Abstract
Estudos realizados em Drosophila melanogaster embriões e larvas de fornecer informações cruciais nos processos de desenvolvimento, como especificação de destino celular e organogênese. Imunocoloração permite a visualização do desenvolvimento de tecidos e órgãos. No entanto, uma cutícula protectora que se forma na extremidade da embriogênese impede a permeação de anticorpos em embriões de fase tardia e de larvas. Enquanto dissecção antes de imunomarcação é regularmente utilizado para analisar Drosophila tecidos larvais, prova ineficiente para algumas análises, porque pequenos tecidos podem ser difíceis de localizar e isolar. Sonication fornece uma alternativa para dissecção em protocolos de positividade de larvas de Drosophila. Ela permite a rápida transformação, simultânea de um grande número de embriões em estágio final e larvas e mantém na morfologia situ. Após fixação em formaldeído, uma amostra é sonicada. A amostra é então submetida a imunocoloração com antigénio específico da formiga primárioibodies e anticorpos secundários marcados com fluorescência para visualizar os tipos de células-alvo e as proteínas específicas, através de microscopia de fluorescência. Durante o processo de sonicação, a colocação adequada de uma sonda de ultra-sons acima da amostra, bem como a duração e intensidade de ultra-sons, é crítica. Pequenas modificações adicional a protocolos de positividade padrão pode ser necessária para manchas de alta qualidade. Para os anticorpos com baixa relação sinal-ruído, o tempo de incubação mais longos são tipicamente necessário. Como prova de conceito para este protocolo facilitou-sonificação, mostramos immunostains de três tipos de tecidos (testículos, ovários e tecidos neurais) em uma série de estágios de desenvolvimento.
Introduction
Embriões de Drosophila e larvas de fornecer um excelente modelo para estudar os processos de desenvolvimento em vários órgãos e tecidos. Imagem de células individuais é muitas vezes necessário nestes estudos, a fim de apurar os ambientes complexos em que as células se desenvolvem. A visualização de células em tecidos pode ser realizada através de imunomarcação. Bem descrito imunomarcação existem protocolos para tecidos de Drosophila embrionárias <17 horas após a postura dos ovos (AEL) 1-3. No entanto, se forma uma cutícula protetora para o fim da embriogênese, impedindo a permeação de anticorpos eficazes. Assim, estes protocolos imunocoloração são ineficientes na análise de tecidos em embriões em estágio final e em fases posteriores do desenvolvimento larval (1 º instar (L1), 2 º instar (L2), e 3 º instar (L3)). Essa ineficiência impõe uma barreira à nossa compreensão dos processos dinâmicos que ocorrem durante este período de desenvolvimento prolongado 4. Tissue dissecção é uma técnica amplamente utilizada para contornar essa barreira 5-7. No entanto, a dissecção pode provar ineficiente. Extração podem ser sobrecarregados com dificuldade em localizar ou isolar embrionário e tecidos larvais. Além disso, a remoção física dos tecidos-alvo pode causar danos pela ruptura los ou ao não extraí-los em sua totalidade.
A sonicação é um método que emprega ondas sonoras para perturbar interacções intermoleculares. Tem sido usada para romper a integridade da cutícula larval Drosophila, a fim de imunocoloração tipos de células neurais em desenvolvimento 6. Este protocolo foi adaptado para imunocoloração embrionário de fase final e gónadas larvais, o que pode ser tão pequeno quanto 50 um de diâmetro de 8-10. Através desses estudos, o processo de célula-tronco da linhagem germinativa (GSC) formação nicho masculino tem sido caracterizada em fase final de embriões de Drosophila 8-10 e mecanismos que regulam o desenvolvimento de células-tronco e difdife- em fase final de gônadas embrionárias e as larvas foram elucidados 9-12. Assim, de ultra-sons constitui uma alternativa eficiente para a dissecção de tecidos que pode ser difícil por causa do tamanho dos tecidos. Além disso, permite a imunocoloração de tecidos in situ de Drosophila, deixando as células no contexto de todo o organismo e manutenção da morfologia situ. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a fluorescência imunocoramento tarde-estágio embrionário através primeiros tecidos / mid-L3 in situ. Análise de Drosophila gonadal e tecido neural é mostrado nos resultados representativos para demonstrar a eficácia do presente protocolo. Além disso, este protocolo de imuno pode ser adaptado para analisar outros tecidos de Drosophila, bem como os tecidos em outros organismos com uma cutícula externa.
