Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d'isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

Summary

La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, il est possible de visualiser des réseaux microvasculaires à la surface du poumon. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la perméabilité des microvaisseaux simples dans les poumons isolés en utilisant l'imagerie de fluorescence en temps réel.

Abstract

La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé est largement utilisé pour visualiser et définir la signalisation dans les microvaisseaux simples. Par couplage de cette préparation avec une imagerie en temps réel, il devient possible de déterminer les changements de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires individuels. Nous décrivons ici les étapes pour isoler les poumons de rats et de les perfuser avec du sang autologue. Ensuite, nous présentons des mesures pour insuffler fluorophores ou des agents via un micro-cathéter dans une petite région du poumon. L'utilisation de ces procédures décrites, nous avons déterminé perméabilité augmente chez le rat microvaisseaux pulmonaires en réponse aux perfusions de lipopolysaccharide bactérien. Les données ont révélé que le lipopolysaccharide augmenté fuite de fluide dans les deux segments de veinules et capillaires microvaisseaux. Ainsi, cette méthode permet de comparer les réponses de la perméabilité entre les segments vasculaires et ainsi, définir une hétérogénéité dans la réponse. Bien que les méthodes couramment utilisées pour définir la perméabilité pulmonaire post-traitement nécessitent des échantillons de tissus du poumon, leutilisation de l'imagerie en temps réel permet d'éviter que cette exigence évidente à partir de la présente méthode. Ainsi, la préparation du poumon isolé combinée avec l'imagerie en temps réel offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles pour déterminer microvasculaire pulmonaire perméabilité, mais est une méthode simple à développer et à mettre en œuvre.

Introduction

Augmentation de la perméabilité microvasculaire dans les poumons entraîne l'apparition d'un œdème alvéolaire et l'échange de gaz compromis et est une caractéristique majeure de lésion pulmonaire aiguë (ALI) ^1-3. Ainsi, les estimations de la perméabilité vasculaire sont importantes pour définir l'étendue des lésions pulmonaires et l'efficacité des interventions thérapeutiques proposées. Analyse gravimétrique comme le sang poumon libre rapport humide à sec et le coefficient de filtration microvasculaire sont largement utilisés méthodes pour estimer la perméabilité ^4,5. D'autres procédés comprennent la quantification de la rétention de sondes radioactives ou fluorescentes dans le tissu du poumon ^8.6. Cependant, les procédés ci-dessus nécessitent un traitement postexperiment d'échantillons de tissus pulmonaires vers l'élucidation des données de perméabilité. En outre, depuis un animal peut être utilisé pour un protocole de traitement unique, un grand nombre d'animaux peuvent être nécessaires pour une étude complète. Une caractéristique commune de ces méthodes est qu'elles déterminent la perméabilité vasculaire moyen pourtous les vaisseaux sanguins au sein de l'échantillon de tissu. Toutefois, il est bien établi que les micro-et macro-vaisseaux pulmonaires sont phénotypiquement différentes ^9. Par conséquent, les réponses de la perméabilité peuvent être hétérogènes entre les différents segments de vaisseaux ainsi ^9,10. Ainsi, la quantification de la perméabilité moyenne de tous les vaisseaux pulmonaires dans un échantillon de tissu peut ne pas refléter adéquatement cette hétérogénéité.

Dans la préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, les vaisseaux sanguins à la surface du poumon peuvent être visualisées par un microscope droit ^4,11,12. Cela permet réponses caractérisant dans les vaisseaux uniques et donc, aborder toute hétérogénéité dans les réponses ^13. En outre, en utilisant l'imagerie de fluorescence des microvaisseaux, à base de fluorescence analyses peuvent être incorporés. De plus, un micro-cathéter auriculaire gauche peut être utilisé pour délivrer des agents et des sondes de fluorescence dans les vaisseaux sanguins ^11,14. Microcathéter limite la livraison à une petite région du poumon, ainsi exposant seulement les vaisseaux sanguins dans la région des agents infusées et des fluorophores. Cela permet à plusieurs petites régions d'un même poumon à être utilisés pour des expériences séparées, conduisant à une réduction globale des animaux nécessaires pour une étude.

