Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Resumo

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Resumo

Estudos realizados em Drosophila melanogaster embriões e larvas de fornecer informações cruciais nos processos de desenvolvimento, como especificação de destino celular e organogênese. Imunocoloração permite a visualização do desenvolvimento de tecidos e órgãos. No entanto, uma cutícula protectora que se forma na extremidade da embriogênese impede a permeação de anticorpos em embriões de fase tardia e de larvas. Enquanto dissecção antes de imunomarcação é regularmente utilizado para analisar Drosophila tecidos larvais, prova ineficiente para algumas análises, porque pequenos tecidos podem ser difíceis de localizar e isolar. Sonication fornece uma alternativa para dissecção em protocolos de positividade de larvas de Drosophila. Ela permite a rápida transformação, simultânea de um grande número de embriões em estágio final e larvas e mantém na morfologia situ. Após fixação em formaldeído, uma amostra é sonicada. A amostra é então submetida a imunocoloração com antigénio específico da formiga primárioibodies e anticorpos secundários marcados com fluorescência para visualizar os tipos de células-alvo e as proteínas específicas, através de microscopia de fluorescência. Durante o processo de sonicação, a colocação adequada de uma sonda de ultra-sons acima da amostra, bem como a duração e intensidade de ultra-sons, é crítica. Pequenas modificações adicional a protocolos de positividade padrão pode ser necessária para manchas de alta qualidade. Para os anticorpos com baixa relação sinal-ruído, o tempo de incubação mais longos são tipicamente necessário. Como prova de conceito para este protocolo facilitou-sonificação, mostramos immunostains de três tipos de tecidos (testículos, ovários e tecidos neurais) em uma série de estágios de desenvolvimento.

Introdução

Embriões de Drosophila e larvas de fornecer um excelente modelo para estudar os processos de desenvolvimento em vários órgãos e tecidos. Imagem de células individuais é muitas vezes necessário nestes estudos, a fim de apurar os ambientes complexos em que as células se desenvolvem. A visualização de células em tecidos pode ser realizada através de imunomarcação. Bem descrito imunomarcação existem protocolos para tecidos de Drosophila embrionárias <17 horas após a postura dos ovos (AEL) ^1-3. No entanto, se forma uma cutícula protetora para o fim da embriogênese, impedindo a permeação de anticorpos eficazes. Assim, estes protocolos imunocolo....

Protocolo

1 Preparação de uma gaiola coleção

1. Anestesiar jovens, moscas férteis com CO _2. Transferir moscas anestesiadas para uma gaiola. Para obter o rendimento ideal, use 100-120 moscas adultas variam de 2-7 dias de idade em uma proporção de 4: 1 de mulheres para homens. Permitir moscas um período de aclimatação apropriada, ~ 24 horas antes da obtenção de amostra para a fixação. Se a gaiola foi criado com fêmeas virgens acoplado aos homens, o uso de um 36 - período de aclimatação de 48 hr.
2. Na extremidade aberta da gaiola, colocar uma placa de agar pré-preparados sumo de maçã com uma gota do tamanho de uma moeda, de levedura pasta no centro ao l....

Resultados

Para demonstrar a eficácia de imunocoloração à base de ultra-sons na análise de embriões de fase final e tecidos larvais in situ, os embriões de tipo selvagem e as larvas foram processadas para imuno-coloração dos testículos, dos ovários, e tecido neural. As amostras foram fotografadas por microscopia confocal e os resultados representativos são mostrados (Figura 1 e Figura 2). Os resultados revelam que o protocolo descrito é eficaz para a visualização de características morfol.......