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Protocol
1 Preparação de uma gaiola coleção
- Anestesiar jovens, moscas férteis com CO 2. Transferir moscas anestesiadas para uma gaiola. Para obter o rendimento ideal, use 100-120 moscas adultas variam de 2-7 dias de idade em uma proporção de 4: 1 de mulheres para homens. Permitir moscas um período de aclimatação apropriada, ~ 24 horas antes da obtenção de amostra para a fixação. Se a gaiola foi criado com fêmeas virgens acoplado aos homens, o uso de um 36 - período de aclimatação de 48 hr.
- Na extremidade aberta da gaiola, colocar uma placa de agar pré-preparados sumo de maçã com uma gota do tamanho de uma moeda, de levedura pasta no centro ao longo da abertura da jaula. Em seguida, prenda com fita adesiva. Selar a junção entre a placa de ágar suco de maçã ea gaiola com Parafilm.
- Coloque a gaiola em um contentor secundário com sumo de maçã placa de agar na forma de base e permitir que as moscas para reproduzir a uma temperatura definida por um período de tempo adequado, tal como determinado pela experiência.
Nota: Os tempos de colheita de amostras wivai variar. Por exemplo, quando a recolha de embriões de fase tardia / larvas L1 precoce (17 - 24 horas), permitir que as moscas a pôr ovos em placas de agar de sumo de maçã durante 7 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 17 horas a 25 ° C. Da mesma forma, para uma recolha de larvas de primeiro estádio de meados de atraso (36 - 48 h) permitir que as moscas a pôr ovos durante 12 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 36 horas a 25 ° C. - Uma vez que o período de tempo é completo, toque na gaiola em uma mesa para que as moscas cair longe da placa de ágar suco de maçã sem anestesia. Substituir rapidamente a placa utilizada por uma nova, contendo uma gota de pasta de levedura. Fixe a placa de fresco com fita adesiva e parafilm e armazenar a gaiola com suco de maçã placa de ágar como base.
- Remova cuidadosamente a queda levedura da placa usada com uma espátula de metal. Coloque a tampa na placa de suco de maçã usado e permitir que os embriões colocados para a idade, se experimentalmente necessário.
Nota: Embora as amostras de envelhecimento, as placas podem ser armazenadas a 25 ° C, a menos que as temperaturas mais elevadas são experimentally necessária. Exemplos de como envelhecer embriões para a coleta são descritos acima (ver nota para o passo 1.3). A remoção da levedura pasta antes de provar o envelhecimento é realizada para evitar larvas de rastejar na levedura e quebrando o agar por baixo. O resíduo ágar suco de maçã e levedura pasta restante fornecer nutrientes para o crescimento larval. Enquanto os embriões fixados directamente na pasta de levedura são perdidos através de remoção de pasta de levedura, esta perda é preferível para levedura e agar de resíduo na amostra, que pode reduzir a eficiência da coloração. Se uma escolha não remover a pasta de levedura, a levedura pode ser liquefeito com Tampão Fosfato de Triton X-100 (PbTx), misturado com um pincel, e em seguida removido a partir da amostra com um filtro de células antes da fixação.
2 Fixação
- Uma vez que os embriões fixados sobre a placa de agar de sumo de maçã têm idade para o ponto de tempo desejado, utilizar um pequeno pincel humedecido com solução de tampão fosfato de Triton X-100 (PbTx) para remover cuidadosamente amostras de poe placa.
Nota: larvas mais velhas são móveis e podem rastejar para o interior da tampa. Esta amostra pode ser recolhida de forma semelhante por remoção com um pincel. - Limpe o pincel amostra-laden contra virado para o interior cume de um filtro de células. Em seguida, lave as paredes do filtro e do pincel com uma garrafa de esguicho contendo solução PbTx. Coloque uma tampa de placa de petri por baixo do filtro para capturar a solução PbTx.
