. Beschallung stellt eine Alternative zur Dissektion in Larven von Drosophila-Immunfärbung Protokolle. Es ermöglicht die schnelle, gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Late-Stage-Embryonen und Larven und pflegt in situ Morphologie. Nach Fixierung in Formaldehyd wird eine Probe beschallt. Probe wird dann auf die Immunfärbung mit Antigen-spezifischen primären ant unteribodies und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper zur Zielzelltypen und bestimmte Proteine über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Während des Prozesses der Ultraschallbehandlung ist die richtige Plazierung einer Beschallungssonde über der Probe, sowie die Dauer und die Intensität der Beschallung, kritisch. Für hohe Qualität Flecken können Zusätzliche kleinere Änderungen zur Standard-Immunfärbung Protokolle erforderlich. Antikörper mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis, in der Regel längere Inkubationszeiten erforderlich. Als Beweis für dieses Konzept Beschallung-Protokoll erleichtert, zeigen wir Immunfärbungen der drei Gewebetypen (Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe) mit einer Reihe von Entwicklungsstufen.
Introduction
Drosophila-Embryonen und Larven bieten ein hervorragendes Modell, um Entwicklungsprozesse in vielen Organen und Geweben zu untersuchen. Imaging von einzelnen Zellen ist notwendig, um die komplexen Umgebungen, in denen Zellen entwickeln oft festzustellen, die in diesen Studien notwendig. Visualisierung von Zellen im Gewebe durch Immunfärbung erreicht werden. Gut beschriebene Immunfärbung Protokolle für embryonale Gewebe Drosophila <17 Stunden nach der Eiablage (AEL) 1-3 existieren. Jedoch kann eine Schutz Kutikula Formen gegen Ende der Embryogenese und verhindert wirksam Antikörper Permeation. Somit sind diese Immunfärbung Protokolle ineffizient bei der Analyse von Gewebe in der späten Phase Embryonen und in nachfolgenden Stufen der Larvenentwicklung (1. Larvenstadium (L1), 2. Larvenstadium (L2), und 3. Larvenstadium (L3)). Diese Ineffizienz erlegt eine Barriere, um unser Verständnis der dynamischen Prozesse, die während dieser erweiterten Entwicklungsphase 4 auftreten. Tissue Dissektion ist eine weit verwendete Technik, um diese Barriere zu umgehen 5-7. Allerdings kann Dissektion beweisen ineffizient. Die Extraktion kann durch Schwierigkeiten bei der Lokalisierung oder Isolieren embryonalen und Larvengewebe belastet werden. Darüber hinaus kann die physische Entfernung von Zielgeweben Schäden durch Zerreißen oder sie verstoßen, sie in ihrer Gesamtheit zu extrahieren verursachen.
Ultraschallbehandlung ist ein Verfahren, das die Schallwellen verwendet, um intermolekulare Wechselwirkungen stören. Es wurde verwendet, um die Integrität des Drosophila Larvencuticula um Immunfärbung entwickeln neuronalen Zelltypen 6 zu stören. Dieses Protokoll wurde angepasst, um im Spätstadium der embryonalen und Larven Gonaden, die so klein wie 50 um im Durchmesser 8-10 sein können Immunfärbung. Durch solche Studien hat der Prozess der männlichen Keimbahn-Stammzellen (GSC) Nischenbildung im späten Stadium charakterisiert Drosophila-Embryos 8-10 und Mechanismen, die der Stammzellentwicklung und difzierung im späten Stadium der embryonalen Keimdrüsen und Larven sind aufgeklärt worden 9-12. So stellt Beschallung eine effiziente Alternative zu Gewebedissektion die schwierig sein kann, weil der Gewebegröße. Darüber hinaus ermöglicht es die Immunfärbung von Drosophila Gewebe in situ, so dass Zellen im Kontext des Gesamtorganismus und die Aufrechterhaltung in situ Morphologie. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Fluoreszenz-Immunfärbung von Spätstadium der embryonalen bis Anfang / Mitte L3 Gewebe in situ. Analyse von Drosophila Gonaden und Nervengewebe in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, um die Wirksamkeit dieses Protokoll zu demonstrieren. Weiterhin kann diese Immunofärbungsprotokoll angepasst anderen Drosophila-Gewebe sowie Gewebe in anderen Organismen mit einem äußeren Nagelhaut zu analysieren.
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Protocol
1. Herstellung einer Sammlung Cage
- Betäuben junge, fruchtbare Fliegen mit CO 2. Übertragen betäubten Fliegen auf einen Käfig. Um eine optimale Ausbeute zu erhalten, verwenden Sie 100-120 erwachsenen Fliegen von 2-7 Tagen des Alters bei einem 4: 1-Verhältnis von Frauen zu Männern. Fliegen ermöglichen eine angemessene Eingewöhnungszeit, ~ 24 Stunden vor der Probe für den Erhalt Fixierung. Wenn der Käfig wurde mit jungfräulichen Weibchen gesetzt gepaart, um Männer, eine Verwendung einer 36 - 48 h Akklimatisierung.
