Technologie HaloTag est une technologie multifonctionnelle qui a remporté un succès important dans l'isolement de petits et de grands complexes de protéines à partir de cellules de mammifères. Ici, nous mettons en évidence les avantages de cette technologie par rapport aux alternatives existantes et de démontrer son utilité pour étudier de nombreux aspects de la fonction des protéines dans les cellules eucaryotes.
Recherche en protéomique a explosé ces dernières années avec les progrès dans les capacités de spectrométrie de masse qui ont conduit à la caractérisation de nombreux protéomes, y compris ceux contre les virus, les bactéries et la levure. En comparaison, l'analyse du protéome humain est à la traîne, en partie à cause du grand nombre de protéines qui doivent être étudiés, mais aussi la complexité des réseaux et les interactions de ces présents. Pour répondre spécifiquement aux défis de la compréhension du protéome humain, nous avons développé une technologie HaloTag pour l'isolement des protéines, particulièrement forte pour l'isolement de complexes multiprotéiques et permettant la capture plus efficace des interactions et / ou de protéines faibles ou transitoires de faible abondance. HaloTag est une étiquette codée génétiquement protéine de fusion, conçu pour covalente, spécifique, et l'immobilisation rapide ou marquage des protéines avec différents ligands. S'appuyant sur ces propriétés, de nombreuses applications pour les cellules de mammifères ont été développés pour caractèreiser la fonction des protéines et ici nous présentons les méthodes, y compris: protéines listes déroulantes utilisées pour la découverte de nouvelles interactions ou des tests fonctionnels et la localisation cellulaire. On trouve des avantages significatifs de la vitesse, la spécificité et la capture covalente de protéines de fusion à des surfaces pour l'analyse protéomique par rapport aux autres approches traditionnelles non covalentes. Nous démontrons ci et la grande utilité de la technologie utilisant deux protéines épigénétiques importantes à titre d'exemples, la protéine humaine bromodomain BRD4, et l'histone déacétylase HDAC1. Ces exemples démontrent la puissance de cette technologie pour permettre la découverte de nouvelles interactions et caractérisant la localisation cellulaire chez les eucaryotes, qui, ensemble, une meilleure compréhension des droits de la protéomique fonctionnelle.
Compréhension de la fonction cellulaire, réponse à des stimuli, et des changements dans le développement et / ou des états pathologiques est intimement liée à dé-convolution du protéome tout au long de ces différents états dynamiques 1,2. Beaucoup a été fait pour comprendre le protéome des organismes inférieurs, cependant, étant donné le nombre de protéines et toutes les interactions possibles, cela a été très difficile dans la lutte contre le protéome humain 1,3-7. Les progrès de la spectrométrie de masse ont largement permis à la capacité d'entreprendre ces études, et ici nous présenter un avancement supplémentaire et significative avec le développement de la technologie HaloTag à la fois la capture efficace des complexes de protéines et la caractérisation fonctionnelle des protéines humaines à partir de cellules de mammifères 8-10. Cette technologie a récemment été montré dans plusieurs études pour être un facteur critique pour la découverte des interactions importantes, ce qui permet de mieux comprendre la fonction de la protéine nouvelle et understandide la maladie de 11 à 13 ng.
La protéine de fusion HaloTag a été initialement développé pour répondre à plusieurs défis de marqueurs d'affinité traditionnels et des anticorps comme connexes à la capture de la protéine, la purification et l'étiquetage 8-10. De la quasi-totalité des procédés pour la capture et la purification des protéines, il existe une étape d'interaction non covalente, qui est utilisé pour l'enrichissement d'une protéine particulière 14. Au cours de cette étape, la protéine et / ou complexe peuvent dissocier due à la diffusion, en particulier si le procédé nécessite heures au lieu de minutes. Pour répondre à cette préoccupation, la protéine de fusion a été spécifiquement conçu pour interagir rapidement et irréversiblement avec ses ligands, qui peuvent être soit des particules, des surfaces ou des fluorophores 9. Par conséquent, une fois qu'il est lié à son ligand, il reste lié, qui est l'un des facteurs les plus différentiation par rapport à d'autres marqueurs d'affinité. Également démontré ici, est la capacitépour traiter différentes questions biologiques avec un seul produit d'assemblage, ce qui est possible par des ligands 9 (figure 1) en alternance. Par exemple, pour interroger les interactions ou la fonction des protéines, des ligands de surface sont utilisés pour la capture des protéines ou des complexes (figure 1). Dans une expérience séparée, la même protéine de fusion peut être marqué par fluorescence pour étudier la localisation cellulaire, le trafic, ou le renouvellement des protéines (Figure 1). Il est important de se rappeler, cependant, que, une fois un ligand est lié, qu'il s'agisse d'une surface ou d'un fluorophore, il est irréversible, et donc d'autres ligands ne peut pas alors être lié par la suite dans la même expérience.
