Summary
La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre hace que sea posible visualizar las redes de microvasos en la superficie del pulmón. A continuación se describe un método para cuantificar la permeabilidad de la microvasculatura individuales en pulmones aislados utilizando imágenes de fluorescencia en tiempo real.
Abstract
La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre es ampliamente utilizado para visualizar y definir la señalización en los microvasos individuales. Mediante el acoplamiento de esta preparación con imágenes en tiempo real, se hace factible para determinar los cambios de permeabilidad en los microvasos pulmonares individuales. Aquí se describe los pasos para aislar a los pulmones de ratas y perfundir con sangre autóloga. A continuación, se describe los pasos para infundir fluoróforos o agentes a través de un micro-catéter en una región de pulmón pequeño. El uso de estos procedimientos descritos, se determinó la permeabilidad aumenta en microvasos pulmonares de rata en respuesta a inyecciones de lipopolisacárido bacteriano. Los datos revelaron que el lipopolisacárido aumentó fuga de líquido a través de ambos segmentos venulares y microvasos capilares. Por lo tanto, este método hace posible la comparación de las respuestas de permeabilidad entre los segmentos vasculares y por lo tanto, definir cualquier heterogeneidad en la respuesta. Mientras que los métodos comúnmente utilizados para definir la permeabilidad pulmonar requieren postprocesado de muestras de tejido de los pulmones, eluso de imágenes en tiempo real evita este requisito como se desprende de la presente método. Por lo tanto, la preparación de pulmón aislado combinado con imágenes en tiempo real, ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales para determinar la permeabilidad microvascular pulmonar, sin embargo, es un método sencillo de desarrollar y poner en práctica.
Introduction
Aumento de la permeabilidad microvascular en los pulmones conduce al desarrollo de edema alveolar y el intercambio de gases en peligro y es una característica importante de la lesión pulmonar aguda (ALI) 1-3. Por lo tanto, las estimaciones de la permeabilidad vascular son importantes para definir el grado de la lesión pulmonar y la eficacia de las intervenciones terapéuticas propuestas. Análisis gravimétrico, tales como la relación húmedo a seco de pulmón libre de sangre y microvascular coeficiente de filtración se utilizan ampliamente métodos para estimar 4,5 permeabilidad. Otros métodos incluyen la cuantificación de la retención de sondas radioactivas o fluorescentes en el tejido pulmonar 6-8. Sin embargo, los métodos anteriores requieren un procesamiento postexperiment de muestras de tejido pulmonar hacia la aclaración de los datos de permeabilidad. Además, dado que un animal puede ser utilizado para un solo protocolo de tratamiento, puede ser necesario el número de animales grandes para un estudio completo. Una característica común de los métodos anteriores es que determinan la permeabilidad vascular media paratodos los vasos sanguíneos dentro de la muestra de tejido. Sin embargo, está bien establecido que los micro y macro vasos pulmonares son fenotípicamente diferentes 9. Por lo tanto, las respuestas de permeabilidad pueden ser heterogéneos entre los diversos segmentos de los vasos, así 9,10. Por lo tanto, la cuantificación de la permeabilidad media de todos los vasos pulmonares en una muestra de tejido puede no reflejar adecuadamente esta heterogeneidad.
En la preparación aislada de pulmón perfundido con sangre, los vasos sanguíneos en la superficie del pulmón pueden ser visualizados por un microscopio vertical 4,11,12. Esto permite que las respuestas que caracterizan en los vasos individuales y por lo tanto, abordar cualquier heterogeneidad en las respuestas 13. Además, mediante la utilización de imágenes de fluorescencia de microvasos, ensayos de fluorescencia basado se pueden incorporar. Además, un microcatéter de la aurícula izquierda se puede utilizar para suministrar agentes y sondas de fluorescencia en los vasos sanguíneos 11,14. El microcatéter limita la entrega a una región de pulmón pequeño, por lo tanto exposando sólo los vasos sanguíneos dentro de la región a los agentes infundidos y fluoróforos. Esto permite que múltiples regiones pequeñas dentro del mismo pulmón a ser utilizados para experimentos separados, que conduce a una reducción global de animales necesarios para un estudio.