- Am offenen Ende des Käfigs, legen Sie einen vorbereiteten Apfelsaft-Agar-Platte mit einer Dime-Größe Tropfen Hefe-Paste in der Mitte über der Öffnung des Käfigs. Dann sichern Sie sie mit Klebeband. Verschließen Sie den Übergang zwischen der Apfelsaft-Agar-Platte und der Käfig mit Parafilm.
- Platzieren Sie den Käfig in einem zweiten Behälter mit Apfelsaft Agarplatte als Base und ermöglichen die Fliegen bei einer bestimmten Temperatur für eine geeignete Zeitperiode zu reproduzieren, wie durch das Experiment bestimmt.
Hinweis: Musterkollektion mal will variieren. Wenn zum Beispiel das Sammeln spät Embryonen / frühe L1-Larven (17. - 24. Stunde), ermöglichen Fliegen Eier auf Apfelsaft Agarplatten für 7 h bei 25 ° C vor dem Altern der Probe für 17 Stunden bei 25 ° C lag. Ähnlich, für eine Sammlung von mittleren bis späten ersten Larvenstadium (36 - 48 h) entfernt, um zu ermöglichen Eier 12 Stunden bei 25 ° C vor der Alterung der Probe für 36 Stunden bei 25 ° C lag. - Sobald der Zeitraum abgeschlossen ist, tippen Sie auf den Käfig auf einen Tisch, so dass Fliegen fallen weg von der Apfelsaft-Agar-Platte ohne Narkose. Ersetzen schnell die verwendete Platte durch eine neue, die einen Rückgang von Hefe-Paste. Sichern Sie die frische Platte mit Klebeband und Parafilm und bewahren Sie den Käfig mit Apfelsaft-Agar-Platte als Basis.
- Entfernen Sie vorsichtig das Hefe-Drop aus der gebrauchten Teller mit einem Metallspachtel. Deckel auf Platte verwendet Apfelsaft und legte ermöglichen Embryonen nach Alter, wenn experimentell notwendig.
Anmerkung: Während Alterungs Proben können die Platten bei 25 ° C gelagert werden, wenn höhere Temperaturen Experimentally erforderlich. Beispiele, wie man Embryonen für die Sammlung sind oben beschrieben altern (siehe Hinweis für Schritt 1.3). Entfernung von Hefe-Paste vor dem Altern zu probieren durchgeführt, um Larven von kriechen in die Hefe und das Aufbrechen der Agar unter verhindern. Die restlichen Apfelsaft-Agar und Hefe-Paste Rest liefern die Nährstoffe für das Larvenwachstum. Während Embryonen direkt in der Hefe Paste gelegt werden durch Entfernen der Hefe-Paste verloren geht, ist dieser Verlust vorzuziehen, Hefe und Agar-Rückstand in der Probe, die Färbungseffizienz verringern kann. Sollte man sich entscheiden, die Hefe-Paste zu entfernen, kann Hefe mit Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx) verflüssigt werden, mit einem Pinsel vermischt und dann aus der Probe mit einer Zelle Sieb vor der Fixierung entfernt wird.
2. Fixation
- Sobald Embryonen auf die Apfelsaft-Agar-Platte gelegt haben, um die gewünschten Zeitpunkt im Alter, mit einem kleinen Pinsel mit Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx) Lösung benetzt, um Probe vorsichtig aus th entfernenE Platte.
Hinweis: Ältere Larven sind mobil und können auf der Innenseite des Deckels zu kriechen. Diese Probe kann in ähnlicher Weise von der Entfernung mit einem Pinsel gesammelt werden. - Wischen Sie die Probe beladenen Pinsel gegen den nach innen gerichteten Grat einer Zelle Sieb. Dann spülen Sie die Wände des Sieb und den Pinsel mit einer Spritzflasche enthält PBTx Lösung. Legen Sie eine Petrischale unter dem Deckel Sieb, um die PBTx Lösung zu erfassen.
- Nachdem alle die Probe auf das Sieb übertragen worden ist, gießen Sie genug PBTx in das Sieb, um die Probe aus dem Netz zu erhöhen. Dann heben Sie den Sieb und gießen Sie den Inhalt der Petrischale in eine flüssige Abfallbehälter.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3 dreimal, um Hefe zu entfernen und fliegen Abfälle, die zusammen mit der Probe übertragen worden sein können.