Analyse des technologies existantes pour cartographier les interactions entre protéines révèle la difficulté d'isoler efficacement les interactions spécifiques, y compris ceux qui sont plus transitoire ou sont en faible abondance 1,6,7,14,15. En outre, les travaux récents de nombreux groupes représente la préoccupation que, dans des méthodes d'isolement classiques, en particulier dans le domaine de la protéomique humaines, il existe un nombre significatif de contaminants protéiques qui peuvent masquer des signaux provenant de vraies interacteurs dans l'analyse par spectrométrie de masse 16. Les propriétés développées pour la protéine HaloTag et son adresse de résine co-développé bien ces préoccupations. Dans le protocole de pulldowns complexes (figure 1), la liaison de complexes peut être réalisée en 15 min, à la fois complexe et la promotion de la capture de la réduction des niveaux de liaison non-spécifique 8. En outre, la liaison irréversible permet une capture efficace des protéines de faible abondance et permet l'utilisation de beaucoup moins de cellules, ce qui réduit encore le fond 8. Une fois la capture de complexes est établi, le protocole comprend des conditions de lavage doux pour préserver l'intégrité complexe. Élution des complexes capturés peut être effectuée par deux méthodes et choix de la méthode est dicté par l'objectif de l'anus avallyse. Si l'on souhaite analyser ou découvrir des protéines qui interagissent par transfert de Western ou par spectrométrie de masse, il est alors recommandé, pour éluer des complexes avec des agents dénaturants tels que le SDS ou de l'urée (figure 1). Ceci est particulièrement avantageux pour la spectrométrie de masse comme la protéine fusionnée à l'origine HaloTag, appelée la protéine appât, restera en arrière lié à la résine et ne sera donc pas dominer la population de peptides détectés dans la spectrométrie de masse. Cela signifie aussi, cependant, que la protéine appât ne sera probablement pas être visible dans l'analyse par transfert de Western, une différence significative par rapport à d'autres purifications d'affinité non covalentes ou des co-immunoprécipitations. Si le but est de purifier une intact complexes pour être utilisées pour des études fonctionnelles, l'élution peut être réalisée en utilisant TEV (Tobacco Etch Virus) protéase, qui reconnaît la séquence de clivage apparenté codé entre la protéine de fusion et la protéine appât (figure 1). Tes échantillons pourraient aussi être analysés par spectrométrie de masse, mais comme montré plus tard, ils contiennent une quantité significative de protéine appât qui peut empêcher la détection de faible abondance, interacteurs spécifiques.
Nous présentons ici les protocoles déroulants et d'imagerie appliquées à deux protéines thérapeutiques importants, la protéine bromodomain BRD4 et une histone déacétylase, HDAC1 17. Nous avons montré avec ces exemples, l'interaction avec les partenaires attendus tel que déterminé par spectrométrie de masse, l'activité enzymatique après isolement complexe pour HDAC1, et la localisation cellulaire correcte pour les deux. Ensemble, ces résultats démontrent le caractère multifonctionnel et la force de la technologie pour la caractérisation des interactions des protéines eucaryotes et fonction.
Présentés ici sont deux protéines de fusion, Halo et Halo BRD4-HDAC1, caractérisé en cellules de mammifères pour l'expression eucaryotes, les protéines et l'isolement activité complexe, et la localisation cellulaire. En travaillant à travers ces différents protocoles, il ya plusieurs étapes importantes pour la réussite de chaque expérience. Comme c'est le cas avec n'importe quelle protéine de fusion, le niveau d'expression et le placement de l'étiquette elle-même peut être critique pour le maintien de la physiologie. Il est donc important de considérer que les fusions C-terminal N-et / ou devront être conçus si la connaissance préalable ou de travailler avec une autre étiquette n'a pas été démontrée pour la protéine particulière de choix. En ce qui concerne l'expression, si le niveau est trop élevé, la dilution de l'ADN peut être effectuée au cours de la transfection ou l'utilisation de vecteurs avec des promoteurs plus faibles sont possibles pour atteindre le niveau qui est approprié. Des travaux antérieurs ont été réalisées montrant l'isolement efficace des complexes macromoléculaires endogène levels d'expression 8, permettant le travail à de très faibles niveaux d'expression. Si possible, les études de localisation cellulaire seraient également en mesure de donner un aperçu quant à la position optimale de l'étiquette de placement ainsi que le niveau d'expression relatif nécessaire pour la physiologie appropriée.
