Abstract
Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene en la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.
Introduction
Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila <17 h después de la puesta de huevos (AEL) 1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticuerpo eficaz. Por lo tanto, estos protocolos de inmunotinción son ineficientes en el análisis de los tejidos en embriones de la última etapa y en etapas posteriores de desarrollo de las larvas (1 st estadio (L1), 2 nd estadio (L2), y 3 º estadio (L3)). Esta ineficiencia impone una barrera para nuestra comprensión de los procesos dinámicos que ocurren durante este período de desarrollo prolongado 4. Tissdisección ue es una técnica ampliamente utilizada para eludir esta barrera 5-7. Sin embargo, la disección puede resultar ineficaz. La extracción puede ser gravado por la dificultad en localizar o aislar embriones y tejidos larvarios. Por otra parte, la eliminación física de los tejidos diana puede causar daño rompiendo ellos o al no extraer en su totalidad.
La sonicación es un método que emplea ondas sonoras para perturbar las interacciones intermoleculares. Se ha utilizado para interrumpir la integridad de la cutícula de las larvas de Drosophila con el fin de inmunotinción desarrollo de tipos de células neuronales 6. Este protocolo ha sido adaptado a inmunotinción de embriones en etapa tardía y las gónadas de larvas, que pueden ser tan pequeñas como 50 micras de diámetro 8-10. A través de estos estudios, el proceso de células madre de línea germinal (GSC) formación nicho macho se ha caracterizado en la etapa tardía embriones de Drosophila 8-10 y los mecanismos que regulan el desarrollo de células madre y el DIFdiferencia- en la etapa tardía gónadas embrionarias y las larvas se han dilucidado 9-12. Por lo tanto, sonicación proporciona una alternativa eficiente para la disección de tejidos que puede ser difícil debido al tamaño del tejido. Además, permite la inmunotinción de tejidos de Drosophila in situ, dejando a las células en el contexto de todo el organismo y mantener en la morfología situ. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para la fluorescencia inmunotinción de la última etapa embrionaria hasta principios / mediados de los tejidos L3 in situ. Análisis de Drosophila gonadal y neural tejido se muestra en los resultados representativos para demostrar la eficacia de este protocolo. Además, este protocolo de inmunotinción puede estar adaptado para analizar otros tejidos de Drosophila, así como en otros organismos tejidos con una cutícula externa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Preparación de una jaula de Colección
- Anestesiar jóvenes, moscas fértiles con CO 2. Transferencia moscas anestesiados a una jaula. Para obtener un rendimiento óptimo, utilice 100-120 moscas adultas que van de 2-7 días de edad en una proporción de 4: 1 de mujeres a hombres. Permitir moscas un período de aclimatación apropiada, ~ 24 horas antes de la obtención de la muestra para la fijación. Si la jaula se creó con hembras vírgenes se aparearon con machos, un uso un 36 - periodo de aclimatación de 48 horas.
- En el extremo libre de la jaula, coloque una placa de agar de zumo de manzana preparado previamente con una gota tamaño de una moneda de la pasta de levadura en el centro sobre la abertura de la jaula. A continuación, fije con cinta adhesiva. Sellar la unión entre la placa de agar de zumo de manzana y la jaula con Parafilm.
- Coloque la jaula en un recipiente secundario con placa de agar jugo de manzana como la base y permitir que las moscas para reproducir a una temperatura definida durante un período adecuado de tiempo determinado por el experimento.
Nota: Los tiempos de recogida de muestras will variar. Por ejemplo, en la recogida de embriones en fase tardía / larvas L1 precoz (17 - 24 horas), permitirá a las moscas ponen sus huevos en placas de agar de jugo de manzana durante 7 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 17 horas a 25 ° C. Del mismo modo, para una colección de larvas de primer instar a mediados-finales (36 - 48 hr) permiten a las moscas ponen huevos durante 12 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 36 horas a 25 ° C. - Una vez que el período de tiempo es completa, puntee en la jaula en una mesa para que las moscas caen fuera de la placa de agar jugo de manzana sin anestesia. Colocar inmediatamente la placa utilizada por una nueva que contiene una gota de pasta de levadura. Asegure la placa fresca con cinta y parafina y almacenar la jaula con placa de agar jugo de manzana como base.
- Retire con cuidado la caída de la levadura de la placa utilizada con una espátula de metal. Coloque la tapa en la placa de jugo de manzana se utiliza y permitir embriones puso a la edad si experimentalmente necesario.
