Abstract
Les études réalisées chez Drosophila melanogaster embryons et des larves donnent un aperçu essentiel dans les processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et l'organogenèse. Immunomarquage permet la visualisation de tissus et organes en développement. Cependant, une cuticule protectrice qui se forme à la fin de l'embryogenèse empêche la pénétration des anticorps dans des embryons à un stade avancé et des larves. Bien que la dissection avant immunomarquage est régulièrement utilisé pour analyser les tissus des larves de drosophile, il s'avère inefficace pour certaines analyses parce que les petits tissus peuvent être difficiles à localiser et isoler. Le traitement par ultrasons offre une alternative à la dissection dans les protocoles de larves de drosophile immunomarquage. Il permet d'obtenir rapidement un traitement simultané d'un grand nombre d'embryons à un stade avancé et des larves et maintient la morphologie situ. Après fixation dans le formol, un échantillon est soumis à une sonication. L'échantillon est ensuite soumis à une coloration immunologique spécifique de l'antigène avec ant primaireet ibodies Anticorps secondaires marqués par fluorescence pour visualiser types de cellules cibles spécifiques et des protéines par microscopie de fluorescence. Au cours du processus de sonication, une mise en place correcte de la sonde de sonication ci-dessus de l'échantillon, ainsi que la durée et l'intensité de la sonification, est critique. Modifications mineures supplementaires aux protocoles d'immunomarquage standard peuvent être nécessaires pour les taches de haute qualité. Pour les anticorps ayant un faible rapport signal à bruit, de plus longs temps d'incubation sont typiquement nécessaires. Comme une preuve de concept pour ce protocole de traitement par ultrasons facilitée, nous montrons immunomarquages de trois types de tissus (testicules, ovaires, et des tissus neuronaux) à une série de stades de développement.
Introduction
Embryons de drosophile et les larves fournissent un excellent modèle pour étudier les processus de développement dans de nombreux organes et tissus. L'imagerie de cellules individuelles est souvent nécessaire dans ces études afin de déterminer les milieux complexes dans lesquelles les cellules se développent. La visualisation des cellules dans les tissus peut être réalisée par coloration immunologique. Bien décrits immunomarquage protocoles existent pour les tissus embryonnaires de drosophile <17 h après la ponte (AEL) 1-3. Cependant, une protection formes de la cuticule vers la fin de l'embryogenèse, empêchant la pénétration d'anticorps efficace. Ainsi, ces protocoles immunocoloration sont inefficaces dans l'analyse des tissus d'embryons à un stade avancé et dans les étapes ultérieures du développement larvaire (1er stade (L1), 2 ème stade (L2), et 3 e stade (L3)). Cette inefficacité impose un obstacle à notre compréhension des processus dynamiques qui se produisent pendant cette période de développement prolongée 4. Tissue dissection est une technique largement utilisée pour contourner cette barrière 5-7. Cependant, la dissection peut se révéler inefficace. L'extraction peut être encombré par la difficulté à trouver ou à isoler l'embryon et les tissus des larves. En outre, l'élimination physique des tissus cibles peut causer des dommages par les rompre ou en omettant de les extraire dans leur intégralité.
La sonication est une méthode qui utilise des ondes sonores pour perturber les interactions intermoléculaires. Elle a été utilisée pour perturber l'intégrité de la cuticule des larves de Drosophila immunocoloration pour développer des types cellulaires neuronaux 6. Ce protocole a été adapté pour immunocoloration embryonnaire à un stade avancé et les gonades des larves, qui peuvent être aussi petites que 50 microns de diamètre 8-10. Grâce à ces études, le processus de cellules souches de la lignée germinale (CGC) formation masculine de niche a été caractérisé à un stade avancé embryons de drosophile 8-10 et les mécanismes régulant le développement des cellules souches et difdifféren- à un stade avancé gonades embryonnaires et les larves ont été élucidée 9-12. Ainsi, la sonication fournit une alternative efficace à la dissection de tissu qui peut être difficile en raison de la taille des tissus. En outre, il permet l'immunomarquage des tissus de Drosophila in situ, ce qui laisse les cellules dans le cadre de l'ensemble de l'organisme et le maintien de la morphologie in situ. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la fluorescence immunomarquage de l'embryon à un stade avancé grâce à début / mi-L3 tissus in situ. Analyse de la drosophile gonadique et le tissu nerveux est représenté dans les résultats représentatifs pour démontrer l'efficacité de ce protocole. De plus, ce protocole d'immunocoloration peut être adapté pour analyser d'autres tissus de Drosophila ainsi que des tissus chez d'autres organismes par une cuticule externe.