Une fois que les protéines de fusion sont prêts pour des expériences déroulants, pour obtenir le maximum de succès avec le protocole, il est très important de suivre les délais recommandés dans la lyse, la reliure et sections de lavage, comme l'un des plus grands avantages est la vitesse de l'isolement complexe processus. Si l'une de ces étapes sont allongés dans le temps, comme est nécessaire pour une méthode de capture à base d'anticorps, il existe un risque de dissociation complexe ou non spécifique augmentation de la liaison 8. Même si les temps sont raccourcis lors de la lyse cellulaire ou de liaison, les cellules ne peuvent pas être complètement lysées ou efficacement capturés respectivement. Si le nombre de lavages est dim.assouplissement ou un bon mélange de la résine ne se produit pas au cours des lavages de liaison ou, alors les niveaux de protéines non spécifiques fond seront augmentés. En outre, les moyens de lyse est très importante par rapport aux l'efficacité de liaison à la résine. Les tentatives de Soniquer les échantillons, éliminer le détergent recommandé, ajouter SDS ou autre détergent puissant, et / ou comprendre AEBSF inhibiteur de la protéase se traduira par la réduction ou la perte de la liaison de protéines de fusion et de leurs complexes de la résine.
Les méthodes existantes pour l'isolement complexe de cellules de mammifères et protéomique lutte de l'analyse humaine avec le défi de la réduction fond dans l'analyse par spectrométrie de masse 16. Cela a été tellement importante que un dépôt de protéines contaminantes a été créé par de nombreux groupes de spectrométrie de masse 16. Fond dans les échantillons spectrométrie de masse déroulants peut être définie comme tout ce qui empêche l'identification devéritables interacteurs de la protéine appât. En tant que telle, le fond peut provenir de protéines contaminantes non spécifiques ou aussi de fortes concentrations de protéine appât ou anticorps utilisés pour précipiter les protéines d'appât. Un travail important a été fait pour optimiser à la fois le protocole d'excursion basse présentée ici, ainsi que la résine pour minimiser le niveau des protéines contaminantes non-spécifiques dans le processus de pulldown. Ceci est évident dans les gels de coloration d'argent et une analyse par spectrométrie de masse de la commande (figure 2). Pour faire face aux niveaux élevés de protéine appât ou des anticorps qui peuvent être tout aussi préjudiciable que les contaminants et à laquelle d'autres méthodes de lutte, le menu déroulant avec SDS élution est recommandé (Protocole section 2.4). En raison de la fixation covalente à la résine, ce procédé laisse la majorité de la protéine de fusion de départ lié de manière covalente à la résine. Un faible pourcentage d'appât est observé dans l'analyse par spectrométrie de masse, qui est censéde se produire par hydrolyse, mais il ne présente pas un problème pour la détection d'autres interactions faibles ou transitoires 8.
Comme mentionné dans l'introduction, des avancées significatives dans la protéomique ont été permis par des avancées significatives dans la spectrométrie de masse 1,7. Par conséquent, il est important de mettre en évidence les paramètres importants du choix de l'analyse de spectrométrie de masse pour déconvoluer le mélange de protéines obtenues dans les pulldowns. Instrumentation doit être robuste et capable de routine et de manière efficace l'analyse d'échantillons contenant une petite quantité de protéines, souvent inférieure à <1 pg. Chromatographie échelle nanométrique impliquant 50-75 um internes colonnes diamètre HPLC avec des débits de l'ordre de 100-300 nl / min est typiquement utilisé pour la compatibilité avec les petites tailles d'échantillon et de maximiser la sensibilité du spectromètre de masse. Afin de maximiser l'information acquise dans une analyse unique état of les spectromètres de masse de pointe capables d'acquérir des spectres de masse à haute résolution sur une échelle de temps compatible avec les séparations à l'échelle nanométrique précités, ≥ 10 Hz, sont généralement employés. Ces instruments ont des niveaux de sensibilité et de attomolar peuvent acquérir régulièrement des données avec les sous précurseur ppm et d'ions produit tolérances d'erreur de masse. Ces performances permettent d'augmenter le rendement du nombre de protéines identifiées et la confiance associée à ces identifications.
Avec ces données, nous démontrons localisation physiologique cellulaire, la protéine adéquate: les interactions entre protéines ainsi que le potentiel pour la découverte de nouvelles interactions, et l'isolement de complexes actifs tout en utilisant une seule construction. En effet, les technologies alternatives peuvent être utilisées pour chacun de ces différents aspects, mais probablement pas pour autant 23,24. Grâce à la technologie HaloTag, une approche polyvalente peut être utilisée, en avançant protéomiqueics études et l'obtention d'une compréhension plus complète de la fonction des protéines dans des cellules de mammifères.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Martin Rosenberg, Gary Tarpley, et le Dr Keith Wood pour le soutien de ce travail, et le Dr James Cali pour la lecture critique du manuscrit. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, et MU sont des employés de Promega Corporation. MF, RJ, RA, et DA sont des employés de MS Bioworks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |