Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

Summary

Det isolerte blod-perfusjon lunge preparatet gjør det mulig å visualisere microvessel nettverk på lungeoverflaten. Her beskriver vi en tilnærming til å kvantifisere permeabilitet av enkelt microvessels i isolerte lungene ved hjelp av sanntids fluorescens bildebehandling.

Abstract

Den isolerte blod-perfundert lunge preparatet er mye brukt til å visualisere og definere signalering i enkelt microvessels. Ved å koble dette preparatet med sanntid bildebehandling, blir det mulig å bestemme permeabilitet endringer i individuelle lunge microvessels. Heri vi beskrive tiltak for å isolere rotte lungene og perfuse dem med autolog blod. Så, vi skissere tiltak for å sette mot fluoroforene eller agenter via en microcatheter inn en liten lunge regionen. Ved hjelp av disse prosedyrene som er beskrevet, vi bestemt permeabilitet økning i rotte lunge microvessels i respons til infusjoner av bakteriell lipopolysakkarid. Dataene viste at lipopolysakkarid økt væskelekkasje på tvers av både venular og kapillær microvessel segmenter. Således gjør denne metoden det mulig å sammenligne permeabilitet responser blant vaskulære segmenter, og dermed definere en hvilken som helst heterogenitet i respons. Mens vanlige metoder for å definere lunge permeabilitet krever etterbehandling av lunge vevsprøver, denbruk av sanntids avbildning unngår dette krav som framgår av den foreliggende fremgangsmåte. Således, den isolerte lunge preparatet kombinert med sanntids avbildning gir flere fordeler i forhold til tradisjonelle metoder for å fastslå lungemikrovaskulær permeabilitet, men likevel er en grei metode for å utvikle og implementere.

Introduction

Økt mikrovaskulær permeabilitet i lungene fører til utvikling av alveolær ødem og kompromittert gassutveksling og er en viktig egenskap av akutt lungeskade (ALI) ^1-3. Dermed estimater av vaskulær permeabilitet er viktige i å definere omfanget av lungeskade og effekt av foreslåtte terapeutiske intervensjoner. Gravimetrisk analyse slik som blod fri lunge våt-til-tørr-forhold og mikrovaskulær filtrering koeffisient er mye brukt metode for å estimere permeabilitet ^4,5. Andre metoder omfatter kvantifisere oppbevaring av radioaktive eller fluorescerende prober i lungevevet ^6-8. Men de ovennevnte metodene krever postexperiment behandling av lunge vevsprøver mot belyse permeabilitet data. Dessuten, siden ett dyr kan bare brukes for en enkelt behandling protokollen, store dyrenumre kan være nødvendig for en fullstendig undersøkelse. Et felles trekk ved de ovenfor angitte fremgangsmåter er at de bestemmer den midlere vaskulær permeabilitet foralle blodårene i vevsprøve. Imidlertid er det vel etablert at pulmonære mikro-og makro-fartøy er fenotypisk forskjellig ^ni. Derfor kan permeabilitet svarene være heterogene blant de ulike fartøysegmenter samt ^9,10. Dermed kvantifisere gjennomsnittlig permeabilitet av alle lunge skip i en vevsprøve ikke nødvendigvis gjenspeile dette heterogenitet.

I den isolerte blod-perfundert lunge forberedelse, kan blodårer på lungeoverflaten bli visualisert ved en oppreist mikroskop ^4,11,12. Dette gjør karakteriserer reaksjoner i enkeltfartøy og dermed ta opp eventuelle heterogenitet i svarene ^13. I tillegg, ved å benytte fluorescens-avbildning av microvessels, fluorescens-baserte assays kan være innarbeidet. Videre kan en venstre atrie microcatheter brukes til å levere agenter og fluorescens sonder i blodkar ^11,14. Den microcatheter begrenser levering til et lite lunge-området, således exposerer bare blodårene i regionen til de infused agenter og fluorophores. Dette gjør at flere små regioner innen den samme lungen som skal brukes for separate eksperimenter, som fører til en samlet reduksjon i dyr som er nødvendig for en undersøkelse.