Nota: Si bien el envejecimiento muestras, placas pueden almacenarse a 25 ° C menos que las temperaturas más altas son ExperimentaLLY necesario. Ejemplos de cómo los embriones para la recolección se ha descrito anteriormente la edad (ver nota para el paso 1.3). La eliminación de pasta de levadura antes de probar el envejecimiento se realiza para evitar que las larvas de meterse en la levadura y romper el agar debajo. El residuo agar jugo de manzana y pasta de levadura restante proporcionan nutrientes para el crecimiento de las larvas. Mientras que los embriones fijados directamente en la pasta de levadura se pierden a través de la eliminación de pasta de levadura, esta pérdida es preferible a la levadura y agar residuo de la muestra que puede reducir la eficiencia de la tinción. Si uno elegir no eliminar la pasta de levadura, la levadura puede ser licuado con tampón fosfato Triton X-100 (PbTx), mezclado con un pincel, y luego se retira de la muestra con un filtro de células antes de la fijación.
2. Fijación
- Una vez que los embriones fijados sobre la placa de agar jugo de manzana han envejecido hasta el punto de tiempo deseado, use un pincel pequeño humedecido con tampón fosfato Triton X-100 solución (PbTx) para quitar cuidadosamente la muestra de jue plato.
Nota: Las larvas más viejas son móviles y puede gatear en el interior de la tapa. Esta muestra se puede recoger de manera similar por la eliminación con un pincel. - Limpie el pincel-muestra cargado contra la arista interior-frente de un filtro celular. Luego, enjuague las paredes del colador y el pincel con una botella con atomizador que contiene solución PbTx. Coloque una cubierta de placa de Petri debajo del filtro para capturar la solución PbTx.
- Después de toda la muestra se ha transferido al colador, vierta suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos.
- Repita el paso 2.3 tres veces para eliminar la levadura y los residuos que puedan haber sido transferido junto con la muestra vuelan.
- Vierta suficiente 50% de lejía (NaOCl) / agua (ddH2O) solución en el colador para elevar las larvas fuera de la malla. Permita que las larvas que se siente en la solución durante 5 minutos. Luego, levante el colador y verter tque el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos.
Se requiere Bleach sólo en las muestras embrionarias de edades comprendidas 0-22 hr a fin de eliminar la membrana coriónica: Nota. La aplicación de cloro para muestras de mayor edad se puede omitir, pero su inclusión no es perjudicial. Si se desea omisión, sustituya la lejía en este paso con PbTx. Lejía diluida debe utilizarse dentro de las 24 horas de preparación de la solución. - Lavar la muestra en el colador con PbTx vertiendo suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. Permita que la muestra que se siente en la solución durante 3 min. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos.
- Repita el paso 2.6 de cinco veces.
- Frote la parte inferior del filtro celular seco, a continuación, transferir la muestra a un vial de centelleo que contiene 1,75 ml de solución PEMS usando un pincel.
- Trabajar en una campana de humos con ventilación, añadir 250 l de formaldehído al 37% y 8 ml de heptano grado reactivo en el vial de centelleo.
- Dejar que el vial agitar a 200 rpm o velocidad moderada similar para 20 min.
- Añadir 10 ml de metanol para vial de centelleo sin la eliminación de la fase acuosa anterior y permitir que el vial para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min.
Nota: El metanol es peligroso. Continuar trabajando en una campana extractora bien ventilada y use guantes adecuados. - Retire el vial de agitador e inmediatamente vierta el contenido en un filtro de células sobre un recipiente de residuos líquidos en la campana. Añadir metanol adicional para el vial y ejecutar a través del filtro como sea necesario para asegurar que todos célula de muestra se ha eliminado.
Nota: coladores celulares pueden drenar lentamente. Para remediar esto, tocar un tejido de laboratorio para la parte inferior del filtro de células a fin de extraer la solución a través del filtro más rápidamente. El metanol, formaldehído, y heptano debería seralmacenada en contenedores para residuos apropiados hasta la eliminación adecuada según las directrices institucionales. - Fondo seco del filtro de células utilizando un tejido de laboratorio, a continuación, utilizar un pincel para transferir la muestra capturada en el colador a un tubo de 1.5 ml contiene 0,5 ml de metanol.