Imagerie en temps réel permet la capture de l'évolution dynamique vasculaire et fluorescence extravasculaire des microvaisseaux uniques de la préparation du poumon isolé. Ainsi, pour chaque microvaisseaux dans un champ d'image, les changements de fluorescence au cours de la perfusion de fluorophores et lessivage peuvent être enregistrées, et quantifiés en ligne ^14. L'utilisation de valeurs de fluorescence maximale et résiduelle vasculaire, un indice de perméabilité pour chaque microvaisseaux dans le domaine de formation d'image peut être déterminé. Pour déterminer les changements de perméabilité en réponse à des agents anti-inflammatoires ou dommageables, l'agent désiré peut être administré en premier, puis l'indice de perméabilité déterminée. En outre, le champ d'image peut être réglée à l'intérieur de la région des poumons infusée par l'microcathéter, ce qui permet un degré élevé de flexibilité dans le choix du réseau vasculaire souhaitée. Ainsi, la préparation du poumon isolé perfusé de sang en tandem avec une imagerie en temps réel fournit un modèle expérimental attrayant pour quantifier la perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires uniques.

Protocol

Toutes les expériences réalisées sur des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Tennessee Health Science Center.

1. Tubes pour les préparations de perfusion Rat poumon

1. Préparer un système de tuyauterie avec un tube Tygon (# 18) pour la perfusion de sang comme le montre la Figure 1. Raccorder les capteurs de pression (P23XL) et placer le tube sur la platine du microscope.
2. Régler la température du bain d'eau à 37 ° C.
3. Connectez l'entrée du poumon et de sortie temporairement Tygon.

Figure 1. Tubulure de perfusion artérielle. Le schéma montre la configuration du tube utilisé pour faire circuler le sang à travers la préparation du poumon isolé. Également indiqué sont des éléments associés à travers lequel le tube is en déroute. Un schéma du cœur et des poumons est inclus pour montrer les sites de liaison entre le tube et l'artère pulmonaire (AP), et auriculaire (LA) de la canule (pointillés bleus) a quitté.

2. Préparation de poumons de rat isolés

1. Anesthésier les rats (rats Sprague-Dawley, 250-300 g) avec de la kétamine (80-100 mg / kg) et avec la xylazine (5-10 mg / kg). Après s'être assuré d'un plan de l'anesthésie chirurgicale, placer l'animal dans une position couchée sur le dos.
2. Effectuer une trachéotomie, insérer une canule trachéale (PE-90) et le fixer avec suture chirurgicale.
3. Infuser héparine (100-200 U) dans le cœur par ponction cardiaque (21 G de l'aiguille de papillon), attendez 60 secondes et le sang exsanguinate (~ 12-15 ml de sang).
4. Préparer deux canules (Tygon, 3 mm de diamètre, 4 cm de long; évasées à une extrémité) et remplir avec une solution saline.
5. Effectuez une thoracotomie. Faire une incision (3 mm) sur le ventricule droit et faites glisser l'extrémité évasée d'une canule dans l'incision vers l'pulmonaireartère. Fixez la canule à l'artère pulmonaire avec des sutures chirurgicales.
6. Inciser (3 mm) de l'apex du ventricule gauche et faire glisser l'extrémité évasée de la deuxième canule dans l'incision. Guide de la canule dans l'oreillette gauche. Fixer une canule dans le ventricule gauche avec un ruban ombilical (2 mm de large).
7. Disséquer tout tissu conjonctif, et retirer le poumon et le cœur avec les canules attachés. Placez poumon et le cœur sur une boîte de Pétri. Repositionner le poumon de sorte que la surface diaphragmatique est sur le dessus. Les trois canules doivent faire face à la même direction.
8. Placer la préparation du poumon sur une scène qui peut être manipulé dans les directions XY. Un stade qui est livré avec un microscope peut être modifié pour tenir le tuyau ou un stade construit sur mesure, si nécessaire.

3. Perfusion sanguine des poumons de rats isolés

1. Mélanger le sang saigné avec un volume égal de l'albumine (5%) de la solution et d'ajouter au réservoir. Démarrer la pompe péristaltique et régler le débit rmangé à 14 ml / min. Laisser le sang pour remplir le tube.
2. Avec le shunt ouvert, retirez le poumon connecteur temporaire entrée-sortie. Fixer l'artère pulmonaire et l'oreillette gauche canule à l'entrée et à la sortie du poumon, respectivement. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le tube.
3. Raccorder la canule trachéale à un troisième transducteur de pression (P23XL). Gonfler les poumons avec 30% d'oxygène par l'intermédiaire de la canule trachéale et maintenir la pression à 5 cm H ₂ O.
4. Fermez le shunt avec une pince pour commencer la perfusion du poumon. Maintenir l'artère pulmonaire et les pressions auriculaires gauches à ~ 10 cm et 3 respectivement H ₂ O.