Sanntid avbildning muliggjør fangst av dynamiske endringer i vaskulær og ekstravaskulær fluorescens av enkelt microvessels av den isolerte lunge forberedelse. Således, for hver microvessel innenfor et bildefelt, endringer i fluorescens i løpet av infusjon av fluoroforer og Awasking kan registreres, og kvantifiseres frakoblet ^14.. Bruke verdier av maksimal og rest vaskulær fluorescens, kan en permeabilitet indeks for hver microvessel innen bildebehandling feltet bestemmes. For å bestemme endringer i gjennomstrømningen i respons til inflammatoriske eller skadelige stoffer, kan det ønskede middel administreres først, og deretter permeabiliteten indeksen bestemmes. I tillegg kan bildefeltet settes hvor som helst innenfor den tette region infusert medmicrocatheter, og muliggjør en høy grad av fleksibilitet ved valg av den ønskede vaskulære nettverk. Dermed blir isolert blod-perfundert lunge forberedelse i tandem med sanntid bildebehandling gir en attraktiv eksperimentell modell for å kvantifisere permeabilitet i enkelt lunge microvessels.

Protocol

Alle eksperimenter utført på dyr var som godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Tennessee Health Science Center.

En. Tubing for perfusert Rat Lung Forberedelser

1. Forbered et rørsystem med Tygon rør (18) for blod perfusjon, som vist i figur 1.. Koble trykktransdusere (P23XL) og plasser rørene på objektbordet.
2. Sett vannbad temperaturen til 37 ° C.
3. Koble lunge innløp og utløp midlertidig med Tygon slange.

Figur 1. Blod Perfusjonsslangen. Den skjematisk viser slangen oppsettet som brukes for å sirkulere blod gjennom den isolerte lunge-preparatet. Også angitt er forbundet komponenter gjennom hvilken slangen is rutes. En skjematisk i hjertet og lungene er inkludert for å vise områder av forbindelsen mellom rør og lungearterien (PA), og venstre atrial (LA) kanylen (blå stiplede linjer).

2. Utarbeidelse av Isolerte Rat Lunger

1. Anesthetize rotter (hann Sprague-Dawley rotter, 250-300 g) med ketamin (80 til 100 mg / kg) og med xylazin (5-10 mg / kg). Etter å sikre en kirurgisk planet av anestesi, plasserer dyret i en liggende stilling.
2. Utfør trakeostomi, sette inn en trakealkanyle (PE-90) og fest med kirurgisk sutur.
3. Sette mot heparin (100-200 U) inn i hjertet av hjertestans punktering (21 G butterfly nål), vente i 60 sek og exsanguinate blod (~ 12-15 ml blod).
4. Forbered to kanyler (Tygon slange, 3 mm diameter, 4 cm lange, blusset den ene enden) og fyll med saltvann.
5. Utfør et Thoracotomi. Lag et innsnitt (3 mm) på høyre ventrikkel og skyver blusset ende av en kanyle inn i snittet mot lungearterie. Fest kanylen til lungearterien med kirurgiske sting.
6. Incise (3 mm) i spissen av venstre ventrikkel og skyver blusset slutten av den andre kanylen inn i snittet. Veilede kanylen inn i venstre atrium. Fest kanylen til venstre ventrikkel med en kirurgisk teip (2 mm bredde).
7. Dissekere noen bindevev, og fjerne lunge og hjerte sammen med de vedlagte kanyler. Plasser lunge og hjerte på en petriskål. Flytt lungen slik at diafragma-flaten er på toppen. De tre kanyler skal vende samme retning.
8. Plasser lunge forberedelse på en scene som kan manipuleres i XY retninger. Enhver scene som kommer med et mikroskop kan bli endret for å holde slange eller en skreddersydd scene bygget, hvis det er nødvendig.

Tre. Blod Perfusjons av Isolerte Rat Lunger

1. Bland blod tappet for blod med et likt volum albumin (5%) og tilsett til reservoaret. Starte den peristaltiske pumpe og sette strømnings rspiste til 14 ml / min. Tillat blod som fyller produksjonsrøret.
2. Med shunt åpen, fjerne den midlertidige lunge innløp-outlet-kontakt. Fest lungearterien og venstre atrial kanyle til lungen innløpet og utløpet, henholdsvis. Pass på at det ikke er luftbobler i slangen.
3. Koble trakealkanyle til en tredje trykkgiver (P23XL). Blås lungene med 30% oksygen via trakealkanyle og opprettholde trykket på 5 cm H ₂ O.
4. Lukk shunt med en klemme for å begynne Lungeperfusjon. Opprettholde lungepulsåren og venstre atrie press på ~ 10 og 3 cm H ₂ O henholdsvis.