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Protocol
1: Préparation d'une cage de collecte
- Anesthésier les jeunes, les mouches fertiles avec du CO 2. Transfert mouches anesthésiés dans une cage. Pour obtenir un rendement optimal, utilisez 100-120 mouches adultes allant de 2-7 jours d'âge à un ratio de 4: 1 femmes-hommes. Laisser vol une période d'acclimatation appropriée, ~ 24 heures avant d'obtenir l'échantillon pour la fixation. Si la cage a été mis en place avec des femelles vierges accouplées à des mâles, une utilisation de 36 - période d'acclimatation de 48 h.
- Sur l'extrémité ouverte de la cage, placer une plaque de gélose de jus de pommes préalablement préparée avec une goutte de taille dime de la pâte de levure dans le centre au-dessus de l'ouverture de la cage. Ensuite, fixez avec du ruban adhésif. Sceller la jonction entre la plaque de gélose de jus de pomme et la cage avec du parafilm.
- Placer la cage dans un récipient secondaire avec le jus de pomme plaque de gélose en tant que base et permettent de reproduire les mouches à une température définie pendant une période appropriée de temps tel que déterminé par l'expérience.
Remarque: Les temps de prélèvement d'échantillons will varier. Par exemple, lors de la collecte des embryons à un stade avancé / larves L1 précoce (17 - 24 h), permettre à mouches pondent leurs œufs sur des plaques de gélose de jus de pomme pendant 7 heures à 25 ° C avant le vieillissement de l'échantillon pendant 17 heures à 25 ° C. De même, pour une collection de mi-fin du premier stade larvaire (36-48 h) permettent mouches pondent des œufs pendant 12 heures à 25 ° C avant le vieillissement de l'échantillon pendant 36 heures à 25 ° C. - Une fois la période terminée, appuyez sur la cage sur une table afin que les mouches tombent loin de la plaque de gélose de jus de pomme sans anesthésie. Remplacer rapidement la plaque utilisée par une nouvelle contenant une goutte de pâte de levure. Fixez la nouvelle plaque avec du ruban adhésif et du parafilm et stocker la cage avec du jus de pomme plaque de gélose comme base.
- Retirez délicatement la chute de la levure de la plaque utilisée avec une spatule métallique. Placer le couvercle sur la plaque utilisée pomme de jus et permettent mis embryons à l'âge si nécessaire expérimentalement.
Remarque: Si le vieillissement des échantillons, des plaques peuvent être conservés à 25 ° C, sauf si des températures plus élevées sont experimentally requis. Des exemples de la façon d'embryons pour la collecte sont décrites ci-dessus l'âge (voir la note pour l'étape 1.3). Retrait de la pâte de levure avant vieillissement échantillon est effectuée à empêcher les larves de ramper dans la levure et de briser l'agar-dessous. L'agar de jus de pomme et pâte de levure résidu restant à fournir des nutriments pour la croissance des larves. Lorsque des embryons fixés directement à la pâte de levure sont perdus à travers le retrait de la pâte de levure, cette perte est préférable de levure et de la gélose résidu de l'échantillon qui peut réduire l'efficacité de coloration. Faut-il choisir de ne pas retirer la pâte de levure, levure peut être liquéfié avec un tampon phosphate de Triton X-100 (PbTx), mélangé avec un pinceau, puis retiré de l'échantillon avec un tamis cellulaire avant la fixation.
2 Fixation
- Une fois les embryons fixés sur la plaque de gélose jus de pomme ont vieilli au point de temps souhaité, utiliser un petit pinceau humidifié avec un tampon phosphate de Triton X-100 (PbTx) solution pour éliminer soigneusement échantillon de eplaque de e.
Remarque: Les larves plus âgées sont mobiles et peuvent ramper sur l'intérieur du couvercle. Cet échantillon peut être prélevé de façon similaire par élimination avec un pinceau. - Essuyer le pinceau de l'échantillon chargé contre l'arête intérieure face d'un tamis cellulaire. Ensuite, rincer les parois de la crépine et le pinceau avec un vaporisateur contenant une solution PbTx. Placez un couvercle de boîte de Pétri sous le filtre pour capturer la solution PbTx.
- Après tout l'échantillon a été transféré à la passoire, verser suffisamment PbTx dans la crépine d'augmenter l'échantillon de la maille. Ensuite, soulevez le filtre et verser le contenu de la boîte de Pétri dans un conteneur de déchets liquides.
- Répétez l'étape 2.3 de trois fois pour éliminer les levures et volent déchets qui peuvent avoir été transférés avec l'échantillon.
- Verser suffisamment d'eau de Javel à 50% (NaOCl) / eau (le trou DDH 2 O) solution dans le filtre à élever les larves au large de la maille. Laisser les larves de s'asseoir dans une solution pendant 5 min. Ensuite, soulevez le filtre et versez til contenu de la boîte de Pétri dans un récipient à déchets.
Remarque: Bleach est nécessaire uniquement dans les échantillons embryonnaires âgés de 0 à 22 heures afin de retirer la membrane chorionique. L'application d'eau de javel à des échantillons plus âgés peut être omis, mais son inclusion n'est pas préjudiciable. Si omission est souhaitée, remplacer l'eau de Javel dans cette étape avec PbTx. L'eau de Javel diluée doit être utilisée dans les 24 heures de préparation de la solution. - Laver l'échantillon dans la passoire avec PbTx en versant assez PbTx dans la passoire pour recueillir l'échantillon large de la maille. Laisser l'échantillon reposer dans la solution pendant 3 min. Ensuite, soulevez le filtre et verser le contenu de la boîte de Pétri dans un conteneur de déchets liquides.
- Répétez l'étape 2.6 cinq fois.
- Tamponner le fond de la crépine de la cellule sèche, puis transférer l'échantillon dans un flacon à scintillation contenant 1,75 ml de solution à l'aide d'un pinceau PEMS.
- Travailler dans une hotte ventilée, ajouter 250 ul de formaldehyde à 37% et 8 ml d'heptane de qualité réactif dans le flacon de scintillation.
- Amener le flacon à agiter à 200 tours par minute ou une vitesse modérée similaire pour 20 min.
- Ajouter 10 ml de methanol à scintillation fiole sans enlever la phase aqueuse précédente et permettre à la fiole à secouer vigoureusement à 500 rpm pendant 1 min.
Remarque: Le méthanol est dangereux. Continuer à travailler dans une hotte ventilée et porter des gants appropriés. - Retirer le flacon de secoueur et immédiatement verser le contenu dans un tamis cellulaire sur un récipient à déchets dans la hotte. Ajouter méthanol supplémentaire pour le flacon et courir à travers la crépine si nécessaire cellulaire pour s'assurer que tout échantillon a été supprimé.
Remarque: filtres cellulaires peuvent s'écouler lentement. Pour y remédier, un toucher de tissu de laboratoire à la partie inférieure de la crépine de la cellule afin d'aspirer la solution à travers le filtre plus rapidement. Le méthanol, le formaldéhyde, l'heptane et doit êtreentreposés dans des contenants de déchets appropriés jusqu'à ce que l'élimination appropriée conformément aux directives institutionnelles. - Fond sec de filtre cellulaire en utilisant un tissu de laboratoire, puis utilisez un pinceau pour transférer l'échantillon capturé dans la passoire à un tube de 1,5 ml contenant 0,5 ml de méthanol.
Remarque: Si plusieurs flacons de scintillation sont en cours d'utilisation, suivez les étapes 2.12 et 2.13 un flacon à la fois pour éviter échantillon de séchage sur tamis cellulaires. - Une fois que l'échantillon a été ajouté au tube à centrifuger, éliminer le methanol avec une pipette. Assurer échantillon a déposé au fond du tube.
- Rincer l'échantillon dans le tube à centrifuger en ajoutant environ 0,5 ml de methanol à tube. Attendez échantillon à régler puis retirez du méthanol avec une pipette.
- Répétez l'étape 15 trois fois.
- Ajouter 0,5 ml de methanol pour le tube, et ensuite stocker dans un congélateur à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
3. réhydratation et Préparation de l'échantillon pour Immunocoloration
- Retirer le methanol du microtube avec une pipette, en laissant l'échantillon dans le tube. Magasin méthanol déchets dans le conteneur de déchets approprié jusqu'à ce que le temps de mise au rebut.
Remarque: Pour améliorer l'efficacité du traitement par ultrasons, n'utilisent pas plus de 3 mm de l'échantillon sont installés au fond du tube de 1,5 ml. L'excès de l'échantillon peut être transféré dans un tube séparé avec une pipette avant de commencer l'étape de réhydratation ci-dessus. Coupe de la pointe de pipette avec une lame de rasoir stérile peut être utilisé pour éviter le colmatage de la pointe de pipette. - Ajouter 1,0 ml d'un mélange méthanol / tampon phosphate Tween (PBTw) solution à 50% dans le tube et le rock pendant 3 min.