Imágenes en tiempo real permite la captura de cambios dinámicos en la vascular y la fluorescencia extravascular de microvasos individuales de la preparación de pulmón aislado. Por lo tanto, para cada uno de los microvasos dentro de un campo de imagen, cambios en la fluorescencia durante la infusión de fluoróforos y washoff se pueden grabar, y se cuantificaron fuera de línea 14. El uso de valores de máxima y residual fluorescencia vascular, un índice de permeabilidad para cada uno de los microvasos dentro del campo de la imagen puede ser determinada. Para determinar los cambios de permeabilidad en respuesta a los agentes inflamatorios o perjudiciales, el agente deseado puede administrarse primero y luego el índice de permeabilidad determinada. Además, el campo de imagen se puede ajustar en cualquier lugar dentro de la región de pulmón infundido por elmicrocatéter, permitiendo así un alto grado de flexibilidad en la selección de la red vascular deseada. Por lo tanto, la preparación de pulmón aislado perfundido con sangre en tándem con formación de imágenes en tiempo real proporciona un modelo experimental atractiva para cuantificar la permeabilidad en microvasos pulmonares individuales.
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Protocol
Todos los experimentos realizados en animales fueron aprobadas por el Comité de la Universidad de Tennessee Health Science Center Institucional Cuidado de Animales y el uso.
1. Tubo para Preparados perfusión del pulmón de la rata
- Preparar un sistema de tubos con tubos de Tygon (# 18) para la perfusión de la sangre como se muestra en la Figura 1. Conectar transductores de presión (P23XL) y colocar el tubo en la platina del microscopio.
- Ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C.
- Conectar la entrada y la salida de pulmón temporalmente con tubo de Tygon.
Figura 1. Tubos de perfusión de sangre. El esquema muestra la configuración de la tubería usada para hacer circular la sangre a través de la preparación de pulmón aislado. También se indican los componentes asociados a través del cual la tubería is enrutado. Un esquema del corazón y de pulmón se incluye para mostrar sitios de conexión entre el tubo y la arteria pulmonar (AP), y fibrilación (LA) de la cánula (líneas azules discontinuas) a la izquierda.
2. Preparación de los pulmones de ratas aislados
- Anestesie ratas (ratas Sprague-Dawley macho; 250-300 g) con ketamina (80-100 mg / kg) y con xilazina (5-10 mg / kg). Después de asegurarse de un plano quirúrgico de anestesia, colocar el animal en posición supina.
- Realizar la traqueostomía, inserte una cánula traqueal (PE-90) y asegure con sutura quirúrgica.
- Infundir heparina (100-200 U) en el corazón por punción cardíaca (21 G aguja de mariposa), espere 60 segundos y la sangre Exsanguinate (~ 12 a 15 ml de sangre).
- Prepare dos cánulas (tubos Tygon, 3 mm de diámetro; 4 cm de largo; acampanados en un extremo) y rellenar con solución salina.
- Lleve a cabo una toracotomía. Hacer una incisión (3 mm) en el ventrículo derecho y deslice el extremo acampanado de una cánula en la incisión hacia la pulmonararteria. Asegure cánula de la arteria pulmonar con suturas quirúrgicas.
- Una incisión (3 mm) de la punta del ventrículo izquierdo y deslice el extremo acampanado de la segunda cánula dentro de la incisión. Guía de la cánula en la aurícula izquierda. Asegure cánula en el ventrículo izquierdo con una cinta umbilical (2 mm de ancho).
- Diseccionar cualquier tejido conectivo, y quitar el pulmón y el corazón junto con las cánulas adjuntas. Coloca los pulmones y el corazón en una placa de Petri. Vuelva a colocar el pulmón para que la superficie diafragmática es en la parte superior. Las tres cánulas deben enfrentar la misma dirección.
- Colocar la preparación de pulmón en un escenario que puede ser manipulado en las direcciones XY. Cualquier etapa que viene con un microscopio se puede modificar para mantener el tubo o una etapa a medida construido, si es necesario.
3. Perfusión sanguínea de los pulmones de ratas aisladas
- Mezclar la sangre se desangraron con una albúmina volumen igual (5%) y añadir la solución al depósito. Arranque la bomba peristáltica y establecer el flujo de rcomió a 14 ml / min. Deje que la sangre para llenar el tubo.
- Con la derivación abierta, retire el conector de entrada-salida de pulmón temporal. Fije la arteria pulmonar y la cánula de la aurícula izquierda a la entrada y la salida de pulmón, respectivamente. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la tubería.
- Conectar la cánula traqueal a un tercer transductor de presión (P23XL). Inflar los pulmones con un 30% de oxígeno a través de la cánula traqueal y mantener la presión en 5 cm H 2 O.
- Cierre la derivación con una pinza para comenzar la perfusión pulmonar. Mantener la arteria pulmonar y la presión de la aurícula izquierda a ~ 10 y 3 cm H 2 O, respectivamente.
4. Preparación de pulmón para microvascular Infusión
- Elevar el extremo posterior del tubo de extensión para el catéter por encima del nivel del pulmón y seguro.
- Preparar un catéter de infusión mediante la inserción de unos 30 cm de un tubo PE10 40 cm de largo en una tubería PE90 ~ 30 cm de largo. Conectar el extremo expuesto de la tubería PE10 a una aguja (30 g) arecapitulativos a una jeringa (1 cc).
- Insertar la combinación de catéter en el extremo posterior elevada de la tubería de extensión. Guía de la combinación de catéter a través de la aurícula izquierda y en el pulmón hasta que encuentre resistencia. A continuación, empuje el catéter PE10 sola vez en el pulmón hasta que encuentre resistencia. Tenga en cuenta que la aplicación de una fuerza excesiva al insertar el catéter lesionar el pulmón.
- Llene la jeringa de 1 cc con solución de Ringer y adherirse a una bomba de jeringa. Ajuste la velocidad de infusión a 10 l / min.
- Lugar de la perfusión se convertirá en pálida en comparación con el resto del pulmón.
- Humedezca el pulmón con solución salina y cubra el pulmón con una envoltura de plástico con un agujero lo suficientemente grande como para dejar el lugar de la infusión al descubierto.
- Hisopo un poco de grasa llave de paso en la parte inferior de una junta tórica (por encargo) y colocar un cubreobjetos de vidrio (# 1,5, 22 mm de diámetro) en la parte inferior de la junta tórica. Coloque suavemente la junta tórica con el cubreobjetos sobre el lugar de la infusión. Fije la junta tórica con una hol tubo de ensayo estándarder. La combinación cubreobjetos / junta tórica no distorsiona las estructuras alveolares por debajo de ella, como se informó recientemente 15.
- Coloque un objetivo (20X) de un microscopio de fluorescencia por encima de la junta tórica y se centran en la superficie del pulmón.
5. Imaging fluorescente dextrano tránsito por Microvasos
- Preparar el microscopio para fluorescencia FITC imágenes.
- Seleccionar una región a ser fotografiado y adquirir imágenes a la velocidad de 1/minuto usando el software de adquisición de imágenes.
- Comience la infusión de FITC-dextrano 20 kD (0,5 mg / ml) usando la bomba de jeringa. La fluorescencia en los vasos sanguíneos se incrementará gradualmente y alcanzar un máximo. Continuar la infusión durante 60 min.
- Luego cambiar a la infusión de Ringer para lavar fluorescencia luminal. Mantener la infusión durante más de 10 min. Continuar la adquisición de imágenes en 1/min durante el lavado-off.
6. Análisis de Imágenes
- Abra el archivo de adquisición de imágenes.
- Coloque las regionesde interés sobre los microvasos dentro del marco de la imagen.
- Reproducir el archivo de imagen cuadro por cuadro y registrar la intensidad de fluorescencia en cada región de interés para todos los fotogramas.
- Trazar el cambio en la intensidad de fluorescencia para cada región de interés como una función de tiempo.
- Cuantificar la máxima intensidad de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia residual después de 10 min de washoff.
- Calcular la relación de máxima a la intensidad de fluorescencia residual en cada región de interés para obtener el índice de permeabilidad para los microvasos asociados con esa región de interés.
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Representative Results
Una preparación de pulmón perfundido con sangre aislado conectado al tubo de perfusión y el equipo relacionado se muestra en la Figura 2. Para fines de demostración, se utilizó una rata Sprague Dawley, aunque los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar con cualquier especie de rata. Infusiones través de un microcatéter de la aurícula izquierda sólo llegan a una pequeña región del pulmón. La región infundido puede ser identificado por la decoloración inducida por infusión-(Figura 3). La preparación de pulmón como posicionada para formación de imágenes en tiempo real se muestra en la Figura 4.
Figura 2. Aislado preparación de pulmón perfundido con sangre. La fotografía muestra los pulmones de ratas aislados conectados al tubo de perfusión y perfundidos con sangre autóloga. Tenga en cuenta que la superficie diafragmática del pulmón se enfrenta a la millascroscope objetivo.