- Gießen Sie genug 50% Bleichmittel (NaOCl) / Wasser (ddH 2 O)-Lösung in das Sieb, um die Larven des Netzes zu erhöhen aus. Dass die Larven in Lösung für 5 min sitzen. Dann heben Sie das Sieb und gießen Sie ter Inhalt der Petrischale in einem Abfallbehälter.
Hinweis: - 22 Stunden, um den Chorion-Membran zu entfernen Bleach ist nur in embryonalen Proben im Alter von 0 erforderlich. Die Anwendung von Bleich ältere Proben weggelassen werden kann, aber seine Aufnahme nicht schädlich ist. Wenn Unterlassung gewünscht wird, ersetzen Sie das Bleichmittel in diesem Schritt mit PBTx. Verdünnt Bleich sollte innerhalb von 24 h Herstellung der Lösung verwendet werden. - Waschen Probe in das Sieb mit PBTx durch Gießen genug PBTx in das Sieb, um die Probe aus dem Netz zu erhöhen. Erlauben Probe in Lösung für 3 min zu sitzen. Dann heben Sie den Sieb und gießen Sie den Inhalt der Petrischale in eine flüssige Abfallbehälter.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 fünfmal.
- Tupfen Sie den Boden der Zelle Sieb trocknen, dann in einen Probentransfer Szintillationsfläschchen, die 1,75 ml PEMS Lösung mit einem Pinsel.
- Die Arbeit in einem belüfteten Laborabzug, fügen Sie 250 ul 37% Formaldehyd und 8 ml Reagenz Heptan auf die Szintillationsfläschchen.
- Lassen Sie die Flasche bei 200 Umdrehungen pro Minute oder einer ähnlichen mäßiger Geschwindigkeit für 20 min schütteln.
- 10 ml Methanol in Szintillationsfläschchen, ohne die frühere wässrigen Phase und damit die Ampulle kräftig bei 500 Upm für 1 min schütteln.
Hinweis: Methanol ist gefährlich. Weiterhin in einem belüfteten Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete Handschuhe. - Entfernen Fläschchen aus Shaker und gießen Sie sofort Inhalte in eine Zelle Sieb über einem Abfallbehälter in der Kapuze. Fügen Sie Zusatz Methanol in das Fläschchen und führen durch die Zelle Sieb wie nötig, um sicherzustellen, dass alle Proben wurde entfernt.
Hinweis: Zellsiebe kann langsam abfließen. Um dies zu vermeiden, berühren ein Labor Gewebes am Boden der Zelle Sieb, um die Lösung durch den Filter schneller zu ziehen. Methanol, Formaldehyd und Heptan solltein geeigneten Abfallbehälter bis zur ordnungsgemäßen Entsorgung nach den Richtlinien des Instituts gespeichert. - Trockenen Boden der Zelle Sieb mit einer Labor Gewebe, dann verwenden Sie einen Pinsel, um Probe in das Sieb eingefangen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Methanol zu übertragen.
Hinweis: Wenn mehrere Szintillationsgefäße im Einsatz sind, führen Sie die Schritte 2.12 und 2.13 ein Fläschchen zu einer Zeit, zu Probe von Trocknen auf Zellsiebe verhindern. - Sobald die Probe auf den Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt, entfernt Methanol mit einer Pipette. Sicherzustellen Probe auf den Boden des Rohres abgewickelt.
- Spülen Probe im Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von ungefähr 0,5 ml Methanol zu Rohr. Warten Sie dann begleichen Probe zu entfernen Methanol mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 15 dreimal.
- 0,5 ml Methanol zu dem Rohr, und speichern Sie dann in eine -20 ° C-Gefrierschrank für die spätere Verwendung.
3. Rehydrierung und Herstellung der Probe für Immunfärbung
- Entfernen von Methanol aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette, so dass die Probe in der Röhre. Shop Methanol Abfälle in die entsprechenden Abfallbehälter bis zum Zeitpunkt der ordnungsgemäßen Beseitigung.
Hinweis: Um Beschallung Effizienz zu steigern, verwenden Sie nicht mehr als 3 mm von Probe an der Unterseite des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen abgerechnet. Überschüssige Probe kann in ein separates Röhrchen mit einer Pipette vor dem Beginn der Rehydration über Schritt übertragen werden. Schneiden der Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge verwendet werden, um ein Verstopfen der Pipettenspitze zu verhindern. - 1,0 ml einer 50% Methanol / Phosphatpuffer Tween (PBTw) Lösung in das Röhrchen und Rock für 3 min.
- Methanol-Lösung zu entfernen, um die ordnungsgemäße Abfallbehälter und spülen mit 1,0 ul PBTw zweimal. Nach jedem Auswaschen damit die Probe vor dem Abziehen des PBTw mit einer Pipette zu begleichen.