- Enlever la solution de méthanol dans le conteneur des déchets et rincer avec 1,0 pi de PBTw deux fois. Après chaque rinçage, laisser l'échantillon se déposer avant le soutirage PBTw avec une pipette.
- Ajouter 1,0 ml de sérum-albumine bovine / tampon phosphate Tween (BBTw) mélanger le flacon et le rock. Après 3 min sur une bascule, permettre à la sample pour régler et retirer le BBTw avec pipette.
- Répétez l'étape 3.4 deux fois en prenant soin d'enlever autant que possible BBTw sans perdre échantillon après le dernier lavage.
- Ajouter 0,5 ml de BBTw au tube et placer le tube sur de la glace.
4 La sonication de l'échantillon
- Réglez le dispositif de traitement ultrasonique à 10% d'amplitude maximale et désigner un temps de fonctionnement de 2 sec sonication constante.
Remarque: Ces paramètres sont spécifiques à l'appareil à ultrasons indiqué dans les matériaux et les ustensiles de table et peuvent nécessiter l'optimisation pour différentes sonicateurs. - Avant de sonication de l'échantillon, nettoyer la sonde de sonication en plaçant la pointe de la sonde dans un tube conique de 50 ml remplie de déminéralisée sonique eau et course à nettoyer la sonde. Sonde de sonication à sec avec un tissu de laboratoire après course.
- Plonger la sonde dans le tube à centrifuger contenant l'échantillon afin qu'il soit positionné environ 3 à 4 mm au-dessus de l'échantillon et commencer à ultrasons.
- Retirez le mTube icrocentrifuge et le placer sur de la glace pendant au moins 30 secondes pour dissiper la chaleur à partir de sonication et permettre à l'échantillon se déposent au fond du tube à centrifuger.
- Répétez les étapes 4.3 et 4.4 selon les besoins en fonction de l'âge de l'échantillon en cours de traitement.
Remarque: Pour un volume d'échantillon de sonication optimale, les embryons de moins de 17 heures ne nécessitent pas de traitement par ultrasons, mais celles entre 17 et 24 heures (stade 17 / début-L1) nécessitent deux sonications. Les larves entre 24 à 36 (début / mi-L1), 36-48 (mi / fin-L1), 48 - 60 (début / mi-L2) 60 - 72 (mi / fin-L2), 72-84 ( début-L3), 84-96 (début / mi-L3), 96-108 (mi / fin-L3) h nécessitent 5, 9, 11, 13, 15, 18, et 22 sonications respectivement. Voir discussion pour de plus amples précisions sur les temps de sonication. - Rincer BBTw deux fois avec 1,0 ml. Après chaque rinçage laisser l'échantillon à régler avant de tirer hors BBTw avec une pipette.
- Ajouter 1,0 ml de BBTw dans le flacon et le rock. Après 3 min sur la bascule, laisser l'échantillon se régler et retirer le BBTw avec pipette. </ Li>
- Répétez l'étape 4.7 deux fois.
5. Immunocoloration
- Bloquer échantillon par addition de 5% de sérum dilué dans BBTw normale au tube à centrifuger. Retirer le bloc après bascule pendant 1 heure.
Remarque: Utilisez un sérum normal de l'espèce dans laquelle les anticorps secondaires sont générés. - Diluer anticorps primaires de s'approprier la concentration de travail dans 5% solution normale de sérum / BBTw.
- Roche échantillon en solution d'anticorps primaire O / N à 4 ° C ou pendant au moins 3 heures à température ambiante (22 ° C environ.
Remarque: Les durées et les températures d'incubation d'anticorps peuvent varier. O / N incubation à 4 ° C et 3 heures à température ambiante est généralement suffisante. Cependant, une période d'incubation de deux jours, peut améliorer la qualité de la teinture, en particulier avec des échantillons plus âgés ou lorsque des anticorps primaires de faible affinité sont utilisés. Incubations plus longues sont généralement effectuées à 4 ° C. Des considérations similaires doivent être prises lors de l'utilisation des anticorps secondaires (voir 5.10). - Laisser l'échantillon de s'installer àfond du tube de centrifugeuse. Prélever des anticorps primaires avec pipette. Enregistrer anticorps pour la réutilisation, si désiré.
- Rincer deux fois avec 1,0 ml de BBTw. Après chaque rinçage permet échantillon de régler avant de tirer hors BBTw avec une pipette.
- Ajouter 1,0 ml de BBTw dans le flacon et le rock. Après 3 min sur la bascule, permet échantillon de régler et retirer BBTw avec pipette.