Nota: Si hay varios viales de centelleo están en uso, complete los pasos 2.12 y 2.13 un vial a la vez para evitar que la muestra se seque en células coladeras. - Una vez que la muestra se ha añadido al tubo de microcentrífuga, eliminar el metanol con una pipeta. Asegurar la muestra ha depositado en el fondo del tubo.
- Enjuague muestra en el tubo de microcentrífuga mediante la adición de aproximadamente 0,5 ml de metanol al tubo. Espere a que la muestra que conformarse entonces eliminar el metanol con una pipeta.
- Repita el paso 15 de tres veces.
- Añadir 0,5 ml de metanol en el tubo, y luego almacenar en un congelador -20 ° C para su uso posterior.
3. Rehidratación y Preparación de la muestra para la inmunotinción
- Eliminar el metanol desde el tubo de microcentrífuga con una pipeta, dejando la muestra en el tubo. Tienda metanol residuos al contenedor de desechos apropiado hasta el momento de su eliminación adecuada.
Nota: Para mejorar la eficiencia de tratamiento con ultrasonidos, utilizan no más de 3 mm de la muestra se establecieron en la parte inferior del tubo de 1.5 ml. El exceso de muestra puede ser transferida a un tubo separado con una pipeta antes de comenzar la etapa de rehidratación anteriormente. Cortar la punta de la pipeta con una cuchilla de afeitar limpia se puede utilizar para prevenir la obstrucción de la punta de pipeta. - Añadir 1,0 ml de una / tampón fosfato Tween (PBTw) solución de metanol 50% al tubo y de la roca durante 3 min.
- Eliminar la solución de metanol al recipiente de desechos adecuado y enjuague con 1,0 l de PBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta.
- Añadir 1,0 ml de albúmina de suero bovino / Phosphate Buffered Tween (BBTw) mezclar al vial y el rock. Después de 3 minutos en un agitador, permitir que el sample se asiente y retire la BBTw con pipeta.
- Repita el paso 3.4 dos veces, teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad BBTw como sea posible sin perder la muestra después del último lavado.
- Añadir 0,5 ml de BBTw al tubo y colocar el tubo en hielo.
4. La sonicación de la Muestra
- Ajuste el aparato de ultrasonidos a 10% de la amplitud máxima y designar un tiempo de ejecución de sonicación constante 2 seg.
Nota: Estos ajustes son específicos para el aparato de ultrasonidos se indica en los materiales y equipos Mesa y pueden requerir de optimización para diferentes sonicadores. - Antes de la sonicación de la muestra, limpiar la sonda de ultrasonidos mediante la colocación de la punta de la sonda en un tubo cónico de 50 ml lleno de agua desionizada y ejecutar sonicador para limpiar la sonda. Sonda de ultrasonidos en seco con papel de laboratorio después de la ejecución.
- Sumergir la sonda en el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra de modo que se sitúe aproximadamente 3 a 4 mm por encima de la muestra y empezar a sonicación.
- Retire la microcentrifuge tubo y colocarlo en hielo durante al menos 30 segundos para disipar el calor de sonicación y permitir que la muestra se asiente en la parte inferior del tubo de microcentrífuga.
- Repita los pasos 4.3 y 4.4, según sea necesario por motivos de edad de la muestra que se está procesando.
Nota: Para obtener el volumen de muestra sonicación óptima, los embriones menos de 17 horas, no requieren tratamiento con ultrasonidos, pero aquellos entre 17 y 24 horas (etapa 17 / early-L1) requieren dos sonicaciones. Las larvas entre 24 - 36 (a principios / mediados de L1), 36 - 48 (mediados / finales-L1), 48 - 60 (a principios / mediados de L2), 60 - 72 (mediados / finales-L2), 72-84 ( principios-L3), 84-96 (principios / mediados de L3), 96-108 (mediados / finales-L3) hr requieren 5, 9, 11, 13, 15, 18, y 22 sonicaciones respectivamente. Véase la discusión para más explicaciones sobre los tiempos de sonicación. - Enjuague con 1,0 ml BBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta.
- Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la BBTw con pipeta. </ Li>
- Repita el paso 4.7 dos veces.
5. Inmunoticción
- Bloque de muestras mediante la adición de 5% de suero normal diluida en BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 1 hora.
Nota: Utilice el suero normal de la especie en la que se generan los anticuerpos secundarios. - Diluir anticuerpos primarios para apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%.