4. Forbereder Lung for mikrovaskulær Infusion

1. Hev den bakre ende av forlengelsesrøret for kateteret over nivået av lungen og sikker.
2. Klargjør en infusjonskateter ved å sette inn ca 30 cm av en 40 cm lang PE10 rør inn en ~ 30 cm lang PE90 rør. Koble den eksponerte enden av PE10 slange til en nål (30 G) ikert festet til en sprøyte (1 cc).
3. Føre inn katetret kombinasjonen inn i hevet bakre ende av forlengelsesrøret. Før kateter kombinasjon i venstre atrium og inn i lungene til det møter motstand. Skyv deretter PE10 kateter alene lenger inn i lungene til den møter motstand. Vær oppmerksom på at å bruke makt når du setter kateter vil skade lungene.
4. Fyll 1 cc sprøyte med Ringers løsning og feste til en sprøytepumpe. Sett infusjonshastighet til 10 mL / min.
5. Infusjonsstedet blir blek i forhold til resten av lungen.
6. Fukt lunge med saltvann og dekke lunge med plastfolie med et hull stort nok til å forlate innstikkstedet avdekket.
7. Vattpinne noen stoppekran fett på bunnen av en O-ring (skreddersydde) og plassere et glass dekkglass (# 1.5, mm diameter 22) på bunnen av O-ringen. Forsiktig plassere O-ringen med dekkglass på innstikkstedet. Fest O-ringen med en standard test-tube holder. Dekkglass / O-ring kombinasjon ikke forvrenge alveolære strukturer under den, som nylig rapportert ^15.
8. Plasser en objektiv (20X) av et fluorescens-mikroskop over O-ringen, og fokusere på lungeoverflaten.

5. Imaging Fluorescent Dextran Transit Gjennom microvessels

1. Forbered mikroskop for bildebehandling FITC florescence.
2. Velg en region for å bli fotografert og hente bilder på frekvensen av 1/minute ved hjelp av image oppkjøpet programvare.
3. Begynn infusjon av FITC-dekstran 20 kD (0,5 mg / ml) ved hjelp av sprøytepumpen. Fluorescens i blodårene vil gradvis øke og nå et maksimum. Fortsett infusjonen i 60 min.
4. Deretter bytte til Ringers infusjons å vaske av luminal fluorescens. Oppretthold infusjon i over 10 min. Fortsett image oppkjøpet ved 1/min under vask-off.

6. Bildeanalyse

1. Åpne bildet oppkjøpet filen.
2. Plasser regionerav interesse over microvessels innenfor bilderammen.
3. Spill bildefilen frame-by-frame og registrere fluorescens intensiteten på hver region av interesse for alle rammer.
4. Plott endringen i fluorescens-intensitet for hver region av interesse som en funksjon av tid.
5. Kvantifisere den maksimale fluorescensintensiteten og den gjenværende fluorescens intensitet etter 10 min på Awasking.
6. Beregn forholdet mellom maksimum til rest fluorescensintensiteten ved hvert område av interesse for å få permeabilitet indeksen for microvessels forbundet med den regionen av interesse.

Representative Results

Et isolert blod-perfusjon lunge preparat som er koblet til perfusjon rør og tilhørende utstyr er vist i figur 2.. For demonstrasjonsformål, har vi brukt et Sprague Dawley-rotte, selv om fremgangsmåtene som er beskrevet her kan brukes med alle rotter arter. Infusjoner gjennom en venstre atrie microcatheter nå bare et lite område av lungen. Den tilført regionen kan identifiseres ved infusjon-indusert misfarging (Figur 3). Lungene preparat som posisjonert for sanntids avbildning er vist i figur 4..

Figur 2. Isolert blod-perfundert lunge forberedelse. Bildet viser isolerte rotte lungene koblet til Perfusjonsslangen og perfusert med autolog blod. Legg merke til at diafragma overflaten av lungene vender mot microscope objektiv.