- 1,0 ml Rinderserumalbumin / Phosphat-gepufferte Tween (BBTw) zu mischen, um das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf einer Wippe, ermöglichen die sample, um sich niederzulassen und entfernen Sie die BBTw mit Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 3.4 zwei Mal darauf achten, dass so viel wie möglich zu entfernen BBTw ohne Probe nach dem letzten Waschen verlieren.
- 0,5 ml BBTw auf das Rohr und den Schlauch auf Eis.
4. Die Beschallung der Probe
- Stellen Sie die Beschallungs zu 10% maximale Amplitude und Benennung einer Laufzeit von 2 sec konstant Beschallung.
Hinweis: Diese Einstellungen sind spezifisch für die in den Materialien und Geräte Tabelle angegeben Ultraschallgerät und kann Optimierung für verschiedene Beschaller verlangen. - Vor der Beschallung von Proben, reinigen Sie die Sonde Ultraschallgerät, indem Sie die Sondenspitze in einem 50 ml konischen Röhrchen mit VE-Wasser und führen Ultraschallgerät zur Reinigung der Sonde gefüllt. Trockenbeschallungssonde mit Labor Gewebe nach der Flucht.
- Tauchen Sie die Sonde in die Mikrozentrifugenröhrchen enthaltenden Probe, so dass es etwa 3 bis 4 mm über der Probe positioniert und starten Beschallung.
- Entfernen Sie die microcentrifuge Rohr und legen Sie es auf Eis für mindestens 30 Sekunden, um Wärme von der Beschallung zu zerstreuen und lassen Probe am Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu begleichen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 nach Bedarf auf das Alter der Probe verarbeitet werden.
Hinweis: Für eine optimale Beschallung Probenvolumen, Embryonen jünger als 17 Stunden nicht Beschallung benötigen, aber diejenigen zwischen 17 und 24 h (Stufe 17 / Früh L1) benötigen zwei sonications. Larven zwischen 24 - 36 (Anfang / Mitte L1), 36 - 48 (Mitte / Ende-L1), 48 - 60 (Anfang / Mitte-L2), 60-72 (Mitte / Ende-L2), 72-84 ( Früh L3), 84-96 (Anfang / Mitte-L3), 96-108 (Mitte / Ende-L3) hr verlangen 5, 9, 11, 13, 15, 18 und 22 jeweils sonications. Siehe Diskussion zur weiteren Ausarbeitung an Beschallung Zeiten. - Spülen BBTw zweimal mit 1,0 ml. Nach jeder Spülung damit die Probe vor dem Bezug von BBTw mit einer Pipette zu begleichen.
- 1,0 ml BBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf der Wippe, damit die Probe absetzen und entfernen Sie die BBTw mit Pipette. </ Li>
- Wiederholen Sie Schritt 4.7 zwei Mal.
5. Immunfärbung
- Blockieren Probe durch Zugabe von 5% Normalserum in BBTw auf die Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt. Entfernen Block nach Schaukel 1 Stunde.
Hinweis: Verwenden Sie normale Serum von den Arten, bei denen die Sekundärantikörper erzeugt werden. - Verdünnen primären Antikörpern anzueignen Arbeitskonzentration in 5% Normalserum / BBTw Lösung.
- Gesteinsprobe in primäre Antikörperlösung A / N bei 4 ° C oder für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C beträgt.
Hinweis: Antikörper Inkubationszeiten und Temperaturen können variieren. O / N-Inkubation bei 4 ° C oder 3 Stunden bei Raumtemperatur ist in der Regel ausreichend. Jedoch kann ein zweitägiger Inkubationszeit Färbung Qualität zu verbessern, vor allem mit älteren Proben oder bei niedriger Affinität primäre Antikörper verwendet werden. Längere Inkubationen werden typischerweise bei 4 ° C durchgeführt. Ähnliche Überlegungen sind bei der Verwendung Sekundärantikörper (siehe 5.10) vorgenommen werden. - Erlauben Probe absetzenBoden des Mikrozentrifugenröhrchen. Abziehen primären Antikörper mit Pipette. Antikörper für die Wiederverwendung zu speichern, falls gewünscht.
- Gründlich zweimal mit 1,0 ml BBTw. Nach jeder Spülung ermöglichen Probe vor Abziehen BBTw mit einer Pipette zu begleichen.
- 1,0 ml BBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf der Wippe, erlauben Probe sich niederzulassen und zu entfernen BBTw mit Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 5.6 fünfmal.
- Block Probe durch Zugabe von 5% normalem Serum / BBTw Lösung des Reaktionsgefäß. Entfernen Block nach Schaukel für 30 min bis 1 Stunde.
Hinweis: Diese zusätzliche Sperr Schritt ist nicht erforderlich, kann aber Qualität der Färbung auf spezifische Antikörper zu verbessern. - Verdünnen Sekundärantikörper, um angemessene Arbeitskonzentration in 5% normalem Serum / BBTw Lösung.
