Summary
HaloTag 기술은 포유 동물 세포에서 크고 작은 단백질 단지의 분리에 상당한 성공을 보이고있다 다기능 기술입니다. 여기에서 우리는 기존의 대안에 비해이 기술의 장점을 강조하고 진핵 세포 내에서 단백질 기능의 다양한 측면을 연구하기 위해 유틸리티를 보여줍니다.
Abstract
프로테오믹스 연구는 바이러스, 박테리아, 효모에서 그 등 다양한 프로테옴의 특성을 이끌고있다 질량 분석 기능의 발전과 함께 최근 몇 년 동안 폭발했다. 비교에서는, 인간 프로테옴의 분석은 부분적으로 인해 공부를해야합니다 단백질의 완전한 숫자뿐만 아니라, 네트워크와의 상호 작용이 존재의 복잡성에 뒤쳐. 특히 인간 프로테옴을 이해하는 문제를 해결하기 위해, 우리는 단백질 분리를 위해 HaloTag 기술을 개발 multiprotein의 단지의 분리에 특히 강하고 낮은 풍부 약하거나 과도 상호 작용 및 / 또는 단백질을보다 효율적으로 캡처를 허용했다. HaloTag는 유전자 인코딩 단백질 융합 공유를 위해 디자인 태그, 특정, 신속한 고정 또는 다양한 리간드 단백질의 라벨입니다. 이러한 특성을 활용, 포유 동물 세포에 대한 여러 응용 프로그램은 문자로 개발되었다단백질 기능을이지는 여기에 우리는 등의 방법론을 제시 : 단백질의 새로운 상호 작용 또는 기능 분석의 발견에 사용되는 풀다운, 셀룰러 현지화. 우리는 속도, 특이도, 그리고 다른 전통적인 비 공유 방식에 비해 단백질 체학 분석을 위해 표면에 융합 단백질의 공유 캡처에서 상당한 장점을 찾을 수 있습니다. 우리는이 예제와 인간의 bromodomain 단백질 BRD4 및 히스톤 디 아세틸 라제의 HDAC1으로 두 가지 중요한 성적인 단백질을 사용하여 기술의 다양한 유틸리티를 보여줍니다. 이러한 예는 새로운 상호 작용의 발견을 가능하게하고 진핵 생물의 세포 지방화의 특성이 기술의 힘을 입증하는 것입니다 인간의 기능 단백질 체학 함께 더 이해.
Introduction
세포 기능, 자극에 대한 반응, 개발 및 / 또는 질병 상태의 변화에 대한 이해가 복잡하게 서로 다른 동적 상태 1,2에 걸쳐 프로테옴의 탈 회선에 연결되어 있습니다. 대부분은 단백질의 수와 가능한 모든 상호 작용을 지정해,이 인간 프로테옴 1,3-7를 해결하기에 매우 도전하고있다, 그러나 낮은 유기체의 프로테옴을 이해하기 위해 수행되었다. 질량 분석의 발전은 크게 이러한 연구를 수행 할 수있는 기능을 사용할 수 있고, 여기에 우리는 단백질 복합체 및 포유 동물 세포 8-10에서 인간 단백질의 기능 특성을 모두 효율적으로 캡처 HaloTag 기술의 발달과 함께 추가로 상당한 발전을 제시한다. 이 기술은 최근에 새로운 단백질의 기능과 understandi에 대한 통찰력을 허용, 중요한 상호 작용의 발견을위한 중요한 요소로 여러 연구에서 밝혀졌다질병 11 ~ 13 NG.