4. Préparation du poumon pour perfusion microvasculaire

1. Soulever l'extrémité arrière du tube de prolongement pour le cathéter au-dessus du niveau du poumon et sûr.
2. Préparer un cathéter de perfusion par l'insertion d'environ 30 cm d'un tube de PE10 40 cm de longueur dans un tube de PE90 ~ 30 cm de long. Connectez l'extrémité exposée du tube PE10 à une aiguille (30 G)attaché à une seringue (1 cc).
3. Insérer la combinaison de cathéter dans l'extrémité arrière relevée du tube d'extension. Guide de la combinaison de cathéter dans l'oreillette gauche et dans les poumons jusqu'à ce qu'il rencontre une résistance. Ensuite, appuyez sur le cathéter PE10 seul plus loin dans les poumons jusqu'à ce qu'il rencontre une résistance. Notez que l'application d'une force excessive lors de l'insertion du cathéter blesser le poumon.
4. Remplir la seringue de 1 ml avec une solution de Ringer et la joindre à une pompe à seringue. Réglez le débit de perfusion de 10 pi / min.
5. au site de perfusion deviendra pâle par rapport à reste du poumon.
6. Humidifiez le poumon avec une solution saline et couvrir le poumon d'une pellicule de plastique avec un trou assez grand pour quitter le site de perfusion découvert.
7. Tamponner un peu de graisse à robinet d'arrêt sur la partie inférieure d'un joint torique (sur mesure), et placer une lamelle couvre-objet en verre (# 1,5, 22 mm de diamètre) sur le fond du joint torique. Positionnez délicatement le joint torique avec la lamelle sur le site de perfusion. Fixez le joint torique avec un hol-éprouvette normeder. Le / combinaison joint torique lamelle ne fausse pas les structures alvéolaires en dessous, comme rapporté récemment ^15.
8. Positionner un objectif (20X) d'un microscope de fluorescence au-dessus du joint torique et de se concentrer à la surface du poumon.

5. Imagerie fluorescente Dextran transiter microvaisseaux

1. Préparer le microscope pour l'imagerie FITC floraison.
2. Sélectionnez une région à imager et acquérir des images à la vitesse de 1/minute l'aide du logiciel d'acquisition d'image.
3. Commencez perfusion de FITC-dextran 20 kDa (0,5 mg / ml) en utilisant la pompe à seringue. Fluorescence dans les vaisseaux sanguins va progressivement augmenter et atteindre un maximum. Continuer perfusion pendant 60 min.
4. Puis passer à la perfusion de Ringer à laver fluorescence luminale. Maintenir la perfusion pendant plus de 10 min. Continuer acquisition d'image à 1/min pendant le lavage-off.

6. Analyse de l'image

1. Ouvrez le fichier d'acquisition d'image.
2. La place des régionsd'intérêt sur les microvaisseaux dans le cadre de l'image.
3. Lire le fichier d'image, image par image et enregistrer l'intensité de fluorescence à chaque région d'intérêt pour tous les cadres.
4. Tracer le changement de l'intensité de fluorescence pour chaque région d'intérêt en fonction du temps.
5. Quantifier l'intensité de fluorescence maximale et l'intensité de fluorescence résiduelle après 10 min de lessivage.
6. Calculer le rapport entre un maximum de l'intensité de fluorescence résiduelle au niveau de chaque région d'intérêt pour obtenir l'indice de perméabilité de microvaisseaux associées à cette région d'intérêt.

Representative Results

Une préparation de poumon de sang perfusé isolé relié à la tubulure de perfusion et de l'équipement correspondant est représenté sur la figure 2. Des fins de démonstration, nous avons utilisé un rat Sprague Dawley, bien que les modes opératoires décrits ici peuvent être utilisés avec n'importe quelle espèce de rat. Infusions à travers un microcathéter auriculaire gauche atteignent seulement une petite région du poumon. La région infusé peut être identifié par la coloration induite par la perfusion (Figure 3). La préparation du poumon positionnée pour l'imagerie en temps réel est représenté sur la figure 4.

Figure 2. Isolé préparation du poumon sang perfusé. La photographie montre les poumons de rat isolés reliés à la tubulure de perfusion et perfusés avec du sang autologue. A noter que la surface du diaphragme du poumon fait face à la microscope objectif.

Figure 3. Région de perfusion de microcathéter. Un microcathether inséré via l'oreillette gauche a été utilisée pour perfuser une solution de Ringer dans la préparation du poumon. La photographie montre la région du poumon gauche (cercle) recevant la perfusion de Ringer. Comme la perfusion de Ringer déplace le sang perfusant à travers les vaisseaux, la région imprégnée pâle apparaît par rapport aux autres régions pulmonaires. A noter que la perfusion de Ringer est limitée à une petite région clairement démarquée du poumon.

Figure 4. Position de l'imagerie pour la préparation du poumon isolé. Le sho de photows une préparation du poumon isolé placé sous un microscope objectif prêts pour l'imagerie. A noter que la surface du poumon est recouverte d'une pellicule de plastique afin de maintenir la surface du poumon humide. Un joint torique maintient à l'horizontale de la surface des poumons au cours de l'imagerie.

Dans cette étude, nous avons déterminé les changements dans la perméabilité vasculaire en réponse aux traitements avec le lipopolysaccharide bactérien (LPS; sérotype 0111: B4), un modèle largement utilisé de ALI. À cette, nous avons infusé LPS (100 ng / ml) dans les microvaisseaux de 30 min suivie par le lavage de Ringer 60 min ^11. Ensuite, nous avons infusé FITC dextran 20 kDa de quantifier l'indice de perméabilité. Fluorescence FITC résiduelle était faible dans les microvaisseaux traités avec Ringer, mais grande chez ceux traités avec du LPS (figures 5A-D). En outre, par rapport à la perfusion de Ringer, la perfusion de LPS a provoqué une réduction significative de l'indice de perméabilité, ce qui suggère une augmentation globale de la perméabilité à tous les navires dans l'image field (figure 5E). L'indice de perméabilité quantifiés séparément pour les veinules et les capillaires suggéré que l'augmentation de la perméabilité induite par le LPS a été plus faible que dans les veinules dans les capillaires, mais la différence n'était pas significative (Figure 5F).

Figure 5. LPS augmente la perméabilité vasculaire. Microvaisseaux pulmonaires ont été traités avec de Ringer ou LPS (100 ng / ml) pendant 30 min. Après 60 min, le dextrane FITC 20 kD a été perfusé suivie du lavage de Ringer et les changements de fluorescence capturées par imagerie en temps réel. Ensuite, l'indice de perméabilité des vaisseaux sanguins dans la zone traitée du poumon a été déterminé comme le rapport entre le maximum de fluorescence FITC dextran résiduel. AD) montrent des images au maximum (A, C) et résidu (B, D) FITC fluorescence dans Ringer (A, B) et LPS traité (C, D) microvaisseaux pulmonaires. E) infusion de LPS a diminué l'indice de perméabilité de manière significative dans tous les segments de vaisseaux à l'intérieur de la trame d'image. F) traitement de LPS a provoqué une réduction de l'indice de perméabilité à deux veinules et les capillaires (* p <0,05 par rapport au contrôle de Ringer; répétés trois fois chacun; moyenne ± SEM). Capillaires (PAC) et les veinules (VEN) ont été identifiés par les dimensions du navire obtenues à partir d'une image en fond clair capturé avant la perfusion de FITC dextran 20 kDa. Les images présentées sont une partie recadrée d'une um trame d'image 850 x 850. n = nombre de navires.

Discussion

La préparation du poumon sang perfusé isolé couplé avec l'imagerie en temps réel fournit un outil simple pour la détermination des changements de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires simples. Nous avons appliqué cette méthode pour définir les changements de perméabilité en réponse aux perfusions de LPS. Nos données indiquent clairement que l'infusion de LPS a provoqué une augmentation de la perméabilité microvasculaire. En outre, les données indiquent également que les modifications de la perméabilité induite par le LPS ont été similaires dans les deux veinules et des capillaires. Ainsi, un avantage majeur de cette technique est la possibilité de définir perméabilité des microvaisseaux simples ainsi que d'un réseau mondial de navires. Etant donné que cette technique donne également des changements globaux de perméabilité, il est possible de comparer ces valeurs avec celles obtenues en utilisant d'autres méthodes couramment utilisées, telles que l'analyse gravimétrique. Ainsi, le présent procédé permet aussi la comparaison des informations de fuite microvasculaire fluide avec celle rapportée dans d'autres études.