- Wickeln Mikrozentrifugenröhrchen in Aluminiumfolie zu reduzieren Ausbleichen durch Lichteinstrahlung. Gesteinsprobe in sekundären Antikörperlösung für 12 bis 48 h bei 4 ° C oder für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C beträgt.
- Erlauben Probe zur Unterseite der Mikrozentrifugenröhrchen zu begleichen. Abziehen Sekundärantikörper mit Pipette.
- Gründlich zweimal mit 1,0 ml PBTw. Nach jeder Spülung ermöglichen Probe vor dem Abziehen des PBTw mit einer Pipette zu begleichen.
- 1,0 ml PBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 5 min auf der Wippe, damit die Probe absetzen und entfernen Sie die PBTw mit Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 5.13 dreimal.
- Optional: Fügen DAPI verdünnt 1: 1000 in PBTw. Gesteinsprobe in Aluminiumfolie eingewickelt für 3 min; entfernen Sie dann DAPI-Lösung mit einer Pipette. Spülen Sie fünfmal mit 1,0 ml PBTw, so dass Probe, bevor Sie PBTw mit Pipette zu begleichen.
- Fügen 80-100 ul 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) Lösung für Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.
Hinweis: Eine weitere Glycerin-basierte Anti-Fade Mittel kann ersetzt werden.
6. Analyse
- Vor der Montage Probe auf Objektträger, einen zusätzlichen 5 - 10 ul DABCO / p-phenylenediamine (PPD) Antifade Lösung für Mikrozentrifugenröhrchen.
Hinweis: Probe kann auf Objektträger ohne Dissektion hinzugefügt werden. Probenvolumen zu einer Folie hinzugefügt variiert mit Deckglas Größe. Beim Pipettieren Probe auf Objektträger kann die Pipettenspitze aus mit einer Rasierklinge auf Probe Scher verhindern geschnitten werden. Es ist oft nützlich, um Probe in Reihen für die einfache Analyse säumen. Die Zugabe von PPD als zusätzlicher Antibleichmittel nicht erforderlich, kann aber die Photobleichung zu verhindern, wenn die Proben langfristig gespeichert. - Stellen sanft Deckglas über Probe. Dann sichere Deckglas an Ort und Stelle mit Nagellack.
- Ansicht montiert Probe mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
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Representative Results
Um die Wirksamkeit von Ultraschall-basierten Immunfärbung in der Analyse von Spätstadium der embryonalen und Larvengewebe in situ zu zeigen, wurden Wildtyp-Embryonen und Larven für Immunfärbung von Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe verarbeitet. Proben wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und repräsentative Ergebnisse sind dargestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Protokoll ist während der späten embryonalen bis Anfang / Mitte L3 Stadien der Drosophila-Entwicklung wirksam zur Visualisierung morphologischen Merkmale sowie einzelne Zellen in situ.
Ergebnisse aus Hoden immunostain:
Hodenentwicklung ist ein besonders gutes System zur Darstellung Protokoll Wirksamkeit seit Hoden Reifung ist im gesamten Larvenentwicklung dynamisch. Erwachsene Drosophila Hoden bilden eine Rohrschlange mit einem blinden Ende, wo die Keimbahn-Stammzellen (GSC) Nische befindet (siehe 13,14 Bewertungen). In dieser Nische sind GSCs um eine enge Gruppe von nicht-mitotischen somatischen Zellen genannt die Nabe angeordnet. GSCs unterziehen asymmetrische Teilung einer GSC, die an der Nabe verankert bleibt und eine Tochter, dass gonialblast weg von der Stammzellnische verdrängt zu produzieren. Wie der gonialblast teilt unvollständig, Zytoplasma-Erweiterungen, so genannten fusomes Form, die Verbindung der Zellen innerhalb der Spermatogonie. Nach 4 aufeinander folgenden Geschäftsbereiche initiiert der Spermatogonie Meiose, Spermien zu bilden.
Hodenbildung beginnt mit dem Verband der Ur-Keimzellen (PGC) und somatischen Gonaden-Vorläuferzellen (SGPS) während der Embryogenese (siehe 15,16 auf Bewertungen). Diese Vereinigung führt zur Bildung eines funktionellen GSC Nische am Ende der Embryogenese 8-10. Bis Mitte L1, asymmetrische GSC Spaltungen innerhalb der GSC Nische führen zu differenzier Spermatogonien mit verzweigten fusomes 9. Asymmetrische Teilung GSC gesamten Larven weiterEntwicklung, was in der Produktion von zusätzlichen Spermatogonien und eine schrittweise Erhöhung der Gonaden Größe. Repräsentative Bilder der späten embryonalen und Anfang / Mitte L1, L2, L3 und Hoden, für Keimzellen, Zellen Nabe und fusomes Immunofärbung angezeigt (1A-D). Diese Bilder zeigen die dynamischen Veränderungen in Größe und Gonaden Keimzelldifferenzierung in den Hoden im Laufe der Zeit beobachtet.