Figur 3. Microcatheter infusjon regionen. En microcathether inn via venstre atrium ble brukt til å sette mot Ringers løsning i lunge forberedelse. Bildet viser den regionen i venstre lunge (sirkel) mottar Ringers infusjons. Som Ringers infusjons fortrenger blodet perfusert gjennom fartøyene, vises tilført regionen blek i forhold til de andre lungeområder. Legg merke til at Ringers infusjon er begrenset til et lite klart avgrensede området av lungene.

Figur 4. Imaging posisjon for isolerte lunge forberedelse. Fotografiet shows en isolert lunge preparat plassert under en mikroskopobjektiv klar for avbilding. Legg merke til at den tette overflate er dekket med en plastfolie for å holde den tette overflate fuktig. En O-ring opprettholder den tette overflate horisontalt under avbildning.

I denne studien, bestemt vi endringer i vaskulær permeabilitet som svar på behandlinger med bakteriell lipopolysakkarid (LPS; serotype 0111: B4), en mye brukt modell av ALI. Mot dette, vi tilført LPS (100 ug / ml) inn i microvessels i 30 min etterfulgt av en Ringers vask i 60 minutter ^11. Da vi tilført FITC dekstran 20 kD å kvantifisere permeabilitet indeksen. Residual FITC fluorescens var lav i microvessels behandlet med Ringers, men høy hos pasienter behandlet med LPS (figur 5A-D). Videre, i forhold til Ringers infusjon forårsaket LPS infusjon en betydelig reduksjon i permeabiliteten indeks, noe som tyder på en global økning i permeabiliteten i alle fartøyer i bildet field (figur 5E). Permeabiliteten Indeksen kvantifiserer separat for venules og kapillærer antydet at LPS-indusert økning permeabilitet var lavere i venules enn i kapillærene, selv om forskjellen ikke var signifikant (figur 5F).

Figur 5. LPS øker vaskulær permeabilitet. Lunge microvessels ble behandlet med enten Ringers eller LPS (100 ug / ml) i 30 min. Etter 60 min, ble FITC-dekstran 20 kD tilført etterfulgt av en Ringers vask og fluorescensen forandrer fanges opp av sanntids avbildning. Da permeabiliteten indeks på blodkar i det behandlede området av lungene ble bestemt som forholdet mellom den maksimale til rest FITC-dekstran fluorescens. AD) Bildene viser maksimum (A, C) og gjenværende (B, D) FITC fluorescence i Ringer's-(A, B) og LPS-behandlet (C, D) lunge microvessels. E) LPS infusjon redusert permeabilitet indeksen betydelig i alle fartøyssegmenter innenfor bilderammen. F) LPS behandling forårsaket en reduksjon i permeabilitet indeksen i både venules og kapillærer (* p <0,05 sammenlignet med Ringers kontroll, gjentatt tre ganger hver, gjennomsnitt ± SEM). Kapillærer (CAP) og venules (kontrollert) ble identifisert ved skipsdimensjoner hentet fra et lysfelt bilde tatt før infusjon av FITC dekstran 20 kD. Bildene som vises er en beskårede delen av en 850 x 850 mikrometer bilderammen. n = antall fartøy.

Discussion

Den isolerte blod-perfundert lunge forberedelser kombinert med sanntid bildebehandling gir et enkelt verktøy for bestemmelse av permeabilitet endringer i enkelt lunge microvessels. Vi har anvendt denne metode for å definere permeabilitet endres i respons til infusjon av LPS. Våre data klart tyder på at LPS infusjon forårsaket en økning i mikrovaskulær permeabilitet. Videre dataene indikerer også at permeabilitet endringer indusert av LPS var lik i begge venules og kapillærer. Således er en viktig fordel med denne teknikken muligheten til å definere leakiness av enkelt microvessels samt et globalt nettverk av fartøyer. Gitt at denne teknikken gir også globale permeabilitet endringer, er det mulig å sammenligne disse verdier med den som oppnås ved bruk av andre vanlig anvendte metoder, slik som gravimetrisk analyse. Således tillater den foreliggende fremgangsmåte også for sammenlikning av mikrovaskulær fluidlekkasje informasjon med det som er rapportert i andre studier.