- Muestra de la roca en la solución de anticuerpo primario O / N a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
Nota: Los tiempos de incubación de anticuerpos y las temperaturas pueden variar. O / N de incubación a 4 ° C o 3 horas a RT es típicamente suficiente. Sin embargo, un período de incubación de dos días puede mejorar la calidad de la tinción, especialmente con muestras mayores o cuando se utilizan anticuerpos primarios de baja afinidad. Incubaciones más largas se realizan normalmente a 4 ° C. Consideraciones similares se deben hacer al utilizar anticuerpos secundarios (véase 5.10). - Permita que la muestra se deposite enparte inferior del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos primarios con pipeta. Ahorra anticuerpos para la reutilización, si lo desea.
- Enjuague con 1,0 ml de BBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta.
- Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, deje la muestra se asiente y eliminar BBTw con pipeta.
- Repita el paso 5.6 de cinco veces.
- Bloque de muestras mediante la adición de solución al 5% / suero normal de BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 30 minutos a 1 hora.
Nota: No se requiere este paso adicional de bloqueo, pero puede mejorar la calidad de la tinción de anticuerpos específicos. - Diluir anticuerpos secundarios de apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%.
- Envuelva tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para reducir el desvanecimiento debido a la exposición a la luz. Muestra de la roca en la solución de anticuerpo secundario durante 12 a 48 horas a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
- Permita que la muestra se deposite en el fondo del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos secundarios con pipeta.
- Enjuague con 1,0 ml de PBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta.
- Añadir 1,0 ml de PBTw al vial y el rock. Después de 5 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la PBTw con pipeta.
- Repita el paso 5.13 tres veces.
- OPCIONAL: Añadir DAPI diluido 1: 1000 en PBTw. Muestra de la roca envuelta en papel de aluminio durante 3 min; a continuación, eliminar la solución de DAPI con una pipeta. Enjuague cinco veces con 1,0 ml de PBTw, permitiendo que la muestra se asiente antes de extraer PBTw con la pipeta.
- Añadir 80-100 l de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano solución (DABCO) al tubo de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C.
Nota: Otro agente anti-fade basado en glicerol puede ser sustituido por.
6. Análisis
- Antes de la muestra de montaje en portaobjetos, añadir un extra de 5 - 10 l de DABCO / p-phenilenodiamina (PPD) Antifade solución al tubo de microcentrífuga.
Nota: La muestra se puede añadir a las diapositivas sin disección. El volumen de muestra añadido a una diapositiva varía con el tamaño de hoja de la cubierta. Cuando el pipeteado de la muestra en un portaobjetos, la punta de pipeta se puede cortar utilizando una cuchilla de afeitar para prevenir muestra de cizallamiento. A menudo es útil para alinear muestra en filas para el análisis fácil. La adición de PPD como un agente Antifade adicional puede no ser necesaria, pero puede evitar photobleaching si las muestras se almacenan a largo plazo. - Coloque suavemente hoja de la cubierta de vidrio sobre la muestra. Entonces, cubreobjetos seguro en su lugar con el esmalte de uñas.
- Ver muestra montada mediante microscopía de fluorescencia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la visualización de características morfológicas, así como células individuales en situ durante las etapas finales de-embrionario hasta principios / mediados de L3 de desarrollo de Drosophila.
Los resultados de Testis Inmunotinción:
Desarrollo de los testículos es un buen sistema para ilustrar la eficacia de protocolo desde la maduración de los testículos es dinámico durante el desarrollo larval. Testículos adultos de Drosophila forman un tubo en espiral con un extremo ciego, donde la célula madre de línea germinal (GSC) está situado nicho (véase 13,14 para revisiones). En este nicho, GSCs se disponen en torno a un grupo compacto de células somáticas no mitóticas llamado hub. GSCs someterse a la división asimétrica para producir una GSC que permanece anclada al cubo y una hija gonialblast que se desplaza lejos de la nicho de células madre. Como el gonialblast divide de forma incompleta, extensiones citoplasmáticas llamados fusomes forma, la conexión de las células dentro de la espermatogonia. Después de 4 divisiones sucesivas, la espermatogonia inicia la meiosis para formar esperma.
Formación Testis comienza con la asociación de las células germinales primordiales (PGC) y somáticos células precursoras gonadales (SGPS) durante la embriogénesis (ver 15,16 para revisiones). Esta asociación resultado la formación de un nicho GSC funcional por el final de la embriogénesis 8-10. A mediados de L1, divisiones asimétricas SGC dentro del nicho de GSC dan lugar a la diferenciación de las espermatogonias con fusomes ramificados 9. GSC división asimétrica continúa a lo largo de las larvasdesarrollo, lo que resulta en la producción de espermatogonias adicional y un aumento progresivo en el tamaño de las gónadas. Imágenes representativas de finales de los testículos / mid-L1, L2 y L3 embrionarias y tempranas, immunostained para las células germinales, células de cubo y fusomes, se muestran (Figura 1A-D). Estas imágenes ilustran los cambios dinámicos en tamaño de las gónadas y la diferenciación de células germinales observados en los testículos en el tiempo.
Los resultados de Inmunotinción Ovario:
Ovarios adultos de Drosophila se componen de 16 a 20 unidades productoras de huevos individuales llamados ovarioles (ver 17,18 para revisiones). En un extremo de cada ovariole, una estructura llamada germarium contiene un nicho de células madre. El nicho ovariole se compone de GSCs indiferenciadas y dos poblaciones de células somáticas: las células de cabeza y las células de filamentos terminales (TFS). Similar a los testículos, GSCs someterse a la división asimétrica para producir una GSC que queda adyacente a las células gorra y una célula hija diferenciador, Llamado cystoblast, que se apartó de la hornacina. El cystoblast posteriormente se somete a 4 rondas de división celular para formar un quiste de la línea germinal, interconectados por una fusome ramificada. Cada línea germinal-quiste es entonces rodeado por las células del folículo para producir una cámara de huevos que sigue madurando medida que se mueve hacia abajo la longitud de la ovariole.
Al igual que los testículos, los ovarios se forman por primera vez durante la embriogénesis 16,18. Múltiples ovarioles surgen de una sola gónada embrionaria compuesto de PGCs y los PGS. A mediados de L3, SGPS dan lugar a precursores TF en la parte anterior del ovario, mientras que las células germinales se localizan en la parte posterior del ovario y asociarse con células entremezcladas derivados-SGP (CI) 19-22. A finales-L3, células TF se diferencian y se organizan en las pilas que se encuentran en el nicho de células madre adultas, GSCs y tope células se establecen, y la diferenciación del quiste de la línea germinal se observa 19,20,23. Imágenes representativas de embriones en etapa tardía y ovarios principios / mediados de L3, immunostained para las células germinales, SGPS, ICs, precursores TF y fusomes, se muestran (Figura 1 E, F). Estas imágenes muestran la morfología normal y la progresión del desarrollo para su edad.
Los resultados de Neural Inmunotinción:
El sistema nervioso central de Drosophila (CNS) se deriva de las células madre neuronales, llamadas neuroblastos (NBS), que surgen de neuroepitelio embrionario (ver 24,25 para revisiones). RN en embriones y larvas división asimétrica para producir células madre ganglio (GMC) que, a su vez, generar neuronas y células gliales que se encuentran en el cerebro adulto y cordón nervioso ventral. Debido NB larvas dan lugar a la mayoría de las neuronas adultas y se pueden distinguir sobre la base de su posición dentro del cerebro, cerebros de larvas se han convertido en un importante modelo para estudiar el comportamiento NB y la diferenciación neural.
El cerebro L3 se compone de dos lóbulos y un cordón nervioso ventral situado en el centro 24.Imágenes representativas de cerebros mediados de L3 inmunoteñidas para los RN, GMC, las neuronas diferenciadas, las neuronas inmaduras y primaria y las células gliales se muestran (Figura 2A-C) 26-30. Estas imágenes muestran fuerte tinción en distintos patrones de expresión dentro de los lóbulos del cerebro y el cordón nervioso ventral. Dependiendo de la orientación de montaje, permite la visualización de imágenes de tejido cerebral de la superficie dorsal (Figura 2A), la superficie ventral (Figura 2B), o en sección transversal sagital (Figura 2C).
Eficiencia de tinción:
Nuestros resultados representativos demuestran que un procedimiento de inmunotinción a base de sonicación es versátil. No sólo puede ser utilizado para identificar los tipos de células específicas, pero también puede ser utilizado para indicar la presencia de proteínas y orgánulos específicos. Sin embargo, los resultados ambiguos pueden derivar de la variación esperada en la eficiencia de la tinción. Por ejemplo, anti-vasa manchado al menos una gónadaen el 73,2% de todas las larvas examinadas (n = 781), mientras que anti-Elav manchado cerebro en el 86% de las larvas (n = 115). Además, se observa que la eficiencia de la tinción es más o menos inversamente proporcional a la etapa de desarrollo. En los embriones en etapa tardía, anti-vasa manchada 89,8% de las gónadas (n = 206), mientras que la tinción estuvo presente en sólo el 59,8% y el 46,9% de las larvas en L2 y mediados de L3, respectivamente (n = 132 y 49). Además, los resultados de sonicación en la pérdida de muestra. Cuando se contó el número de embriones y larvas presente en una muestra de volumen óptimo de sonicación antes y después de la sonicación, un promedio de 41,0% de la muestra se determinó inadecuados para el análisis (n = 1165). Para maximizar la eficiencia de la tinción, los protocolos deben ser optimizados para los anticuerpos específicos mediante la alteración de las concentraciones de anticuerpos publicados o de los tiempos de incubación de anticuerpos.
Figura 1.. mmunostain de gónadas Drosophila in situ (AD) Imágenes de testículos en situ en embriones en etapa tardía (etapa 17 / early-L1) hasta principios / mediados de larvas L3 inmunotiñó con anti-Vasa (AD, rojo; A'-D ' solo) para detectar las células germinales, anti-Fasicilin III (III) y Fas anti-1B1 (AD, verde; A '' - D '' solo) para detectar las células de cubo y fusomes respectivamente, y DAPI (AD, azul; A ' '' D '' 'solo) para detectar los núcleos. (A) Etapa 17 / principios de testículo L1 muestra el hub recién fusionado y fusomes esféricas en las células germinales indiferenciadas. (B) Early / mid-L1 testículo muestra fusomes esféricas en GSCs localizadas cerca del centro y de alguna posterior células germinales alargadas fusomes indicativos de diferenciación temprana espermatogonias. (C) Temprano / mid-L2 y
Figura 2. Inmunotinción de los tejidos neuronales de Drosophila in situ. Larvas Early / mid-L3 immunostained con anti-Elav (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo proporciona un método para dirigir con éxito inmunotinción Drosophila embrionario y en los tejidos de las larvas in situ, eliminando así la necesidad de disección. Según los protocolos anteriores para la tinción de embriones tempranos 1,2,3, la membrana coriónica se elimina usando 50% de lejía (NaOCl). Las muestras se fijaron en formaldehído y metanol. Debido a la cutícula de las larvas causa de muestra mayores a flotar, toda la muestra se hace pasar luego a través de un colador de células para asegurar la retención de las larvas. Muestra se almacena, si se desea, en metanol de grado químico. Después de la rehidratación, un proceso de sonicación adecuadamente implementado altera la integridad de la cutícula de las larvas. Esto es crítico después de la formación de la cutícula para permitir la permeación suficiente de anticuerpos necesarios para la inmunotinción. Antes de aplicar los anticuerpos, balanceo de la muestra en un suero normal de 5% / solución BBTw evita la unión no específica de anticuerpos excesiva. Los anticuerpos primarios se añaden entonces a detectar proteínas específicas expressed en el tejido diana. Después de lavar para eliminar los anticuerpos primarios no consolidados, anticuerpos secundarios unidos a fluoróforos se utilizan para marcar la ubicación de los anticuerpos primarios consolidados. El análisis puede entonces llevarse a cabo con epifluorescencia o microscopía confocal.
Algunas modificaciones pueden ser necesarias para optimizar los resultados en las circunstancias individuales. En particular, la potencia de sonicación y el número de sonicaciones realizadas pueden requerir un ajuste en función del sonicador usado. Adaptaciones a la altura de la sonda de ultrasonidos encima de la muestra, así como al volumen de solución también pueden ser necesarios para diferentes sonicadores suficiente o si la muestra no se puede obtener. Aumento de la turbidez solución se puede utilizar como un indicador de la lisis del tejido y, por lo tanto, proporciona un indicador para cuando sonicación es demasiado grave. Si la solución se vuelve alta turbidez, el experimentador debe considerar reducir el número de sonicaciones realizadas, aumentar el volumen de la solución, el aumento de la altura de la sonicatosonda r encima de la muestra, y / o reduciendo la potencia de ultrasonidos.
Las alteraciones también puede ser necesaria en el protocolo de inmunotinción para mejorar la calidad de imagen. Como con la mayoría de los procedimientos de inmunotinción la relación señal a ruido puede ser alterado mediante la modificación de dilución de anticuerpo, tiempo y temperatura de incubación del anticuerpo con la muestra, y / o el bloqueo de los reactivos utilizados. Mientras que cada anticuerpo debe ser considerado de forma independiente, especialmente con respecto a la dilución de anticuerpo, nos encontramos con que la incubación a 4 ° C durante períodos de tiempo más largos puede mejorar la calidad de la tinción después de la sonicación, especialmente para los anticuerpos con baja relación señal-ruido y cuando las larvas más viejas se examinan. En estos casos, la calidad de la tinción también se puede beneficiar de una ligera reducción de dilución de anticuerpo secundario. En este protocolo, incluimos tanto BSA y suero como reactivos de bloqueo, y la muestra se vuelve a bloqueó antes de la adición de anticuerpos secundarios con el fin de aumentar la calidad de la tinción. Dependiendo utilizan los anticuerposd, re-bloqueo y la inclusión de los dos reactivos de bloqueo pueden ser o puede no ser necesaria para mejorar las manchas. Si se omite el paso de re-bloqueo, lavados más largos y más aclarados pueden producir imágenes más nítidas. Por último, los anticuerpos policlonales pre-absorbentes pueden aumentar la relación señal a ruido. Pre-absorción se realiza incubando el anticuerpo deseado con embriones o larvas antes de su uso en una inmunotinción 1 rehidratadas.
Como se ha demostrado en nuestros resultados representativos, ultrasonidos permite la visualización clara de los tejidos diana in situ y por lo tanto ofrece una alternativa razonable a la disección de tejidos en los protocolos de inmunotinción. La disección puede ser engorroso en embriones de Drosophila y larvas debido a dificultades para localizar, aislar y extraer tejidos diana en buen estado. Alternativamente sonicación permite tejidos permanezcan en el contexto de todo el organismo. Debido ultrasonidos evita extracción y tejidos de montaje entre un portaobjetos y un sli cubiertap, conserva con más precisión en la morfología situ. Prácticamente, grandes cantidades de muestra se pueden procesar más rápidamente para el análisis futuro, ya que muchos organismos pueden ser sonicaron simultáneamente.
Aunque ultrasonidos ofrece una gran alternativa a la disección, tiene limitaciones que deben ser consideradas. La sonicación perturba beneficiosamente la integridad de la cutícula de las larvas, pero destruye alguna muestra en el proceso (ver resultados representativos). El enjuague para eliminar los residuos biológicos se requiere después del proceso de sonicación, que puede reducir aún más el tamaño de la muestra. Además, la inmunotinción embriones enteros y larvas deja el tejido de interés integrado en los tejidos circundantes. Estos tejidos circundantes pueden manchar positiva o mostrar la unión de anticuerpos no específicos, lo que reduce la calidad de la imagen final. Por último, manchando la eficiencia puede ser variable. Esta variabilidad puede depender de la edad de la muestra, la eficacia sonicación, y la especificidad del anticuerpo. Como resultado, sonicación-bainmunotinción sed de tejido todo el montaje puede que no sea siempre preferible. En particular, la inmunotinción basado disección puede ser más eficiente en el estudio de grandes tejidos a finales L3-larvas. Por otra parte, la sonicación puede esquilar temprana y etapa media embriones. A pesar de estas limitaciones, la inmunotinción a base de sonicación es una técnica altamente eficiente que es muy adecuado para analizar el desarrollo de una variedad de tejidos en embriones en etapa tardía hasta principios / mediados de larvas L3. En nuestro laboratorio, se utiliza regularmente este protocolo para estudiar la morfogénesis de las gónadas en embriones de Drosophila y 9,10 larvas. Además, anticipamos que la aplicación de este protocolo será igualmente fructífera en el estudio del desarrollo de otros tejidos en Drosophila y en otros organismos con una cutícula protectora.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Ruth Lehman y Dorthea Godt que suministró amablemente anticuerpos Vasa y Tráfico Jam. Nos gustaría reconocer el Stock Center de la Universidad Bloomington de Indiana para el mantenimiento de las reservas previstas y el hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco elaboradas bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa. Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Wawersik por sus consejos y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Programa de Becarios Monroe Grant (a AF y LB) y NSF conceder IOS0823151 (a MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