- Répétez l'étape 5.6 cinq fois.
- Bloc échantillon par addition d'une solution à 5% / BBTw de sérum normal de la microtube. Retirer le bloc après bascule pour 30 min à 1 h.
Remarque: Cette étape de blocage supplémentaire n'est pas nécessaire, mais peut améliorer la qualité de la coloration d'anticorps spécifiques. - Diluer anticorps secondaires de s'approprier la concentration de travail dans 5% solution normale de sérum / BBTw.
- Enveloppez microtube dans une feuille d'aluminium pour réduire la décoloration due à l'exposition de la lumière. Roche échantillon dans une solution d'anticorps secondaire pendant 12 à 48 heures à 4 ° C ou pendant au moins 3 heures à température ambiante (environ 22 ° C.
- Laisser l'échantillon à déposer au fond du tube de centrifugeuse. Prélever Anticorps secondaires à la pipette.
- Rincer deux fois avec 1,0 ml de PBTw. Après chaque rinçage permet échantillon de régler avant de tirer au large de la PBTw avec une pipette.
- Ajouter 1,0 ml de PBTw dans le flacon et le rock. Après 5 min sur la bascule, laisser l'échantillon se régler et retirer le PBTw avec pipette.
- Répétez l'étape 5.13 trois fois.
- OPTION: Ajouter DAPI dilué 1: 1000 dans PBTw. échantillon de roche enveloppé dans une feuille d'aluminium pendant 3 min; puis retirez solution DAPI avec une pipette. Rincer cinq fois avec 1,0 ml de PBTw, permettant échantillon de régler avant de retirer PBTw avec pipette.
- Ajouter 80 - 100 ul de 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) solution pour microtube et conserver à -20 ° C.
Note: Un autre agent anti-décoloration à base de glycérol peut être remplacé par.
Analyse 6.
- Avant de montage d'échantillons sur des lames, ajouter un supplémentaire 5 - 10 pi de DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade solution pour microtube.
Remarque: l'échantillon peut être ajouté à des diapositives sans dissection. ajouter le volume à une lame de l'échantillon varie avec la taille de housse. Lorsque pipetage échantillon sur la glissière, la pointe de la pipette peut être coupé avec une lame de rasoir pour éviter échantillon cisaillement. Il est souvent utile d'aligner l'échantillon en rangées pour faciliter l'analyse. L'ajout de PPD en tant qu'agent de antifade supplémentaire ne peut être tenu, mais peut empêcher photoblanchiment si les échantillons sont stockés à long terme. - Placez délicatement couvercle en verre glissement sur échantillon. Ensuite, lamelle fixer en place à l'aide de vernis à ongles.
- Voir monté échantillon en utilisant la microscopie de fluorescence.
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Representative Results
Pour démontrer l'efficacité de l'immunomarquage base ultrasons dans l'analyse de l'embryon à un stade avancé et les tissus des larves in situ, les embryons de type sauvage et des larves ont été traitées pour immunomarquage des testicules, des ovaires, et le tissu neural. Les échantillons ont été imagées par microscopie à foyer commun et les résultats représentatifs sont présentés (figure 1 et figure 2). Les résultats montrent que le protocole décrit est efficace pour la visualisation des caractéristiques morphologiques ainsi que les cellules individuelles in situ au cours des stades tardifs-embryonnaire jusqu'au début / mi-L3 développement de la drosophile.
Résultats de testicule immunomarquage:
le développement testiculaire est particulièrement bon système pour illustrer protocole efficacité depuis testicules maturation est dynamique au cours du développement larvaire. Testicules adultes Drosophila forment un tube enroulé avec une extrémité aveugle, où la cellule souche germinale (CGC) niche se trouve (voir 13,14 pour avis). Dans ce créneau, les CSS sont disposés autour d'un groupe serré de cellules somatiques non-mitotiques appelé le moyeu. CSS subissent la division asymétrique pour produire un SGC qui reste ancré au moyeu et une fille gonialblast qui se déplace loin de la niche de cellules souches. Comme le gonialblast divise incomplètement, extensions cytoplasmiques appelés fusomes forme, reliant les cellules dans le spermatogonies. Après 4 divisions successives, la spermatogonium initie la méiose pour former le sperme.
formation testiculaire commence avec l'association des cellules germinales primordiales (PGC) et somatiques des cellules précurseurs gonadiques (SGPS) de cours de l'embryogenèse (voir 15,16 pour avis). Cette association se traduit par la formation d'un créneau CGC fonctionnel à la fin de l'embryogenèse 8-10. À la mi-L1, les divisions de la CGC asymétriques dans la niche de la CGC donnent lieu à différencier les spermatogonies avec fusomes ramifiés 9. Division asymétrique CGC poursuit tout au long des larvesdéveloppement, d'où la production de spermatogonies supplémentaire et une augmentation progressive de la taille des gonades. Des images représentatives de fin testicules / mi-L1, L2 et L3 embryonnaires et au début, immunocolorées pour les cellules germinales, des cellules de moyeu, et fusomes, sont présentés (figure 1A-D). Ces images montrent les changements dynamiques de la taille des gonades et la différenciation des cellules germinales observés dans les testicules dans le temps.
Les résultats d'immunomarquage Ovaire:
Ovaires adultes de Drosophila sont composées de 16-20 unités de production d'œufs individuels appelés ovarioles (voir 17,18 pour avis). À une extrémité de chaque ovariole, une structure appelée la germarium contient un créneau de cellules souches. La niche ovariole est composé de CSS indifférenciées et deux populations de cellules somatiques: cellules de la coiffe et des cellules de filaments terminaux (TFS). Similaire au testicule, CSS subissent la division asymétrique pour produire un SGC qui reste à côté des cellules de la coiffe et une cellule différenciation de fille, Appelé cystoblast, qui est poussé loin de la niche. Le cystoblast subit ensuite 4 cycles de division cellulaire pour former un kyste de la lignée germinale, reliés entre eux par un fusome ramifiée. Chaque lignée germinale-kyste est alors entouré par les cellules du follicule pour produire une chambre d'oeuf qui continue de se développer en se déplaçant sur toute la longueur de la ovariole.
Comme les testicules, les ovaires sont d'abord formés au cours de l'embryogenèse 16,18. Ovarioles multiples proviennent d'une seule gonade embryonnaire composée de PGC et SGP. À la mi-L3, SGP donnent lieu à des précurseurs de TF à la partie antérieure de l'ovaire, tandis que les cellules germinales localisent à la partie postérieure de l'ovaire et de s'associer avec des cellules entremêlées SGP-dérivés (CI) 19-22. En fin de L3, les cellules TF se différencient et s'organisent en les piles trouvés dans la niche de cellules souches adultes, CSS et cellules de la coiffe sont établis, et la différenciation des cellules germinales kyste est observée 19,20,23. Des images représentatives de l'embryon à un stade avancé et / ovaires début mi-L3, immunostal'Ined pour les cellules germinales, SGP, les circuits intégrés, les précurseurs de TF et fusomes, sont représentées (figure 1E, F). Ces images montrent une morphologie normale et la progression du développement de leur âge.
Résultats de Neural immunomarquage:
Le système nerveux central chez la drosophile (CNS) est dérivé de cellules souches neurales, appelés neuroblastes (NBS), qui découlent de neuro-épithélium embryonnaire (voir 24,25 pour avis). NB dans des embryons et des larves fracture asymétrique pour produire des cellules ganglionnaires de la mère (GMC) qui, à son tour, générer des neurones et des cellules gliales dans le cerveau adulte et chaîne nerveuse ventrale. Parce NB larves donnent lieu à la majorité des neurones adultes et peuvent être distingués en fonction de leur position dans le cerveau, le cerveau larves sont devenues un modèle important pour étudier NB comportement et la différenciation neuronale.
Le cerveau L3 est composé de deux lobes et un cordon nerveux ventral situé au centre 24.Des images représentatives de cerveaux mi-L3 immunocolorées pour notifiés, CMG neurones indifférenciés, les neurones immatures et primaires et les cellules gliales sont présentés (figure 2A-C) 26-30. Ces images montrent une forte coloration dans les profils d'expression distincts dans les lobes du cerveau et la corde nerveuse ventrale. Selon le sens de montage, l'imagerie permet la visualisation du tissu cérébral à partir de la surface dorsale (figure 2A), la surface ventrale (figure 2B), ou en coupe sagittale (figure 2C).
Efficacité coloration:
Nos résultats démontrent que représentatifs d'une procédure de coloration immunologique basé ultrasons-est polyvalent. Non seulement peut-il être utilisé pour identifier des types cellulaires spécifiques, mais aussi peut être utilisé pour indiquer la présence de protéines et des organites spécifiques. Cependant, des résultats ambigus peuvent provenir de la variation attendue de l'efficacité coloration. Par exemple, anti-vasa tachée au moins une gonadedans 73,2% des toutes les larves examinés (n = 781), tandis que les cerveaux anti-Elav teinté dans 86% des larves (n = 115). En outre, nous observons que la coloration efficacité est à peu près inversement proportionnelle au stade de développement. Chez les embryons à un stade avancé, anti-vasa taché 89,8% des gonades (n = 206), tandis que la coloration était présente dans seulement 59,8% et 46,9% des larves à L2 et la mi-L3, respectivement (n = 132 et 49). En outre, les résultats de sonication à la perte de l'échantillon. Lorsque le nombre d'embryons et les larves présentes dans un volume optimal de l'échantillon de sonication a été compté avant et après traitement aux ultrasons, une moyenne de 41,0% de l'échantillon a été déterminée par analyse inadapté (n = 1165). Afin de maximiser l'efficacité de coloration, les protocoles doivent être optimisés pour des anticorps spécifiques en modifiant la concentration d'anticorps publiés ou des temps d'incubation anticorps.
Figure 1 I. mmunostain des gonades de Drosophila in situ (CN) Les images de testicules in situ dans les embryons à un stade avancé (stade 17 / début-L1) jusqu'au début / larves mi-L3 immunocolorée anti-Vasa (AD, rouge; A'-D ' seul) pour détecter les cellules germinales, anti-Fasicilin III (Fas III) et anti-1B1 (AD, vert, A '' - D '«seul) pour détecter les cellules de moyeu et fusomes respectivement, et DAPI (AD, bleu, A' '' '' '-D seul) pour détecter les noyaux. (A) Etape 17 / début des testicules L1 montre le moyeu nouvellement fusionné et fusomes sphériques dans les cellules germinales indifférenciées. (B) début / mi-L1 testicule montre fusomes sphériques en CSS localisées à proximité du centre et dans certaines postérieure cellules germinales allongées fusomes indicatifs de début de la différenciation des spermatogonies. (C) début / mi-L2 et
Figure 2 immunomarquage des tissus neuronaux Drosophila in situ. Larves début / mi-L3 immunocolorées anti-Elav (
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Discussion
Ce protocole fournit un procédé pour cibler avec succès immunocoloration embryonnaire de Drosophila et tissus larvaires in situ, ce qui élimine la nécessité d'une dissection. Selon les protocoles antérieurs pour la coloration des embryons précoces 1,2,3, la membrane chorionique est éliminé en utilisant 50% de javel (NaOCl). Les échantillons sont fixés dans du formol et du méthanol. Parce que la cuticule des larves provoque échantillon âgé de flotter, la totalité de l'échantillon est ensuite passé à travers un tamis cellulaire pour assurer la rétention des larves. L'échantillon est stocké, si on le désire, dans le méthanol de qualité chimique. Après réhydratation, un processus de sonication correctement mis en œuvre perturbe l'intégrité de la cuticule des larves. Cela est essentiel après la formation de la cuticule pour permettre la pénétration suffisante d'anticorps nécessaires pour immunomarquage. Avant d'appliquer des anticorps, bascule l'échantillon dans un sérum normal de 5% / solution BBTw empêche la liaison d'anticorps non spécifique excessive. Les anticorps primaires sont ensuite ajoutés à détecter des protéines spécifiques expressed dans le tissu cible. Après lavage pour éliminer les anticorps primaires non liés, les anticorps secondaires liés à des fluorophores sont utilisés pour marquer l'emplacement des anticorps primaires liés. L'analyse peut alors être effectuée avec une épifluorescence ou microscopie confocale.
Certaines modifications peuvent être nécessaires pour optimiser les résultats dans des circonstances particulières. En particulier, la puissance de traitement aux ultrasons et le nombre de sonications effectuées peuvent nécessiter un ajustement en fonction de l'appareil à ultrasons utilisé. Adaptations à la hauteur de la sonde de sonication dessus de l'échantillon ainsi que le volume de solution peuvent également être nécessaires pour les différents sonicateurs ou si l'échantillon était suffisante ne peut être obtenue. L'augmentation de la turbidité de la solution peut être utilisée comme un indicateur de la lyse tissulaire et, par conséquent, fournit un indicateur lorsque la sonication est trop sévère. Si la solution turbidité devient élevée, l'expérimentateur devrait envisager de réduire le nombre de sonications effectuées, l'augmentation du volume de solution, augmentant la hauteur de la sonicatoSonde de r au-dessus de l'échantillon, et / ou réduit la puissance du dispositif de traitement ultrasonique.
Modifications peut également être nécessaire dans le protocole d 'immuno à améliorer la qualité de l'image. Comme avec la plupart des procédures d'immunocoloration le rapport signal sur bruit peut être modifiée par modification de la dilution d'anticorps, le temps et la température de l'incubation avec l'échantillon d'anticorps et / ou réactifs de blocage utilisés. Bien que chaque anticorps doit être considérée indépendamment, en particulier en ce qui concerne anticorps dilution, nous trouvons que l'incubation à 4 ° C pendant des périodes de temps plus longues peut améliorer la qualité coloration après traitement aux ultrasons, en particulier pour les anticorps à faible rapport signal sur bruit et quand les larves plus âgées sont examinés. Dans de tels cas, la qualité de la coloration peut également bénéficier d'une légère réduction de la dilution de l'anticorps secondaire. Dans ce protocole, nous incluons BSA et le sérum comme réactifs de blocage, et l'échantillon est de nouveau bloqué avant l'addition d'anticorps secondaires afin d'améliorer la qualité de coloration. Selon les anticorps utilisentd, re-blocage et l'inclusion des deux réactifs de blocage peuvent ou peuvent ne pas être nécessaires pour améliorer la coloration. Si l'étape de re-blocage est omis, plus les lavages et plusieurs rinçages peuvent produire des images plus nettes. Enfin, les anticorps polyclonaux de pré-absorbants peuvent augmenter le rapport signal sur bruit. Pré-absorption est effectué par incubation de l'anticorps désiré avec des embryons ou des larves avant l'utilisation dans un immunomarquage une réhydratées.
Comme démontré dans nos résultats représentatifs, ultrasons permet une visualisation claire des tissus cibles in situ et offre ainsi une alternative raisonnable à la dissection des tissus dans les protocoles d'immunomarquage. Dissection peut être lourd dans embryons de drosophile et les larves en raison de difficultés à localiser, isoler et extraire des tissus cibles en bon état. Alternativement sonication permet tissus de rester dans le cadre de l'ensemble de l'organisme. Parce ultrasons évite l'extraction et tissus de montage entre lame et un sli de couverturep, il conserve de façon plus précise la morphologie in situ. Pratiquement, de grandes quantités d'échantillon peuvent être traitées plus rapidement pour une analyse ultérieure, puisque de nombreux organismes peuvent être exposés à des ultrasons simultanément.
Bien ultrasons fournit une excellente alternative à la dissection, il a des limites qui doivent être considérés. Sonication perturbe bénéficiaire de l'intégrité de la cuticule larvaire mais détruit une partie échantillon dans le processus (voir résultats représentatifs). Le rinçage pour éliminer les débris biologique est nécessaire à la suite du processus de traitement par ultrasons, ce qui peut encore réduire la taille de l'échantillon. En outre, une coloration immunologique des embryons entiers et les larves quitte le tissu d'intérêt intégré dans les tissus environnants. Ces tissus environnants peuvent tacher positivement ou montrer la liaison d'anticorps non spécifique, réduisant ainsi la qualité de l'image finale. Enfin, l'efficacité de coloration peut être variable. Cette variabilité peut dépendre de l'âge de l'échantillon, la sonication efficacité et la spécificité des anticorps. En conséquence, la sonication-baimmunomarquage sed de l'ensemble du montage tissu peut pas toujours être préférable. En particulier, l'immunomarquage base dissection peut être plus efficace lors de l'étude de grands tissus en fin de L3 larves. En outre, la sonication peut tondre précoces et mi-étape embryons. Malgré ces limites, l'immunomarquage base ultrasons-est une technique très efficace qui est bien adapté pour l'analyse du développement d'une variété de tissus d'embryons à un stade avancé à début / mi-larves L3. Dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement ce protocole pour étudier la morphogenèse des gonades d'embryons de drosophile et les larves 9,10. En outre, nous prévoyons que la mise en œuvre de ce protocole se révélera tout aussi fructueuse dans l'étude du développement d'autres tissus chez la drosophile et chez d'autres organismes d'une cuticule protectrice.
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Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Ruth Lehman et Dorthea Godt qui a gracieusement fourni les anticorps Vasa et Embouteillage. Nous tenons à remercier le Stock Center Bloomington à l'Université d'Indiana pour maintenir les stocks prévus et le développement des études Hybridoma Banque élaborées sous les auspices de la NICHD et entretenus par l'Université de l'Iowa. Nous remercions tous les membres du laboratoire Wawersik pour leurs conseils et leur soutien. Ce travail a été financé par le Programme de subventions Monroe Scholars (AF et LB) et NSF accorder IOS0823151 (à MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
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