HaloTag 단백질 융합은 초기에 기존의 친 화성 태그와 단백질 캡처, 정화, 및 표시 8-10으로 관련 항체의 여러 문제를 해결하기 위해 개발되었다. 단백질 캡처 및 정화에 거의 모든 메소드에서, 특정 단백질 (14)의 농축을 위해 사용되는 비공 유적 상호 작용 단계가있다. 이 단계에서, 단백질 및 / 또는 복잡한 프로세스를 완료하는 데 시간이 아닌 분을 필요로 특히, 확산에 의한 끊을 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 융합 단백질은 특히 신속하고 비가 역적으로 입자 표면 또는 형광체 9가 될 수있는 그것의 리간드와 상호 작용하도록 설계되었다. 그 때문에이 그 리간드에 결합되면, 다른 친 화성 태그에 비해 가장 차별화 요인 중 하나이며, 이는 바인딩 남아있다. 또한 여기에 입증하는 기능입니다리간드 9 (그림 1) 교류 가능합니다 하나의 구조로 서로 다른 생물학적 문제를 해결하기 위해. 예를 들어, 단백질 상호 작용 또는 기능을 심문하기 위해, 표면의 리간드 단백질이나 단지의 캡처 (그림 1)에 사용됩니다. 별도의 실험에서, 같은 융합 단백질 형광 세포의 현지화, 인신 매매, 또는 단백질 회전율 (그림 1) 공부를 표시 할 수 있습니다. 그것은 리간드가 돌이킬 수없는, 그것은 표면 또는 형광인지, 바인딩 때문에 다른 리간드 다음 이후에 같은 실험에 바인딩 할 수 없습니다 그러나 그 한 번 기억하는 것이 중요하다.
단백질 상호 작용을지도하는 기존 기술의 분석은보다 효율적으로 과도하거나 낮은 풍부 1,6,7,14,15에있는 사람들을 포함하여 특정 상호 작용을 분리하는 어려움을 알 수있다. 다수의 그룹에 의해 또한, 최근 작업설정 해제는 전통적인 분리 방법 내에서 특히 인간 단백질 체학의 영역에서, 질량 분광 분석 (16)의 진정한 인터랙로부터 신호를 마스크 할 수 단백질 오염물의 상당수가 있다는 우려를 나타낸다. HaloTag 단백질과 잘 자사의 공동 개발 수지 주소 이러한 문제를 위해 개발 된 속성. 복합체 소재의 결합 복합체 풀다운위한 프로토콜 (도 1)는, 모두 복잡한 캡처를 촉진하고 비특이적 8 결합의 수준을 감소, 15 분에서 달성 될 수있다. 또한, 비가 역적으로 결합 낮은 풍부한 단백질의 효율적인 캡쳐를 허용하고 훨씬 더 적은 세포의 사용을 허용한다, 다시 배경 8을 감소시킨다. 복합체의 포획이 설정되면, 프로토콜은 복잡 무결성을 유지하기 위해 온화한 세척 조건을 포함한다. 캡처 단지의 용출 방법이 하류 항문의 목표에 의해 결정됩니다 두 가지 방법과 선택하여 수행 할 수 있습니다ysis. 욕구 분석 또는 웨스턴 블롯 또는 질량 분석에 의해 상호 작용하는 단백질을 발견 할 수 있다면, 그것은 이러한 SDS 또는 요소 (그림 1)과 같은 변성제와 복합체를 용출하는 것이 좋습니다. 이것은 원래 HaloTag에 융합 단백질이, 미끼 단백질이라고으로, 수지에 결합 된 뒤에 남아 있고, 따라서 질량 분석에서 검출 된 펩티드의 인구를 지배하지 않습니다 질량 분석에 특히 유리하다. 이것은 또한 미끼 단백질 가능성이 서양 얼룩, 다른 비 공유 결합 친 화성 않는 정화 또는 공동 immunoprecipitations에 비해 유의 한 차이에 의한 분석에 표시되지 않습니다하지만 것을 의미한다. 목표는 기능 연구를 위해 사용되는 복잡한 그대로를 정화하는 경우, 용출은 융합 단백질 및 미끼 단백질 (도 1) 사이에 인코딩 된 동족 절단 시퀀스를 인식 TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제를 사용하여 수행 될 수있다. 티HESE 샘플은 질량 분석법에 의해 분석 될 수 있지만 나중에 바와 같은, 그들은 하부 풍요의 검출, 특정 인터랙 못할 수도 미끼 단백질의 상당한 양을 포함 할 것이다.
여기서 우리는 두 가지 중요한 치료 적 단백질, bromodomain 단백질 BRD4와 히스톤 디 아세틸 라제, HDAC1 17에 적용 풀다운 및 이미징 프로토콜을 제시한다. 질량 분석, HDAC1 복잡한 분리 한 후 효소 활성, 그리고 모두를위한 적절한 세포 지방화에 의해 결정으로 우리는 예상 파트너와 이러한 예, 상호 작용을 보여 주었다. 함께, 이러한 결과는 진핵 생물의 단백질 상호 작용과 기능의 특성에 대한 기술의 다기능 자연과 강도를 보여줍니다.
Protocol
참고 : 다음 프로토콜은 HaloTag의 융합과 선택 안정적으로 또는 일시적으로 형질의 세포 라인에서 사용할 수 있습니다. 이러한 예를 들어, 우리는 HEK293T이나 헬라 세포에 HaloTag 융합의 일시적인 형질에 대한 프로토콜을 제공 할 것입니다. 모든 실험을 위해, 우리는 단백질 만 컨트롤의 사용을 권장합니다.
1. 융합 단백질 발현 테스트
- 융합 단백질의 구조를 얻
- 미리 만들어진 HaloTag 융합 벡터를 얻거나 기존의 벡터를 사용하여 구성합니다. 사용할 구문에 대한 자세한 내용은 특정 시약의 표를 참조하십시오.
- 모든 복제본을 만드는 경우, DNA 염기 서열을 확인하는 것이 좋습니다.
- 융합 단백질의 발현 및 제어 테스트 :
- 각 샘플의 경우, 1X SDS 로딩 염료 버퍼 250 μL 준비 (60 MM 트리스 HCL pH6.8를, 825 MM은 파란색, 12.5 % 글리세롤, 100 mM의 디티 오 트레이 톨, 0.5 % SDS를 브로 모 페놀).
- 각각의 융합 단백질및 제어, 표준 24 웰 플레이트에 2-4 × 105 세포 / ml의 농도에서 그들의 적절한 미디어 HEK293T 또는 HeLa 세포 0.5 ㎖를 접시.
- 권장 한 후 형질, 37 ° C에서 18 ~ 24 시간 및 5 % CO 2 알을 품다.
- 24 시간 후 형질 잘 각각의 미디어에 5mM의 테트라 메틸 로다 민 (TMR) 리간드의 0.5 μl를 추가하고 부드럽게 판을 섞는다.
- 37 ° C에서 5 % CO 2, 15 분에 대한 리간드를 포함하는 형질 전환 세포를 품어.
- 대기음 오프 미디어 리간드를 포함하고 1 ㎖ RT PBS로 가볍게 세포의 각 잘 씻는다.
- PBS 대기음 및 1 ㎖ RT PBS로 두 번째 세척을 수행합니다.
- PBS를 제거하고 세포에 직접 염료 버퍼를로드 1X SDS의 200 μl를 추가합니다.
- 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 플레이트에서 피펫 해물.
- 95 ℃에서 5 분 동안 해물을 끓여
- SDS-PAGE 젤 상 반응 및 부하의 5 ~ 10 μl를 제거합니다.
- 형광 검출 스캐너를 사용하여(TMR 여기 : 555 nm의 방출 : 585 nm의) 대역을 감지 할 수 있습니다. 표준으로 형광 단백질 마커를 사용합니다.
- 형광 검출 스캐너를 사용할 수없는 경우, 미끼 단백질 또는 융합 단백질의 발현을 검출하는 단백질 융합 태그 중 하나에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 말을 수행한다.
2. 단백질 풀다운
- 일시적으로 형질 세포의 준비 :
- 각각의 융합 또는 제어 3-4 × 10 5 세포 / ㎖ 또는 1 ~ 1.2 × 10 7 세포 총 당 구조에서 세포를 30 ㎖ 한 15cm 접시를 준비하십시오.
- 37 ° C에서 18 ~ 24 시간 동안 배양하고 5 % CO 2, 다음 권장 구성 형질.
- 24-48 시간 후 - 형질 전환 한 후, 미디어를 제거하고 부드럽게 얼음 차가운 PBS의 20 ~ 25 ㎖의 세포 층을 씻는다.
- PBS 세척을 제거한 다음, 25 ~ 30를 추가 4 ° C의 ml의 PBS를 냉각하고 부드럽게 플레이트 떨어져 세포를 다 쳤어요.
- 원뿔 튜브와 원심 분리기로 세포를 수집2,000 XG에 5 ~ 10 분, 4 ° C.에 대한 FUGE
- 뜨는을 취소하고 30 분 또는 최대 6 개월의 최소 -80 ° C에서 세포 펠렛을 배치합니다.
- HaloLink 수지의 평형 :
- 각각의 융합 또는 제어 샘플은 수지 평형 / 워시 버퍼의 12 ML 준비 (100 MM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 150 mM의 염화나트륨을, 0.005 %의 IGEPAL CA-630) 참고. 레진을 사용하는 것이 매우 중요합니다 평형 버퍼 희석 IGEPAL CA-630과 같은 12 시간 이내에이 기간 이후 안정 또는 효과가 없습니다.
- 부드럽게 균일 한 현탁액을 얻기 위해 수지를 흔들거나 혼합.
- 각각의 풀다운 실험을 위해, 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 수지의 200 μl를 분배.
- 800 XG에 1 분 (예를 들면, 마이크로 원심 3,000 RPM), 원심 분리, 조심스럽게 제거하고 관의 바닥에 수지를 방해하지 않고 상층 액 (에탄올)을 버린다.
- 수지 평형 / 워싱턴의 800 μl를 추가합니다SH 버퍼링 튜브를 여러 번 반전시킴으로써 철저히 혼합.
- 800 XG에 2 분 동안 원심 분리 한 후 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다.
- 반복 3 세척 총 2.2.5과 2.2.6 두 번 더 반복합니다.
- 마르지 수지를 방지하기 위해 아래에 설명 된 세포 용 해물 (2.3.8 단계)를 추가 할 준비가 될 때까지 최종 세척 또는 상층 액을 제거하지 마십시오.
- 바인딩 및 융합 단지의 세척 :
- 각 샘플의 경우, 500 포유류의 용해 완충액 (50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 1 % 트리톤 X-100, 0.1 % 나 옥시 콜레이트)의 μL 및 1X TBS 완충액 1 ㎖를 준비 (100 mM 트리스 - 염산 pH를 19.1 및 150 mM의 염화나트륨).
- 로 pipetting 아래로 또는 간단히 텍싱하여 포유류의 용해 버퍼 300 μL의 세포 펠렛을 Resuspend 및 해동.
- 50X 프로테아제 억제제 칵테일의 6 μl를 추가 (800 ㎍ / ㎖의 염산을 벤즈 아미 딘, 500 ㎍ / ㎖의 페난 트롤 린, 500 ㎍ / ㎖의 아프로 티닌, 500 ㎍ / ㎖의 류 펩틴, 500 & #. 181; ㎍ / ㎖ 펩 스타틴의 50mm PMSF) 주 : 이러한 단백질 융합 태그 바인딩 방해로 AEBSF을 포함 단백질 분해 효소 칵테일을 사용할 수 없습니다.
- 3 μL의 RQ1의 DNA 분해 효소를 추가하고 실온에서 10 분 동안 반전.
- 유리 균질 2.0 ㎖의 크기 다운스; . 25-30 얼음 치기, 또는 25 또는 27 G 바늘을 통해 세포를 통과 ~ 10 번 용해를 완료하기 위해 참고 : 초음파 처리는 단지 떨어져 떨어질 수 있으며 과열 단백질 융합 태그 활동에 영향을 미칠 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 해물을 취소하는 4 ° C에서 5 분 14,000 XG에 원심 분리기.
- 얼음에 새로운 관과 장소에 분명 해물, 약 300 ㎕의 총 부피를 전송합니다.
- 1X TBS 버퍼의 추가 700 μl를 해물을 취소하고 아래로 피펫 팅과 잘 혼합에 추가.
- 2.2.8 단계에서 제조 평형 수지 튜브를 타고 튜브의 바닥에 수지를 방해하지 않고 수지로 최종 세척 / 뜨는을 제거합니다.
- 각 TU에 추가수지, 희석 용해 액의 1 ㎖의 수.
- 22 ° C. 주에서 15 분 동안 튜브 회전 (또는 부드러운 믹서)에 혼합으로 품어 :이 시간 동안 수지의 안정화가 결합 효율을 감소시킨다. 4 ° C에서 바인딩이 필요한 경우, 1 시간 동안 혼합하여 이렇게.
- 800 XG에 2 분 및 뜨는 폐기 원심 분리기 수지 튜브.
- 단계 2.2.1에서 만든 수지 평형 / 워시 버퍼 1 ML을 추가하고 손으로 여러 번 수지 튜브를 반전하여 잘 혼합.
- 800 XG에 2 분 및 세척을 버리고 원심 분리기 수지 튜브.
- 2.3.12는 2.3.14 세 번 더 추가로 다음 단계를 반복합니다.
- 수지 평형 / 워시 버퍼 1 ML을 추가하고 일정한 회전 5 분 동안 22 ° C에서 알을 품다.
- 800 XG에 2 분 및 세척을 버리고 원심 분리기 수지 튜브.
- 최종 애플리케이션에 따라 (자세한 설명은 소개를 참조하십시오), 2.4 또는 2.5 중 하나를 진행합니다.
- 에스변성 젤, 서양 말, 또는 질량 분석을위한 DS 용출 :
- 50 μL SDS 용출 버퍼에 각 시료로부터 (1 % SDS, 50 mM 트리스 - 염산 pH7.5)를 수지에 resuspend
- 30 분 동안 RT에서 튜브를 흔들어.
- 분석을위한 새로운 튜브에 800 XG 및 전송 용출액에서 2 분 동안 원심 분리기.
- 서양 얼룩 또는은 얼룩 젤, SDS 변성 겔에 부하 5 ~ 10 μL.
- 질량 분석의 경우, -20 ℃에서 각 샘플의 40 μl를 저장
- 기능 분석, 서부 말, 또는 질량 분석을위한 TEV 단백질 분해 효소의 용출 :
- 마지막 세척을 제거한 후, 50 μL의 ProTEV 절단 버퍼와 TEV 효소 30 단위로 수지를 재현 탁.
- 1 시간 동안 진탕 25 ° C에서 알을 품다.
- 800 x g에서 2 분간 원심 분리기.
- 신선한 튜브에 용출액을 전송합니다.
- 기능 분석에 즉시 사용할 4 ° C에서 저장 샘플.
3.세포질과 핵 투과 리간드를 사용하여 찬란 레이블 된 융합 단백질의 세포 이미징
- 형질, 레이블 및 이미지 셀 :
- × 10 5 세포 / ml 1-2의 밀도 각 융합 단백질 또는 제어, 각 웰에서의 적절한 미디어에서 HeLa 세포의 플레이트 400 μL에 대한 8 잘 챔버 커버 글라스합니다.
- 권장 한 후 형질, 37 ° C에서 18 ~ 24 시간 및 5 % CO 2 알을 품다.
- 18 ~ 24 시간 후 - 형질 전환 한 후 각 웰에이 용액 100 μl를 추가하고 부드럽게 혼합, TMR 리간드 적절한 세포 미디어에서 1:200 희석.
- 37 ° C에서 5 % CO 2, 15 분에 대한 리간드를 포함하는 형질 전환 세포를 품어.
- 리간드와 37 ° C로 예열 된 단백질 융합 태그 리간드를, 부족한 적절한 미디어 500 μL로 교체를 포함하는 대기음 오프 미디어
- 총 3 회 세척 두 번 반복합니다.
- (다시 인큐베이터에 세포를 넣고 376, C와 5 % CO 2) 30 분.
- 기음 오프 미디어 및 37 ℃로 예열 한 해당 매체의 500 μL로 교체
- 적절한 획득 파라미터 (: 555 nm의 방출 : 585 nm의 여기 TMR)를 사용하여 현미경 이미지.
Representative Results
새로운 융합 단백질로 작업 할 때, 형질 전환 후 그 단백질의 발현에 대한 첫 번째 테스트에 대한 중요하고도 적절한 분자량의 단백질이 생성되고 있음을 확인합니다. HaloTag 융합 단백질은 형광 및 공유 투과성 또는 지역화 따라 불 투과성 리간드로 표지 될 수있는 바와 같이, 신속 fluorimager에 주사 하였다 겔 전기 영동을 변성에 세포 용 해물을 적용하여 식을 결정하는 것이 가능하다. 1.2 절, 헤일로 - BRD4 (189 kD의)의 표현과 HaloTag 혼자 컨트롤 (Ctrl 키) 관찰 (34 kD의, 그림 2A)에 설명 된 프로토콜을 사용하여. 프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 융합 단백질의 발현은 항-HaloTag 항체 전통적인 서 말을 사용하여 검출 될 수 있고, 또는 사용 가능한 경우, 미끼 단백질에 대한 항체. 가능하다면, 그것은 그것이 t보다, 특정 빠르고, 쉽게로 대신 형광 리간드를 사용하는 것이 좋습니다한 항체 검출 및 10도 양적.
적절한 전장 융합 단백질의 발현이 확인 된 후, 단백질 풀다운이 수행 될 수있다. 높은 재현성을 보여 SDS (프로토콜 2.4)으로 용출 헤일로 - BRD4 Ctrl 키 풀다운의 생물은 복제의 실버 스테인드 젤은 그림 2B에 표시됩니다. 실버 얼룩 겔은 단백질의 상당수가 BRD4 단백질과 제어 (그림 2B)에서 매우 낮은 배경과 상호 작용 발견 보여줍니다. 서론에서 언급 한 바와 같이이 공유 결합 된 상태를 유지하는 용출이 과정에서, 헤일로 - BRD4 수지에서 용출되지 않습니다. 따라서 중요한 밴드 실버 스테인 (도 2b) 또는 웨스턴 블롯 (데이터 미도시)에서 감지되고이 분자량에 없습니다. 이 단백질은 BRD4에 특정 있는지 확인하려면, 액체 크로마토 그래피 질량 분석 (LC-MS/MS)은 C에서 수행 된SDS 용출 후의 omplex 혼합물. 스펙트럼 수와 정규화 된 스펙트럼의 풍부한 요소 헤일로 - BRD4 질량 분석 분석에서 발견 BRD4 18-20 알려진 인터랙 터들을위한 (NSAF) 값은 그림 2C에 표시됩니다. pTEFb (18, 20)의 구성 요소와도 BRD9 19 단백질의 높은 풍부한 BRD4 단지의 특정 캡처를 확인합니다. 실버 얼룩 젤 (그림 2B)에 의해 예측 된 바와 같이, 많은 다른 단백질도 제어 (데이터가 표시되지 않음)에서 관찰되지 않았다 BRD4의 잠재적 인 인터랙로 확인되었다. 이러한 이전에 알려지지 않은, 그들은 단백질 진정한 인터랙인지 확인하기 위하여 독립적으로 다른 방법에 의해 확인 될 필요가 있고, 그렇게하면, 직접 또는 간접적 BRD4 연결된 경우.
고립 된 단지는 (은) 활동에 대한 공부를 할 수있다; 그들이 functionali을 유지하도록 TEV 단백질 분해 효소 (프로토콜 2.5 절)을 사용하여 복합체를 용출 추천합니다타이. 그림 3A, TEV 단백질 분해 효소를 이용하여 수지에서 발표 헤일로 - HDAC1 풀다운 단지의 실버 얼룩 젤에 표시됩니다. TEV 단백질 분해 효소가 단백질 융합 태그와의 융합 파트너, 미끼 단백질의 상당한 양이 경우 HDAC1가 관찰된다 (도 3a) 간의 링커 영역에서 절단되는 바와 같이. 이 부분은 HDAC1 활동을 포함하는지 확인하려면 용출 TEV 샘플 발광 HDAC 분석, HDAC 저런 형광 21에서 테스트되었다. 도 3b에 도시 된 바와 같이, HDAC1 풀다운 샘플 HDAC1 활성의 높은 수준 구체적 공지 HDAC 억제제, SAHA 22 (칼럼 2)에 의해 억제되었다 (칼럼 1)를 보였다. 컨트롤이 더 특이성을 설명하는 바와 같이, 더 HDAC 억제는 관련 시르 투 인 가족 억제제, EX-527 22 (3 열)과 신호가 (4 열) 추가 HDAC1 풀다운 샘플없이 단독으로 버퍼를 사용하여 검출되지 않았다 관찰되지 않았다.
함수의 중요한 구성 요소알 단백질 체학 및 이해 단지는 또한 단백질 현지화 및 / 또는 인신 매매를 이해하는 것입니다. 이와 같은 융합 구조는 형광 세포 내부에 표시 할 수있다, 우리는 공 촛점 이미징을 사용하여 지역화를 감시. 제 3의 프로토콜에 따라, 일시적으로 헤일로 - BRD4 (그림 4A) 및 헤일로 - HDAC1 (그림 4B)로 형질 전환 된 HeLa 세포는 형광 TMR 리간드로 표지와 몇 군데 있었다. 도 4a 및도 4b에 도시 된 바와 같이, 모두 17 예상대로 핵 지역화. 이러한 데이터는 태그의 존재가 융합 파트너의 생리 세포 현지화를 변경하지 않았 음을 보여줍니다.
그림 1. 단백질 풀다운 및 공 촛점 이미징 애플리케이션의 개략도.로 사용 화롯불은 포유 동물 세포에서 단백질의 기능을 이해하기위한 여러 응용 프로그램을 구성 할 수 있습니다. 모든 경우, 헤일로 융합 구조체는 하나 안정적으로 또는 일시적으로 부착 또는 현탁액 포유 동물 세포에서 발현이다. 단백질 복잡한 풀다운를 들어, 세포는 다음 단지가 공유 수지에 포착되고, 용해되고, SDS 용출 (왼쪽 통로) 또는 TEV 절단 (오른쪽 통로) 중 하나를 통해 용출. TEV 절단이 기능 분석을 수행하기위한 최적의 상태에서 SDS의 용출, 질량 분석기 분석을 진행하는 것이 좋습니다. 표현, 세포 현지화, 인신 매매 사건, 또는 단백질 회전율의 특성을, 융합 단백질을 발현하는 살아있는 세포는 형광 표지 및 추가 SDS 페이지 젤 또는 공 촛점 이미징을 사용하여 분석 하였다. 두 세포 투과성 또는 불 투과성 형광 리간드는 세포 내에서 융합 단백질의 지역화 또는 프리젠 테이션에 따라 사용할 수 있습니다.