Sammenlignet med denmer utbredt teknikker for å bestemme vaskulær permeabilitet endringer, sanntidsbildebaserte metoden krever ingen etterbehandling av lunge vevsprøver. Graden av retensjon fluoroforen er fanget i løpet av infusjonen og påfølgende Awasking av fluoroforen. Dette eliminerer klart å bevare vevsprøver og eventuelle feil knyttet til deres håndtering. I tillegg til å etablere individuelle microvessel permeabilitet via permeabiliteten indeksen, den nåværende metode gjør det også lettere å definere omfanget av tracer fluorescens øker, bifasisk arten av endringshastigheten av tracer fluorescens, og frekvensen av tracer fluorescens nedbrytning under vaske av. Disse andre parametere kan benyttes for å sammenligne respons til forskjellige behandlinger, så vel som inter-segmentelle forskjeller i microvessels, som beskrevet i vår tidligere rapport ^14..

Vi har her beskrevet fremgangsmåter for å bestemme permeabilitet endres i respons til en inflammatoriskagenten levert av vaskulær infusjon. Det er imidlertid mulig å tilpasse fremgangsmåten til å bestemme endringer i gjennomstrømningen til agenter som leveres av andre ruter, i tillegg. Dermed har vi tidligere bestemt microvessel permeabilitet øker til syre levert av alveolar instillasjon ^14.

Som det fremgår av lunge fotografier, begrenser microcatheter basert leveringsmåte det leverte produktet til et lite område av lungen. Således, ved å manipulere microcatheter til forskjellige lungeområder, en serie av eksperimenter kan bli gjennomført på samme lungen. Således har denne metode en betydelig innvirkning på antallet dyr som kreves for en fullstendig undersøkelse. Dataene i denne og andre rapporterte studier har benyttet flere infusjoner i samme lunge ^{4,11,12,14,16.} Mens ingen forskjeller i svarene fra de ulike regionene var tydelig på grunn av mulig resirkulering av infused agenter via perfusatet i denne studien, bør denne muligheten være ulemperidered i eksperimentell design. Således ved å benytte ulike regioner av samme lungen for eksperimenter, kan det være fordelaktig å bestemme hvorvidt referanse permeabilitet er lik i de forskjellige lungeområder.

Suksessen til den nåværende metoden avhenger kritisk om å sette opp et godt perfunderte lunge forberedelse. Lungene preparatet skal være av ensartet farge uten noen røde flekker, fluid som kommer ut av trakealtuben, blodlekkasje eller høye trykket i pulmonalarterien, som alle viser en skadet lunge. Videre bør man være forsiktig under innsetting av microcathether inn i lungene, som tvinger innsetting vil føre til venule punktering og skader på lungen.

Den nåværende intakt lunge metode grenser visualisering til pleural og subpleural fartøy, og dermed lar permeabilitet estimater fra bare en undergruppe av lunge fartøy. For visualisering av dypere fartøy, kan to-foton mikroskopisk avbildning være et mulig alternativ. Settion av microcatheter via venstre atrial kanyle grenser infusjoner i venules og kapillærer i retrograd retning. En mulig måte å oppheve denne begrensningen blir å føre inn katetret gjennom lungearterien kanyle. Den eneste modifikasjon som er nødvendig for denne alternative fremgangsmåte er å feste en forlengelsesrøret for kateteret på lungeinnløpssiden.

Disse prosedyrene ble utviklet ved hjelp av rottelunger som modell. Imidlertid kan brukes de samme trinnene med noen mindre modifikasjoner for å bestemme permeabilitet endringer i mus lunge microvessels. For museeksperimenter lunge, kan den agonist-og sporstoffet bli tilsatt til perfusatet og permeabiliteten kvantifisert som ligner den som er for rotte lungene. Videre kan en annen fluorescens tracer erstattes for å passe egenskapene til brukerens mikroskop. Størrelsen på dekstran-molekylet kan endres avhengig av den forventede størrelsen av agonist-indusert permeabilitet øker og bør avgjøresbasert på data fra innledende forsøk. Dermed samlet den isolerte lunge forberedelse sammen med fluorescens bildebehandling gir et kraftig verktøy for å avgjøre enkelt fartøy permeabilitet i standard dyremodeller av ALI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4