Ergebnisse von Eierstock immunostain:
Erwachsene Drosophila Eierstöcke von 16-20 einzelnen Ei-produzierenden Einheiten namens Ovariolen (siehe 17,18 auf Bewertungen) zusammen. An einem Ende jedes Ovariole eine Struktur genannt Germarium enthält eine Stammzelltransplantation Nische. CAP-Zellen und Terminal-Filament-Zellen (TFS): Die Ovariole Nische von undifferenzierten GSCs und zwei Populationen von somatischen Zellen. Ähnlich wie bei der Hoden, GSCs unterziehen asymmetrische Teilung einer GSC, die neben den CAP-Zellen und differenzierTochterZelle bleibt produzieren, Genannt cystoblast, die weg von der Nische eingeschoben wird. Die cystoblast anschließend erfährt 4 Runden der Zellteilung, eine Keimbahn-Zyste von einem verzweigten fusome miteinander verbundenen. Jeder Keimbahn-Zyste wird dann von Follikelzellen umgeben, um ein Ei Kammer, um zu reifen, wie es bewegt sich nach unten über die Länge des Ovariole weiter produzieren.
Wie Hoden, Eierstöcke werden zuerst während der Embryogenese gebildet 16,18. Mehrere Ovariolen entstehen aus einer einzigen embryonalen Keimdrüse von PGC und SGPS besteht. Bis Mitte L3, geben Anlass zu SGPS TF-Vorstufen in den Eierstöcken vorderen, während Keimzellen zu lokalisieren, um den Eierstock hinteren und assoziieren mit SGP-abgeleiteten Zellen vermischt (ICs) 19-22. Am späten L3-, TF-Zellen zu differenzieren und in die Stapel in der adulten Stammzellnische gefunden zu organisieren, sind GSCs und CAP-Zellen etabliert und Keimbahn-Zyste Differenzierung beobachtet 19,20,23. Repräsentative Bilder der späten Phase der embryonalen und Anfang / Mitte-L3 Eierstöcke, immunostamt für Keimzellen, sGPS, ICs, TF Vorläufer und fusomes, gezeigt (1E, F). Diese Bilder zeigen eine normale Morphologie und Entwicklungsfortschritt für ihr Alter.
Ergebnisse von Neural immunostain:
Die Drosophila Zentralnervensystem (ZNS) von neuronalen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS), die aus embryonalen Neuroepithel entstehen (siehe 24,25 auf Bewertungen). NBs in Embryonen und Larven Kluft asymmetrisch Ganglienmutterzellen (GMC), die wiederum erzeugen Neuronen und Gliazellen im erwachsenen Gehirn und Bauchmark gefunden zu produzieren. Da Larven NBs geben Anlass zu der Mehrheit der erwachsenen Nervenzellen und kann auf der Grundlage ihrer Position innerhalb des Gehirns unterschieden werden können, haben Larven Gehirn zu einem wichtigen Modell für die Untersuchung NB Verhalten und neuronale Differenzierung.
Der L3-Gehirn besteht aus zwei Lappen und einem zentral gelegenen Bauchmark 24.Repräsentative Bilder der Mitte L3 Gehirne für NBS GMCs, undifferenzierten Neuronen, unreif und primären Neuronen und Gliazellen immun werden (Abbildung 2a-c) 26-30 gezeigt. Diese Bilder zeigen eine starke Färbung in unterschiedliche Expressionsmuster in den Hirnlappen und dem Bauchmark. Je nach Einbaulage ermöglicht Hirngewebe Visualisierung von der dorsalen Oberfläche (2A), Bauchfläche (2B) oder in sagittaler Querschnitt (Abbildung 2C) Bildgebung.
Färbung Effizienz:
Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass eine Ultraschallbehandlung-basierten Immunfärbung Verfahren ist vielseitig. Es kann nicht nur verwendet werden, um spezifische Zelltypen zu identifizieren, sondern kann auch verwendet werden, um das Vorhandensein von bestimmten Proteinen und Organellen anzuzeigen. Allerdings kann mehrdeutige Ergebnisse von den erwarteten Variation Färbung Effizienz einzudämmen. Zum Beispiel, gebeizt Anti-Vasa mindestens eine Gonadein 73,2% aller Larven untersucht (n = 781), während Anti-Elav gefärbt Gehirne in 86% der Larven (n = 115). Darüber hinaus beobachten wir, dass die Effizienz der Färbung ist in etwa umgekehrt proportional zur Entwicklungsstadium. In der späten Phase Embryonen, gefärbt Anti-Vasa 89,8% der Keimdrüsen (n = 206), während der Färbung war anwesend in nur 59,8% und 46,9% der Larven bei L2 und L3 Mitte, bzw. (n = 132 und 49). Darüber hinaus Beschallung Ergebnisse in Probenverlust. Wenn die Anzahl der Embryonen und eine optimale Beschallung Probenvolumen vorhanden Larven wurde vor und nach der Beschallung gezählt wurde ein Durchschnitt von 41,0% der Analysenprobe (n = 1165) ungeeignet bestimmt. Zur Maximierung der Färbung Effizienz sollten Protokolle für spezifische Antikörper durch Änderung veröffentlicht Antikörper oder Antikörperkonzentrationen Inkubationszeiten optimiert werden.
Abbildung 1. Ich. mmunostain von Drosophila Keimdrüsen in situ (AD) Bilder von Hoden in situ in der späten Phase Embryonen (Stadium 17 / Früh L1) bis Anfang / Mitte der L3-Larven immun mit Anti-Vasa (AD, rot; A'-D ' allein) zu erkennen, Keimzellen, Anti-Fasicilin III (FAS III) und Anti-1B1 (AD, grün, A '' - D '' allein) an der Nabe Zellen und fusomes erkennen sind, und DAPI (AD, blau, A ' ''-d '' allein '), um Kerne zu erkennen. (A) Stufe 17 / frühen L1 Hoden zeigt die neu zusammengewachsen Nabe und Kugel fusomes in undifferenzierten Keimzellen. (B) Anfang / Mitte-L1 Hoden zeigt sphärische fusomes in GSCs lokalisiert in der Nähe der Nabe und in einigen Zahnkeimzellen verlängert fusomes Richt der frühen Differenzierung Spermatogonien. (C) Anfang / Mitte-L2 und
Abbildung 2. immunostain von Drosophila Nervengewebe in situ. Anfang / Mitte-L3-Larven immun mit Anti-Elav (
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Discussion
Dieses Protokoll liefert ein Verfahren zur Immunfärbung erfolgreich in situ gezielt Drosophila embryonalen und larvalen Geweben, wodurch die Notwendigkeit für die Präparation. Nach vor-Protokolle für die Färbung frühen Embryonen 1,2,3 ist der Chorion-Membran mit 50% Bleichmittel (NaOCl) entfernt. Proben werden in Formaldehyd und Methanol fixiert. Weil die Larvencuticula verursacht älteren Probe zu schweben, wird die gesamte Probe dann durch eine Zell-Sieb geleitet, um Larven Retention zu gewährleisten. Probe gespeichert wird, falls gewünscht, in chemical grade Methanol. Nach Rehydrierung, stört ein ordnungsgemäß umgesetzt Beschallung Prozess die Integrität der Larvencuticula. Dies ist entscheidend, nach Bildung Nagelhaut, um eine ausreichende Durchlässigkeit von Antikörpern für die Immunfärbung erforderlich ermöglichen. Vor der Anwendung Antikörper, Schaukel der Probe in einer 5% normalem Serum / BBTw Lösung verhindert übermäßige unspezifische Antikörperbindung. Primären Antikörper werden dann hinzugefügt, um spezifische Proteine erkennen Expresim Zielgewebe Sed. Nach dem Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen Primär werden sekundäre Antikörper gebundenen Fluorophore verwendet werden, um die Lage der gebundenen primären Antikörper zu markieren. Die Analyse kann dann mit Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie durchgeführt werden.
Einige Änderungen erforderlich, um Ergebnisse in individuellen Gegebenheiten zu optimieren. Insbesondere kann Beschallungsleistung und die Anzahl der sonications geführt Verstellung in Abhängigkeit von der Beschallungsgerät verwendet werden, erfordern. Für verschiedene Beschaller oder wenn ausreichend Probe nicht erhalten werden kann auch Anpassungen an der Höhe des Beschallungssonde über der Probe sowie Lösungsvolumen erforderlich. Erhöhte Trübung der Lösung als ein Indikator der Gewebe Lyse verwendet werden und stellt daher ein Maß für bei der Ultraschallbehandlung zu stark. Falls Trübung der Lösung hoch wird, sollte der Experimentator betrachten Verringerung der Anzahl der sonications geführt, wodurch Lösungsvolumen, die Höhe der Anhebung sonicator Sonde über der Probe und / oder Verringerung der Beschallungs Macht.
Änderungen können auch in der Immunfärbung Protokoll erforderlich, um die Bildqualität zu verbessern. Wie bei den meisten Immunverfahren das Signal-Rausch-Verhältnisses durch Modifizieren der Antikörperverdünnung, die Zeit und die Temperatur der Antikörper-Inkubation mit der Probe, und / oder Blockierungsreagenzien verändert werden. Während jeder Antikörper müssen unabhängig voneinander betrachtet werden, insbesondere in Bezug auf die Antikörperverdünnung, finden wir, dass die Inkubation bei 4 ° C für längere Zeiträume können Färbungsqualität nach der Ultraschallbehandlung zu verbessern, insbesondere bei Antikörpern mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnissen und bei älteren Larven untersucht. In diesen Fällen kann Färbung Qualität auch von einem leichten Rückgang der sekundären Antikörperverdünnung profitieren. In diesem Protokoll beziehen wir sowohl BSA und Serum als Blockierungsmittel und die Probe vor der Zugabe des sekundären Antikörper, um Färbungsqualität zu erhöhen wieder gesperrt. Je nach die Antikörper verwendend, Wieder Sperrung und Aufnahme der beiden Blockierungsreagenzien kann erforderlich oder Färbung zu verbessern. Wenn die Re-Blockierungsschritt ausgelassen wird, kann länger wäscht und spült mehr klarere Bilder zu produzieren. Schließlich kann vor-Absorptions polyklonalen Antikörpern des Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Pre-Absorption erfolgt durch Inkubation der gewünschten Antikörper mit rehydriert Embryonen oder Larven vor in einer immunostain 1 verwenden geführt.
Wie in unserer repräsentativen Ergebnisse zeigen, ermöglicht Beschallung für klare Visualisierung von Zielgewebe in situ und stellt somit eine sinnvolle Alternative zu Gewebedissektion in Immunfärbung Protokolle. Dissection kann mühsam in Drosophila-Embryonen und Larven aufgrund von Schwierigkeiten bei der Ortung, Isolieren und Extrahieren unbeschädigt Zielgewebe. Alternativ Beschallung ermöglicht Geweben im Kontext des gesamten Organismus verbleiben. Da Beschallung vermeidet Extra und Montage Gewebe zwischen einer Rutsche und einer Abdeckung slip, es genauer bewahrt in situ Morphologie. Praktisch können große Probenmengen schneller zur späteren Analyse verarbeitet werden, da viele Organismen können gleichzeitig bestrahlt werden kann.
Obwohl Beschallung bietet eine gute Alternative zu Dissektion, hat es Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Beschallung nutzbringend stört die Integrität des Larvencuticula zerstört aber einige Beispiel in den Prozess (siehe Repräsentative Ergebnisse). Spülen zur biologischen Ablagerungen zu entfernen, ist nach der Ultraschallbehandlung Prozess, der weiter reduzieren können Stichprobengröße erforderlich. Zusätzlich Immun ganze Embryonen und Larven lässt das Gewebe von Interesse in das umgebende Gewebe eingebettet. Diese umgebenden Gewebe kann positiv färben oder zeigen unspezifische Antikörper-Bindung, damit endgültige Bildqualität zu reduzieren. Schließlich Färbung Effizienz kann variabel sein. Diese Variabilität kann auf das Alter der Probe, Beschallung Wirksamkeit und Antikörper-Spezifität ab. Als Ergebnis Beschallung-based-Immunfärbung von Vollmontage Gewebe kann nicht immer vorzuziehen. Insbesondere kann Dissektion-basierten Immunfärbung effizienter sein, wenn das Studium großen Gewebe im späten L3-Larven. Darüber hinaus können Beschallung frühen und mittleren Stadium Embryonen zu scheren. Trotz dieser Einschränkungen ist Ultraschall-basierte Immun eine sehr effiziente Technik, die zur Analyse der Entwicklung von einer Vielzahl von Geweben im Spätstadium der Embryonen bis Anfang / Mitte L3 Larven gut geeignet ist. In unserem Labor verwenden wir regelmäßig dieses Protokoll, um Gonaden Morphogenese in Drosophila-Embryonen und Larven 9,10 studieren. Darüber hinaus erwarten wir, dass die Umsetzung dieses Protokolls wird im Studium Entwicklung anderer Gewebe in Drosophila und in anderen Organismen gleichermaßen fruchtbar mit einer Schutznagelhaut zu beweisen.
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Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Ruth Lehman und Dorothe Godt, die freundlicherweise Vasa und Stau-Antikörper. Wir möchten die Bloomington Stock Center an der Indiana University für die Aufrechterhaltung der vorgesehenen Aktien und die Entwicklungsstudien Hybridoma Bank im Rahmen der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und von der Universität von Iowa gehalten anzuerkennen. Wir danken allen Mitgliedern der Wawersik Labor für ihre Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Monroe-Scholars Program Grant (AF und LB) und NSF gewähren IOS0823151 (MW) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
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