Discussão

Este protocolo fornece um método para atingir com sucesso imunocoloração Drosophila embrionário e larval tecidos in situ, eliminando, assim, a necessidade de dissecção. De acordo com os protocolos anteriores, para a coloração de embriões de ^1,2,3, a membrana coriónica é removido usando 50% de lixívia (hipoclorito de sódio). As amostras são fixadas em formol e metanol. Porque a cutícula larval provoca amostra mais para flutuar, a totalidade da amostra é então passada através de um coador de c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tabela 1: Reagentes e tampões
Tampão fosfato Triton X-100 (PBTx)			Para 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Armazene na RT.
Tampão fosfato salino 10X (PBS 10X)			Para 1 L em dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Adicione componentes e preencha até o volume apropriado. Armazene a 4 ° C.
Triton 10%			Para 50 ml: 5 ml de Triton, 5 ml de PBS 10X, 45 ml de ddH<>2O. Rocha para misturar. Armazene na RT.
Tubos PEMS			0,1 M (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Armazene na RT.
Tubos			Para 400 ml de solução 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubos dH20 NaOH. Dissolver os tubos em 300 ml dH2O e depois ajustar para pH 6,9 com NaOH. Aumente o volume total para 400 ml com dH2O e autoclave. Armazene na RT.
Formaldeído			37% formaldeído em peso em metanol. Armazene na RT. Armazene a mistura de resíduos de formaldeído, heptano e metanol em um recipiente hermeticamente fechado na capela antes do descarte de acordo com as diretrizes institucionais.
Heptano		CAS 142-82-5	n-Heptano. Armazene na RT. Armazene a mistura de resíduos de formaldeído, heptano e metanol em um recipiente hermeticamente fechado na capela antes do descarte de acordo com as diretrizes institucionais.
Metanol		CAS 67-56-1	Armazene na RT. Armazene formaldeído, heptano e mistura de resíduos de metanol em um recipiente hermeticamente fechado na capela antes do descarte de acordo com as diretrizes institucionais.
Tampão fosfato Tween (PBTw)			Para fazer 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtre esterilize após adicionar todos os componentes. Armazene a 4 ° C.
Tween 10%			Para 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml de PBS 10X, 40 ml de ddH2O. Rocha para misturar. Armazene na RT.
Tampão albumina/fosfato de soro bovino Tween (BBTw)			Para fazer 1 L: 100 ml de PBS 10X, 890 ml de ddH2O, 10 ml de Tween 10%, 1 g de albumina de soro bovino (BSA). Adicione BSA e esterilize usando um 0,2 μ Unidade de filtro de vácuo M. Armazene a 4 ° C.
Soro de cabra normal (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	Para fazer 10 ml: Soro de cabra normal 10 ml ddH2O. Adicione ddH2O ao frasco de NGS e esterilize usando um 0,2 μ m filtro syrninge. Armazene alíquotas a -20 °C.
1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO)		CAS: 281-57-9	Para fazer 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml de Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g de DABCO sólido, 3,5 ml de 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml de glicerol. Em um copo de 250 ml com barra de agitação, adicione ddH2O, Tris HCl e DABCO. Mexa e adicione 6N HCl, 10 N NaOH e glicerol. Em seguida, adicione 10N NaOH gota a gota até que a solução atinja pH 7,5. Alíquota. Armazene alíquotas a -20 °C.
DABCO + solução de p-fenilenodiamina (PPD)			1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolver o PPD em solução de NaHCO3 e NaCO3. Adicione 60 μ l de solução PPD para 500 μ l de DABCO. Armazene alíquotas a -20 °C.
Pratos			de maçã Para fazer ~ 200 pratos: 45 g de ágar (CAS # 9002-18-0), 45 g de açúcar granulado (comprado na loja), 500 ml de suco de maçã (comprado na loja), 15 ml de Tegosept 10%, 1,5 ml de ddH2O. Adicione o ágar ao ddH2O em um frasco de 4 L e depois autoclave por 30 min. Misture o suco de maçã e o açúcar na placa de agitação aquecida. Aos poucos, adicione a mistura de suco de maçã ao ágar autoclavado. Misturar numa placa de agitação aquecida e, em seguida, alíquotas de 10 ml em placas de Petri de 35 mm e deixar repousar em RT para solidificar. Armazene a 4 ° C.
Tegosept 10%			Para fazer 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml de etanol. Armazene alíquotas a -20 °C.
Pasta			~ 50 g de fermento ativo seco. Aos poucos, adicione ddH2O ao copo que contém o fermento, mexendo até obter uma consistência pastosa. Armazene a 4 ° C.
Tabela 2: Materiais de coloração
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, estoque a 5 mg/ml.
Coelho anti-Vasa			1:250, um presente de Ruth Lehmann.
Rato anti-Fasciclin III	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)	7G10	1:10
Rato anti-1B1	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)	1B1	1:4
Guniea porco anti-Engarrafamento			1:2500, um presente de Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Rato anti-Próspero	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rato anti-Elav	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)	7EBA10	1:30
rato anti-Repo	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)	8D12	1:10
Cabra anti-coelho Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Cabra anti-rato Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Porco anti-guniea de cabra Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Cabra anti-rato Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Tabela 3: Materiais e Equipamentos
Gaiolas de Mosca	Feitas à mão; Genesee Scientific Corporation	Não aplicável; Garrafas: 32-130; Gaiola pré-fabricada: 59-101	Feito cortando tubos de acrílico fundido transparente (1 3/4 polegada de diâmetro) em segmentos de 4 polegadas de altura com uma serra de esquadria composta a 400 rpm. Tela de aço inoxidável ultrafina (foi fixada em uma extremidade da banheira com cola componsada acrílica. Um método alternativo usando uma garrafa vazia de comida para moscas pode ser encontrado em Drosophila Protocolos ISBN 0-87969-584-4. As gaiolas também podem ser compradas da Genesee Scientific Corporation.
Sonicador: Sonificador Digital Branson 250	Modelo Branson	: Sonador Digital Branson 250
Sonda Sonicadora	Modelo	#: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Filtro de seringa	Nalgene	190-25-20	0.2 μ m celulose, filtro de membrana de acetato
Sistema de imagem: Microscópio confocal de disco giratório com fonte de luz multicromática, câmera digital CCD e software de imagem	Microscópio: Olympus, Fonte de luz: Lumen Dynamics, Câmera: Q-Imaging, Software de imagem: Intelligent Imaging Inc.		Microscópio: BX51 equipado com disco giratório DSU, Fonte de luz: X-Cite 120Q, Câmera: RETIGA-SRV, Software de imagem: Slidebook 5.0
Unidade de filtro a vácuo	Nalgene	450-0020	0.2 μ M Filtro de membrana de nitrato de celulose

de suco de fermento