Par rapport à l'plus largement utilisé des techniques pour déterminer les changements de perméabilité vasculaire, le temps réel du procédé d'imagerie à base nécessite aucun post-traitement des échantillons de tissus pulmonaires. La mesure de la rétention de fluorophore est capturée au cours de la perfusion et de lessivage ultérieur du fluorophore. Ceci élimine nettement la conservation des échantillons de tissus et les erreurs associées à leur manipulation. En plus d'établir individu perméabilité microvasculaire par l'intermédiaire de l'indice de perméabilité, le procédé actuel facilite également la définition de la grandeur de l'augmentation de la fluorescence du traceur, la nature biphasique de la vitesse de variation de la fluorescence du traceur, et le taux de marqueur de fluorescence décroissance au cours de lavage. Ces paramètres supplémentaires peuvent être utilisés pour comparer les réponses à différents traitements, ainsi que les différences inter-segmentaires dans les microvaisseaux, tel que décrit dans notre précédent rapport ^14.

Nous avons décrit ici procédures pour déterminer des changements de perméabilité en réponse à un inflammatoirel'agent délivrée par perfusion vasculaire. Cependant, il est possible d'adapter les procédures pour déterminer les changements de perméabilité aux agents délivrées par les autres voies ainsi. Ainsi, nous avons déjà déterminé microvaisseaux perméabilité augmente à l'acide par l'instillation alvéolaire ^14.

Comme le montrent les photos du poumon, la méthode de livraison de microcathéter base limite le produit livré à une petite région du poumon. Ainsi, en manipulant le microcathéter à différentes régions du poumon, une série d'expériences peut être effectuée de la même poumon. Ainsi, cette méthode a un impact significatif sur le nombre d'animaux requis pour une étude complète. Les données de ce et d'autres études citées ont utilisé plusieurs perfusions dans le même poumon ^{4,11,12,14,16.} Bien qu'aucune différence dans les réponses des différentes régions étaient évidents en raison de possible recirculation des agents infusé via la perfusion dans la présente étude, cette possibilité devrait être contreidered dans la conception expérimentale. Ainsi, lors de l'utilisation de différentes régions du poumon même pour les expériences, il peut être intéressant de déterminer si la ligne de base perméabilité est similaire dans les différentes régions du poumon.

Le succès de la présente méthode dépend essentiellement de la mise en place d'une préparation du poumon et perfusé. La préparation du poumon doit être de couleur uniforme sans taches rouges, le liquide sortant du tube trachéal, une fuite de sang, ou la pression artérielle pulmonaire élevée, lesquels indiquent un poumon endommagé. En outre, il faut veiller lors de l'insertion de la microcathether dans le poumon, comme forçant l'insertion conduira à veinule ponction et des dommages du poumon.

La présente limites de la méthode du poumon intact visualisation aux navires pleurales et sous-pleurales, et permet ainsi des estimations de perméabilité à partir de seulement un sous-ensemble de vaisseaux pulmonaires. Pour la visualisation des vaisseaux profonds, à deux photons imagerie microscopique peut être une alternative possible. Insérerion de la micro-cathéter auriculaire gauche via les limites de la canule infusions dans les veinules et les capillaires dans le sens rétrograde. Une manière possible de nier cette limitation sera d'insérer le cathéter à travers la canule dans l'artère pulmonaire. La seule modification nécessaire à cette procédure alternative consiste à fixer un tube d'extension du cathéter sur le côté d'entrée du poumon.

Ces procédures ont été développées en utilisant le poumon de rat en tant que modèle. Cependant, les mêmes étapes avec des modifications mineures peuvent être utilisées pour déterminer les variations de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires de souris. Pour les expériences de poumon de souris, l'agoniste et le traceur peuvent être ajoutés à la solution de perfusion et de la perméabilité quantifiés comme similaire à celui des poumons de rat. De plus, un marqueur de fluorescence différent peut être substitué pour s'adapter aux capacités du microscope de l'utilisateur. La taille de la molécule de dextran peut être modifiée en fonction de l'amplitude attendue d'augmentation de la perméabilité induite par l'agoniste et devrait être décidéebasée sur des données provenant d'expériences initiales. Ainsi, dans l'ensemble de la préparation du poumon isolé avec l'imagerie de fluorescence fournit un outil puissant pour déterminer unique perméabilité des vaisseaux dans des modèles animaux standards de ALI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4