Figura 3. Región de infusión microcatéter. A microcathether insertado a través de la aurícula izquierda se utiliza para infundir solución de Ringer en la preparación de pulmón. La fotografía muestra la región del pulmón izquierdo (círculo) que recibieron la infusión de Ringer. Como la infusión de Ringer desplaza la sangre perfunde a través de los vasos, la región infundido aparece pálido en comparación con las otras regiones del pulmón. Tenga en cuenta que la infusión de Ringer se limita a una pequeña región claramente delimitado del pulmón.
Figura 4. Posición Imaging para la preparación de pulmón aislado. El sho fotografíaWS una preparación de pulmón aislado situado bajo un microscopio objetivo listo para la formación de imágenes. Tenga en cuenta que la superficie pulmonar está cubierta con una envoltura de plástico para mantener la superficie del pulmón húmedo. Una junta tórica mantiene la superficie horizontal de pulmón durante la exploración.
En este estudio, se determinó cambios en la permeabilidad vascular en respuesta a los tratamientos con lipopolisacárido bacteriano (LPS; serotipo 0111: B4), un modelo ampliamente utilizado de ALI. Hacia esto, hemos infundido LPS (100 mg / ml) en microvasos durante 30 min, seguido por lavado de un timbre para 60 min 11. Entonces hemos infundido FITC dextrano 20 kDa para cuantificar el índice de permeabilidad. Fluorescencia FITC residual fue baja en los microvasos tratados con Ringer, pero alta en los pacientes tratados con LPS (Figuras 5A-D). Por otra parte, en comparación con la infusión de Ringer, la infusión de LPS causó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global de la permeabilidad en todos los buques dentro de la fiel imagend (Figura 5E). El índice de permeabilidad cuantificado por separado para las vénulas y capilares sugiere que el aumento de la permeabilidad inducida por LPS fue menor en las vénulas que en los capilares, aunque la diferencia no fue significativa (Figura 5F).
Figura 5. LPS aumenta la permeabilidad vascular. Microvasos pulmonares fueron tratadas con cualquiera de Ringer o LPS (100 mg / ml) durante 30 min. Después de 60 min, FITC dextrano 20 kD fue infundido seguido de lavado de un timbre y los cambios de fluorescencia capturados por imágenes en tiempo real. A continuación, el índice de permeabilidad de los vasos sanguíneos en la región tratada del pulmón se determinó como la relación de la máxima a la fluorescencia residual de dextrano FITC. AD) Imágenes muestran máxima (A, C) y residual (B, D) con FITC Fluorescence en Ringer (A, B) y tratados con LPS (c, d) microvasos pulmonares. E) de infusión de LPS disminuyó el índice de permeabilidad significativamente en todos los segmentos de los vasos dentro del marco de la imagen. F) tratamiento con LPS provocó una reducción en el índice de permeabilidad en ambos vénulas y capilares (* p <0,05 comparado con el control de Ringer; repitieron tres veces cada uno, con una media ± SEM). Los capilares (PAC) y vénulas (VEN) fueron identificados por dimensiones de la embarcación obtenidos de una imagen de campo claro capturado antes de la infusión de FITC-dextrano 20 kD. Las imágenes que se muestran son una parte recortada de una m cuadro de imagen 850 x 850. n = número de buques.
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Discussion
La preparación de pulmón perfundido con sangre aislado junto con imágenes en tiempo real proporciona una herramienta sencilla para la determinación de cambios de permeabilidad en los microvasos pulmonares individuales. Hemos aplicado este método para definir los cambios de permeabilidad en respuesta a la infusión de LPS. Nuestros datos sugieren claramente que la infusión de LPS provocó un aumento de la permeabilidad microvascular. Además, los datos también indican que los cambios de permeabilidad inducidos por LPS fueron similares en ambos vénulas y capilares. Por lo tanto, una gran ventaja de esta técnica es la capacidad de definir permeabilidad de microvasos individuales, así como una red mundial de buques. Dado que esta técnica también produce cambios globales de permeabilidad, es posible comparar estos valores con la obtenida usando otros métodos usados comúnmente, tales como el análisis gravimétrico. Por lo tanto, el presente método también permite la comparación de la información fuga de líquido microvascular con lo reportado en otros estudios.
En comparación con lamás ampliamente utilizado técnicas para determinar los cambios en la permeabilidad vascular, el método de creación de imágenes basada en tiempo real no requiere post-procesamiento de las muestras de tejido pulmonar. La medida de la retención de fluoróforo se captura durante la infusión y la posterior washoff del fluoróforo. Esto elimina claramente la preservación de muestras de tejido y los errores asociados con su manejo. Además de establecer la permeabilidad de los microvasos individual a través de el índice de permeabilidad, el método actual también facilita la definición de la magnitud del aumento de fluorescencia del trazador, la naturaleza bifásica de la velocidad de cambio de la fluorescencia del trazador, y la tasa de trazador de fluorescencia de desintegración durante lavar. Estos parámetros adicionales se pueden utilizar para comparar las respuestas a diferentes tratamientos, así como las diferencias entre los segmentos en los microvasos, tal como se describe en nuestro informe anterior 14.
Hemos descrito en el presente documento procedimientos para determinar los cambios de permeabilidad en respuesta a un inflamatoriaagente entregado por infusión vascular. Sin embargo, es posible adaptar los procedimientos para determinar los cambios de permeabilidad a los agentes entregados por otras vías, así. Por lo tanto, hemos determinado previamente de microvasos de permeabilidad aumenta a ácido entregados por instilación alveolar 14.
Como es evidente a partir de las fotografías de pulmón, el método de entrega microcatéter basado restringe el producto entregado a una pequeña región del pulmón. Por lo tanto, mediante la manipulación del microcatéter a diferentes regiones del pulmón, una serie de experimentos se puede realizar en el mismo pulmón. Por lo tanto, este método tiene un impacto significativo en el número de animales necesarios para un estudio completo. Los datos de este y otros estudios mencionados han utilizado infusiones múltiples en el mismo pulmón 4,11,12,14,16. Si bien no hay diferencias en las respuestas de las diferentes regiones eran evidentes debido a la posible recirculación de los agentes infundidos a través de la perfusión en el presente estudio, esta posibilidad debe ser contrasidered en el diseño experimental. Así, cuando la utilización de diferentes regiones del mismo pulmón para experimentos, puede ser beneficioso para determinar si la permeabilidad de la línea de base es similar en las diferentes regiones del pulmón.
El éxito del método actual depende fundamentalmente de la creación de una preparación buena perfusión pulmonar. La preparación de pulmón debe ser de color uniforme, sin manchas rojas, el líquido que sale del tubo traqueal, fugas de sangre o altas presiones de la arteria pulmonar, los cuales indican un pulmón dañado. Además, se debe tener cuidado durante la inserción del microcathether en el pulmón, como forzar la inserción dará lugar a la punción vénula y el daño del pulmón.
El presente método limita pulmonar intacta la visualización para vasos pleurales y subpleurales, y por lo tanto permite que las estimaciones de permeabilidad a partir de sólo un subconjunto de los vasos pulmonares. Para la visualización de vasos más profundos, imágenes microscópicas de dos fotones puede ser una alternativa posible. Insertarion del micro-catéter a través de la aurícula izquierda límites cánula infusiones en vénulas y capilares en el sentido retrógrado. Una forma posible para negar esta limitación será para insertar el catéter a través de la cánula de la arteria pulmonar. La única modificación necesaria para este procedimiento alternativo es para conectar un tubo de extensión para el catéter en el lado de entrada de pulmón.
Estos procedimientos se desarrollaron con el pulmón de la rata como modelo. Sin embargo, los mismos pasos, con algunas modificaciones de menor importancia pueden ser utilizados para determinar los cambios de permeabilidad en microvasos pulmonares de ratón. Para los experimentos de pulmón de ratón, el agonista y el trazador se pueden añadir al perfundido y la permeabilidad cuantificaron como similar a la de los pulmones de ratas. Además, un trazador de fluorescencia diferente puede ser sustituido para adaptarse a las capacidades de microscopio del usuario. El tamaño de la molécula de dextrano se puede cambiar dependiendo de la magnitud esperada de aumento de la permeabilidad inducida por el agonista y debe decidirsesobre la base de datos de los experimentos iniciales. Por lo tanto, en general la preparación de pulmón aislado junto con imágenes de fluorescencia proporciona una poderosa herramienta para determinar sola permeabilidad vascular en modelos animales estándar de ALI.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los estudios fueron apoyados por NIH HL75503 de KP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
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