- Depois de toda a amostra foi transferida para o filtro, despeje PbTx suficiente no filtro de levantar a amostra para fora da malha. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos.
- Repita o passo 2.3 três vezes para remover fungos e resíduos que possam ter sido transferidos juntamente com a amostra de voar.
- Despeje suficiente 50% de lixívia (ddH2O) (NaOCl) / água no filtro para aumentar as larvas fora da malha. Permitir que as larvas se sentar na solução por 5 min. Em seguida, levante a peneira e deitar fora tele conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos.
Nota: Bleach é necessária apenas em amostras embrionárias com idades entre 0-22 horas, a fim de remover a membrana coriônica. A aplicação de água sanitária para amostras mais velhas pode ser omitido, mas a sua inclusão não é prejudicial. Se a omissão for desejado, substituir a água sanitária nesta etapa com PbTx. Água sanitária diluída deve ser utilizada dentro de 24 horas de preparação da solução. - Lave amostra no coador com PbTx derramando bastante PbTx no coador para aumentar a amostra para fora da malha. Deixar a amostra para sentar-se em solução para 3 min. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos.
- Repita o passo 2.6 cinco vezes.
- Dab parte inferior do filtro de células secas, em seguida, transferir a amostra para um frasco de cintilação contendo 1,75 ml de solução de PEMS utilizando um pincel.
- Trabalhando numa hotte ventilada, adicionar 250 mL de formaldeído a 37% e 8 ml de heptano de grau de reagente para o frasco de cintilação.
- Deixe o frasco para agitar a 200 rpm ou uma velocidade moderada semelhante para 20 min.
- Adicionar 10 ml de metanol a ampola de cintilação, sem remoção da fase aquosa anterior e permitir que o frasco para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min.
Nota: O metanol é perigoso. Continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas. - Remover o frasco do shaker e imediatamente despeje o conteúdo em um filtro de células sobre um recipiente de resíduos líquidos na capa. Adiciona-se metanol adicional para o frasco e executado através do filtro, conforme necessário para garantir que todo célula da amostra foi removido.
Nota: coadores célula pode drenar lentamente. Para remediar esta situação, um toque de tecido de laboratório para a parte inferior do coador de células, de modo a extrair a solução através do filtro de forma mais rápida. Metanol, formaldeído, e heptano deve serarmazenado em lixeiras apropriadas até o descarte adequado de acordo com as diretrizes institucionais. - Inferior a seco de filtro de células utilizando um tecido de laboratório, em seguida, usar um pincel para transferir a amostra capturada na peneira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,5 ml de metanol.
Nota: Se vários frascos de cintilação estão em uso, conclua as etapas de 2,12 e 2,13 um frasco de cada vez para evitar a amostra de secagem em filtros celulares. - Assim que a amostra foi adicionada ao tubo de microcentrífuga, remover o metanol, com uma pipeta. Certifique-se de amostra tenha assentado no fundo do tubo.
- Lavar amostra no tubo de microcentrífuga, adicionando cerca de 0,5 ml de metanol ao tubo. Espere por amostra para resolver depois remover o metanol com uma pipeta.
- Repita o passo 15 três vezes.
- Adicionar 0,5 ml de metanol ao tubo, em seguida, armazenar em um freezer -20 ° C para uso posterior.
3. Reidratação e Preparação de Amostras para Imunocoloração
- Remover o metanol a partir do tubo de microcentrifugadora com uma pipeta, deixando a amostra no tubo. Loja resíduos de metanol para o recipiente adequado de lixo até à hora de eliminação adequada.
Nota: Para aumentar a eficiência de ultra-sons, utilizar não mais de 3 mm de amostra depositada no fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Excesso de amostra pode ser transferida para um tubo separado com uma pipeta, antes de começar a etapa de re-hidratação acima. Cortar a ponta da pipeta com uma lâmina de barbear limpa pode ser usada para evitar o entupimento da ponta da pipeta. - Adicionar 1,0 ml de uma solução a 50% de metanol / tampão de fosfato Tween (PBTw) para o tubo e rocha durante 3 min.
- Remover solução de metanol para o recipiente de resíduos adequado e enxaguar com 1,0 l de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem, deixar a amostra para resolver antes de tirar fora do PBTw com uma pipeta.
- Adicionar 1,0 ml de albumina sérica bovina / tampão fosfato Tween (BBTw) misturar ao frasco e rock. Após 3 min em uma cadeira de balanço, permitir que o sample para resolver e remover o BBTw com pipeta.
- Repita o passo 3.4 duas vezes, tendo o cuidado de retirar o máximo BBTw possível, sem perder de amostra após a última lavagem.
- Adicionar 0,5 ml de BBTw para o tubo e colocar o tubo em gelo.
4. Sonicação de Amostra
- Defina o sonicador a 10% da amplitude máxima e designar um tempo de execução de 2 seg sonicação constante.
Nota: Essas configurações são específicas para o sonicador indicada nos Materiais e Equipamentos Tabela e pode exigir de otimização para diferentes sonicators. - Antes de ultra-sons de amostra, limpar a sonda de ultra-sons colocando a ponta da sonda em um tubo de 50 ml cheia de água deionizada e de execução sonicador de limpar a sonda. Sonda de ultra-sons a seco com tecido laboratório após corrida.
- Submerge da sonda para o tubo de microcentrífuga contendo amostra de modo que fique posicionado aproximadamente 3 a 4 mm acima da amostra e iniciar sonicação.
- Remover o microcentrifuge tubo e coloca-se em gelo durante pelo menos 30 segundos para dissipar o calor a partir de ultra-sons e permitir que a amostra se depositam no fundo do tubo de microcentrífuga.
- Repita os passos 4.3 e 4.4, conforme necessário, com base na idade da amostra que está sendo processado.
Nota: Para um volume ótimo de amostra sonificação, os embriões mais jovens do que 17 horas não necessitam de ultra-som, mas aqueles entre 17 e 24 horas (fase 17 / early-L1) requerem dois sonicações. Larvas entre 24-36 (início / meio-L1), 36-48 (mid / late-L1), 48-60 (início / meio-L2), 60-72 (mid / late-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (início / meio-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr exigem 5, 9, 11, 13, 15, 18 e 22 sonicações respectivamente. Veja a discussão para posterior elaboração em tempos de sonicação. - Enxágüe com 1,0 ml BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta.
- Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o BBTw com pipeta. </ Li>
- Repita o passo 4.7 duas vezes.
5. Imunocoloração
- Bloquear amostra por adição de 5% de soro normal diluído em BBTw ao tubo de microcentrífuga. Remova o bloco após balançar por 1 hora.
Nota: Use soro normal das espécies em que os anticorpos secundários são gerados. - Diluir anticorpos primários para se apropriar concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw.
- Amostra de rocha no anticorpo primário solução O / N a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
Nota: Os tempos de incubação de anticorpos e as temperaturas podem variar. S / N incubação a 4 ° C ou 3 horas à temperatura ambiente é tipicamente suficiente. No entanto, um período de incubação de dois dias, pode melhorar a qualidade de coloração, especialmente com amostras mais velhas ou quando os anticorpos primários de baixa afinidade são utilizadas. Incubações mais longas são geralmente realizados a 4 ° C. Considerações similares devem ser feitas quando se utiliza anticorpos secundários (ver 5.10). - Deixar a amostra em repouso para ainferior do tubo de microcentrífuga. Colhem-se anticorpos primários com pipeta. Salve anticorpos para reutilização, se desejar.
- Enxágüe com 1,0 ml de BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta.
- Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se instalar e remover BBTw com pipeta.
- Repita o passo 5.6 cinco vezes.
- Bloco amostra por adição de uma solução de soro normal de / BBTw 5% para o tubo de microcentrífuga. Remova o bloco de balanço depois durante 30 minutos a 1 hora.
Nota: Esta etapa bloqueio adicional não é necessária, mas pode melhorar a qualidade de coloração para detecção de anticorpos específicos. - Diluir anticorpos secundários se apropriar de concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw.
- Enrole tubo de microcentrífuga em papel de alumínio para reduzir o desbotamento devido à exposição à luz. Amostra de rocha na solução de anticorpo secundário por 12 a 48 horas a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
- Deixar a amostra em repouso para a parte inferior do tubo de microcentrífuga. Empate fora de anticorpos secundários com pipeta.
- Enxágüe com 1,0 ml de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra antes de se estabelecer a remoção do PBTw com uma pipeta.
- Adicionar 1,0 ml de PBTw ao frasco e rock. Depois de 5 minutos sobre o roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o PBTw com pipeta.
- Repita o passo 5.13 três vezes.
- Opcional: Adicione DAPI diluído 1: 1.000 em PBTw. Amostra de rocha embrulhados em papel alumínio por 3 min; em seguida, remover a solução DAPI com uma pipeta. Lavar cinco vezes com 1,0 ml de PBTw, permitindo amostra para resolver antes de remover PBTw com pipeta.
- Adicionar 80 - 100 mL de 1,4-diazabiciclo solução [2.2.2] octano (DABCO) ao tubo de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
Nota: Um outro agente anti-desbotamento base de glicerol pode ser substituído por.
6 Análise
- Antes de amostra de montagem em lâminas, adicionar um extra de 5 - 10 mL de DABCO / p-fenylenediamine (PPD) antifade solução para tubo de microcentrífuga.
Nota: A amostra pode ser adicionada a lâminas sem a dissecção. O volume de amostra adicionada a uma corrediça varia com o tamanho da tampa deslizante. Quando pipetar amostra em slide, a ponteira pode ser cortada com uma lâmina de barbear para evitar amostra de corte. Muitas vezes, é útil para a linha de exemplo em linhas de análise fácil. A adição de um agente de PPD como antifade adicional pode não ser necessária, mas pode evitar a fotodegradação se as amostras são armazenadas a longo prazo. - Delicadamente, coloque a tampa de vidro de deslizamento ao longo da amostra. Então, lamínula seguro no local usando unha polonês.
- Ver montado amostra usando microscopia de fluorescência.
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Representative Results
Para demonstrar a eficácia de imunocoloração à base de ultra-sons na análise de embriões de fase final e tecidos larvais in situ, os embriões de tipo selvagem e as larvas foram processadas para imuno-coloração dos testículos, dos ovários, e tecido neural. As amostras foram fotografadas por microscopia confocal e os resultados representativos são mostrados (Figura 1 e Figura 2). Os resultados revelam que o protocolo descrito é eficaz para a visualização de características morfológicas, bem como células individuais em situ durante / mid-L3 estágios finais-embrionário até o início do desenvolvimento da Drosophila.
Os resultados de imunocoloração: Testículos
O desenvolvimento dos testículos é um bom sistema para ilustrar a eficácia do protocolo, desde testes de maturação é dinâmico ao longo do desenvolvimento larval. Testículos adulto de Drosophila formar um tubo em espiral com uma extremidade cega, em que a célula-tronco de linha germinal (SGC) nicho está situada (ver 13,14 para comentários). Neste nicho, GSCS estão dispostas em torno de um conjunto apertado de células somáticas não-mitóticas chamado hub. GSCS sofrem divisão assimétrico para produzir um GSC que permanece ancorada ao cubo e uma filha gonialblast que é deslocada para fora do nicho de células estaminais. Como o gonialblast divide incompletamente, extensões citoplasmáticos chamada forma fusomes, que liga as células dentro do spermatogonium. Após quatro divisões sucessivas, o spermatogonium inicia meiose para formar o esperma.
Formação testículo começa com a associação de células primordiais germinais (PGCs) e células precursoras gonadal somáticas (SGPS), durante a embriogênese (ver 15,16 para comentários). Esta associação resulta na formação de um nicho SGC funcionais até ao fim da embriogénese 8-10. Em meados de L1, divisões SGC assimétricos dentro do nicho GSC dar origem a diferenciação espermatogônias com fusomes ramificada 9. Divisão GSC assimétrica continua durante todo larvaldesenvolvimento, resultando na produção de Espermatogônias adicional e um aumento progressivo no tamanho das gónadas. Imagens representativas de final embrionárias e início testículos / mid-L1, L2 e L3, imunomarcadas para as células germinativas, células do cubo e fusomes, são mostrados (Figura 1A-D). Estas imagens ilustram as mudanças dinâmicas no tamanho das gônadas e diferenciação de células germinativas observados em testes ao longo do tempo.
Os resultados de imunocoloração de Ovário:
Adulto ovários de Drosophila são compostas de 16-20 unidades produtoras de ovos individuais chamados ovarioles (ver 17,18 para comentários). Em uma das extremidades de cada ovaríolo, uma estrutura chamada germário contém um nicho de células-tronco. O nicho ovaríolo é composto por GSCS indiferenciadas e duas populações de células somáticas: células cap e células filamento terminal (TFS). Semelhante à do testículo, GSCS sofrem divisão assimétrico para produzir um GSC que permanece adjacente para as células de fixação e uma célula filha diferenciador, Chamada de cistoblasto, que é empurrado para longe do nicho. O cistoblasto posteriormente passa por quatro ciclos de divisão celular para formar um cisto na linha germinal, interligados por uma fusoma ramificada. Cada linha germinal-Cisto é, então, rodeado por células foliculares de produzir uma câmara de ovo que continua a amadurecer medida que se move ao longo do comprimento do ovaríolo.
Como testículos, ovários são formadas pela primeira vez durante a embriogênese 16,18. Vários ovarioles surgem de uma única gônada embrionária composta por PGCs e PECs. Em meados de L3, SGPS dão origem aos precursores TF no ovário anterior, enquanto as células germinativas localizar a posterior ovário e associado com células misturadas SGP-derivados (ICs) 19-22. Ao final de L3, as células TF diferenciar e se organizar em pilhas encontradas no nicho de células-tronco adultas, GSCS e células cap são estabelecidas, e diferenciação de linha germinal cisto é observado 19,20,23. Imagens representativas de embriões em estágio final e ovários início / meio-L3, immunostained de células germinativas, SGPS, ICs, precursores do TF, e fusomes, são mostrados (Figura 1E, F). Estas imagens mostram a morfologia normal e progressão do desenvolvimento para a sua idade.
Os resultados de imunocoloração Neural:
O sistema nervoso central Drosophila (CNS) é derivado de células-tronco neurais, chamados de neuroblastos (RN), que surgem a partir neuroepithelium embrionário (veja 24,25 para comentários). RN em embriões e larvas dividir assimetricamente para produzir células-mãe gânglio (GMC), que, por sua vez, geram neurônios e células da glia encontrados no cérebro adulto e cordão nervoso ventral. Porque RN larvais dar origem a que a maioria dos neurónios adultos e podem ser distinguidas com base na sua posição no interior do cérebro, o cérebro larvais tornaram-se um modelo importante para estudar o comportamento do NB e diferenciação neuronal.
O cérebro L3 é composto por dois lobos e um cordão nervoso ventral localizada centralmente 24.Imagens representativas de cérebros meados de L3 imunomarcadas para RN, GMC, os neurônios indiferenciadas, os neurônios imaturos e primários e células da glia são mostrados (Figura 2A-C) 26-30. Estas imagens mostram forte coloração em padrões de expressão distintos dentro dos lóbulos cerebrais e da medula nervosa ventral. Dependendo da posição de montagem, permite a visualização de imagens de tecido do cérebro a partir da superfície dorsal (Figura 2A), a superfície ventral (Figura 2B), ou na secção transversal longitudinal (Figura 2C).
Eficiência de coloração:
Nossos resultados demonstram que a representação de um processo imuno-base sonicação é versátil. Não só pode ser utilizada para identificar tipos específicos de células, mas também pode ser usado para indicar a presença de proteínas e organelos específicos. No entanto, resultados ambíguos podem derivar da variação esperada na eficiência coloração. Por exemplo, anti-vasa coradas pelo menos uma gônadasem 73,2% de todas as larvas examinados (n = 781), enquanto que o anti-Elav cérebro coradas em 86% das larvas (n = 115). Além disso, observa-se que a coloração eficiência é aproximadamente inversamente proporcional ao estágio de desenvolvimento. Em embriões em estágio avançado, anti-vasa manchado 89,8% das gônadas (n = 206), enquanto a coloração esteve presente em apenas 59,8% e 46,9% das larvas em L2 e L3 meados de, respectivamente (n = 132 e 49). Além disso, os resultados de sonicação em perda de amostra. Quando o número de embriões e larvas presentes na amostra um volume óptimo de sonicação foi contado antes e após a sonicação, uma média de 41,0% da amostra foi determinada inadequada para análise (n = 1165). Para maximizar a eficiência de coloração, os protocolos devem ser otimizados para anticorpos específicos, alterando as concentrações de anticorpos publicados ou tempos de incubação de anticorpos.
A Figura 1 I. mmunostain das gônadas Drosophila in situ (AD) Imagens de testes in situ em embriões em estágio avançado (estágio 17 / early-L1) até o início / meados de larvas L3 imunocorados com anti-Vasa (AD, vermelho; A'-D ' sozinho) para detectar as células germinais, anti-Fasicilin III (III) e Fas anti-1B1 (AD, verde, A '' - D '' sozinho) para detectar as células de cubos e fusomes respectivamente, e DAPI (AD, azul, A ' '' D '' 'sozinho) para detectar núcleos. (A) Stage 17 / início de testículo L1 mostra o hub recentemente se fundiram e fusomes esféricas em células germinativas indiferenciadas. (B) Antiga / mid-L1 testículo mostra fusomes esféricas em GSCS localizadas perto do centro e em alguns posterior células germinativas alongado fusomes indicativos de diferenciação das espermatogónias cedo. (C) Antiga / mid-L2 e
Figura 2 imunocoloração de tecidos neurais Drosophila in situ. Larvas Antiga / mid-L3 imunocorados com anti-Elav (
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Discussion
Este protocolo fornece um método para atingir com sucesso imunocoloração Drosophila embrionário e larval tecidos in situ, eliminando, assim, a necessidade de dissecção. De acordo com os protocolos anteriores, para a coloração de embriões de 1,2,3, a membrana coriónica é removido usando 50% de lixívia (hipoclorito de sódio). As amostras são fixadas em formol e metanol. Porque a cutícula larval provoca amostra mais para flutuar, a totalidade da amostra é então passada através de um coador de células para assegurar a retenção das larvas. A amostra é armazenada, se desejado, no seio de metanol de grau químico. Depois de re-hidratação, um processo de ultra-sons devidamente aplicada perturba a integridade da cutícula larval. Isto é crítico após a formação da cutícula para permitir a permeação suficiente de anticorpos necessários para a imunocoloração. Antes de aplicar anticorpos, balançando a amostra em soro normal de 5% / solução BBTw impede a ligação do anticorpo inespecífico excessiva. Os anticorpos primários são então adicionados para detectar proteínas específicas expressed no tecido alvo. Após a lavagem para remover os anticorpos não ligados primárias, anticorpos secundários ligados a fluoróforos são usados para marcar a localização dos anticorpos primários ligados. A análise pode ser realizada, em seguida, com epifluorescência ou microscopia confocal.
Algumas modificações podem ser necessárias para otimizar os resultados em circunstâncias individuais. Em particular, a energia de ultra-sons e o número de sonicações realizados podem necessitar de um ajustamento de acordo com a ultrassons utilizada. Adaptações à altura da sonda de ultra-sons acima da amostra, assim como para o volume da solução pode também ser necessária para diferentes sonicators ou se amostra suficiente não pode ser obtida. O aumento da turbidez da solução pode ser utilizada como um indicador de lise do tecido e, por conseguinte, fornece uma medida para a sonicação quando é demasiado grave. Se a solução de turvação torna-se elevada, o experimentador deve considerar a redução do número de sonicações realizados, aumentando o volume de solução, aumentando a altura do sonicator sonda acima da amostra, e / ou reduzindo a potência de ultra-sons.
As alterações também podem ser necessários no protocolo imunomarcação para melhorar a qualidade da imagem. Tal como acontece com a maioria dos procedimentos de positividade a relação sinal-ruído pode ser alterada através da modificação de diluição de anticorpo, o tempo e temperatura de incubação do anticorpo com a amostra, e / ou bloqueio dos reagentes utilizados. Embora cada anticorpo tem de ser considerado de forma independente, em especial no que diz respeito a diluição de anticorpo, descobrimos que a incubação a 4 ° C durante períodos de tempo mais longos podem melhorar a qualidade de coloração após a sonicação, especialmente para anticorpos com baixo sinal para relações de ruído e quando larvas mais velhas são examinados. Nesses casos, a qualidade da coloração podem também beneficiar de uma ligeira redução na diluição do anticorpo secundário. Neste protocolo, que incluem tanto BSA e soro como os reagentes de bloqueio, e a amostra é re-bloqueada, antes da adição de anticorpos secundários, a fim de aumentar a qualidade da coloração. Dependendo dos anticorpos usard, re-bloqueio e da inclusão de ambos os reagentes de bloqueio podem ou não ser necessária para aumentar a coloração. Se a etapa de re-bloqueio é omitido, lavagens mais longos e mais lavagens pode produzir imagens mais limpas. Finalmente, os anticorpos policlonais de pré-absorventes podem aumentar a relação sinal-ruído. Pré-absorção é realizada por incubação do anticorpo desejado com embriões ou larvas antes da utilização em uma imunocoloração uma re-hidratadas.
Conforme demonstrado em nossos resultados representativos, ultra-sons permite a visualização clara de tecidos-alvo in situ e, portanto, fornece uma alternativa razoável à dissecção dos tecidos em protocolos de positividade. A dissecção pode ser complicado em embriões de Drosophila e larvas devido a dificuldades de localizar, isolar e extrair tecidos-alvo não danificadas. Alternativamente sonicação permite tecidos permanecer no contexto de todo o organismo. Porque sonicação evita extração e tecidos de montagem entre um slide e um sli coberturap, conserva mais precisamente na morfologia situ. Praticamente, as grandes quantidades de amostra pode ser processada mais rapidamente para análise futura, uma vez que muitos organismos pode ser sonicada simultaneamente.
Embora sonicação oferece uma ótima alternativa para dissecção, tem limitações que devem ser consideradas. Sonication beneficamente rompe a integridade da cutícula larval, mas destrói algumas amostras no processo (ver resultados representativos). Enxaguamento para remover detritos biológicos é necessária na sequência do processo de ultra-sons, o que pode reduzir ainda mais o tamanho da amostra. Além disso, a imunocoloração embriões inteiros e larvas deixa o tecido de interesse incorporado nos tecidos circundantes. Estes tecidos circundantes podem manchar positivamente ou que apresentam a ligação do anticorpo não específico, reduzindo assim a qualidade da imagem final. Finalmente, manchando a eficiência pode ser variável. Esta variabilidade pode depender da idade da amostra, a eficácia de ultra-sons, e a especificidade do anticorpo. Como resultado, sonicação-baimuno-sed de montar todo o tecido pode não ser sempre preferível. Em particular, imuno-base dissecção pode ser mais eficiente quando se estuda os tecidos grandes em larvas de fim de L3. Além disso, ultra-sons pode cortar precoce e meados de estágio embriões. Apesar destas limitações, imunocoloração à base de ultra-sons é uma técnica altamente eficaz, que é bem adequado para a análise do desenvolvimento de uma variedade de tecidos, em embriões de fase final através de início / larvas meados de L3. Em nosso laboratório, nós usamos regularmente este protocolo para estudar a morfogênese gonadal em embriões de Drosophila e larvas 9,10. Além disso, prevemos que a implementação deste protocolo vai provar igualmente frutífero no estudo do desenvolvimento de outros tecidos em Drosophila e em outros organismos com uma cutícula protetora.
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Acknowledgments
Somos gratos a Ruth Lehman e Dorthea Godt que gentilmente fornecido anticorpos Vasa e Engarrafamento. Gostaríamos de agradecer o Bloomington Banco Central da Universidade de Indiana para a manutenção das existências previstas eo Developmental Studies Hybridoma Banco desenvolvidas sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa. Agradecemos a todos os membros do laboratório Wawersik para os seus conselhos e apoio. Este trabalho foi financiado pela Monroe Scholars Programa Bolsa (para AF e LB) e NSF conceder IOS0823151 (a MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
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