igure 2 "FO : 콘텐츠 너비 ="6 인치 "SRC ="/ files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "폭 ="600 "/>
그림 2. 헤일로 - BRD4 단백질 발현, 풀다운, 그리고 질량 분석 분석. TMR 리간드 (프로토콜 2.1)으로 표시 HEK293T 세포 용 해물 내 헤일로 - BRD4 융합 단백질, 189 kD의, 혼자 헤일로 단백질 융합 태그, 34 kD의 제어 (Ctrl 키)의 표현을 보여주는 (A) SDS PAGE 젤. 젤이 검출 fluorimager으로 스캔하고, 형광 분자량 마커가 사용되었다. (B) SDS로 용출 헤일로 - BRD4 Ctrl 키 샘플의 풀다운 생물학적 반복 실험의 실버 얼룩 젤. 분자량 크기는 젤에 표시됩니다. (C) 스펙트럼 계수 (왼쪽 패널)와 단백질 헤일로 - 생물은 복제의 질량 분석 분석에서 확인 된 단백질의 분자량 계정 정규화 된 스펙트럼 풍부 요인 (NSAF) 값 (오른쪽 패널) BRD4 Ctrl 키. 제시된 승 상호 작용을하는 것으로 알려진 단백질pTEFb (CDK9 및 사이클린 T)의 요소 (18, 20)뿐만 아니라 BRD9 19 등 i 번째 BRD4. 이 단백질로부터 펩티드는 Ctrl 키에서 발견되지 않았다.
그림 3. 헤일로 - HDAC1 복잡한 분리 및 활동 분석. (A) TEV 절단 한 후 Ctrl (프로토콜 2.5 절)에서 헤일로 - HDAC1 단지와 배경의 분리를 보여주는 실버 얼룩 젤. 눈에 띄는 HDAC1 밴드 (55 kDa의)와 TEV 단백질 분해 효소 밴드가 표시되어 있습니다. 무료 HDAC1는 수지 (그림 1). (B) 그래프 발광 히스톤 디 아세틸 라제 분석, HDAC에서 HDAC1 복잡한 아이솔레이션 샘플의 활동을 보여주기에 캡처 후 HaloTag 및 HDAC1 융합 시퀀스 사이의 최적화 된 링커에서 TEV 절단에 의해 생성되는 21 GLO. 그래프의 열 1은 높은 패를 보여줍니다헤일로 - HDAC1 풀다운 샘플 (HDAC1)에 포함 된 HDAC 활동 evels. 2 열이 활동은 특히 HDAC1 풀다운 샘플, HDAC 억제제, 사하구 (22)의 첨가에 의해 감소 될 수있다 보여준다. 컨트롤로, 3 열은 시르 투 인 가족에 특정 아세틸 라제 억제제를 보여줍니다,하지만 HDACs, EX-527 22 HDAC1 활동 및 열 4는 아무런 활동이 단독으로 버퍼를 사용하여 관찰되지를 저해하지 않습니다.
그림 4. 헤일로 - BRD4 헤일로 - HDAC1 공 초점 이미지. 헤일로 - BRD4 (A) 또는 헤일로 - HDAC1 찬란 TMR 리간드로 표지 (B)로 형질 전환 된 HeLa 세포의 세포 공 촛점 이미징을 살고 있습니다. (A) 헤일로 - BRD4 표현이 제한됩니다 핵 및 (B) 헤일로 - HDAC1 식에 주로 NUC입니다리어. 패널의 왼쪽은 형광 채널과 오른쪽은 각각 DIC 채널을 형광 채널의 오버레이입니다. 이미지는 적절한 필터 세트를 사용하여 37 ° C + CO 2 환경 챔버가 장착 된 공 초점 현미경에 인수되었다. 스케일 바는 20 μm의를 =.
Discussion
두 개의 융합 단백질, 헤일로 - BRD4 및 헤일로 - HDAC1, 표현 진핵 포유 동물 세포에있어서, 단백질 복잡한 분리 및 활동, 및 세포 현지화 여기에 소개하고 있습니다. 이러한 다양한 프로토콜을 통해 작업, 각 실험의 성공을 위해 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 자체가 생리를 유지하기위한 중요 할 수있는 태그의 융합 단백질 발현 수준과 배치를 가진 경우가있는 바와 같이. 그것은 사전 지식 또는 다른 태그와 함께 작동 선택의 특정 단백질에 대한 입증되지 않은 경우 N-및 / 또는 C-말단 융합 설계해야 할 필요가 있다고 생각하는 것이 중요하다. 레벨이 너무 높으면 식 대하여, DNA의 희석은 적절한 수준을 달성하기 위해 더 약한 프로모터와 벡터의 형질 감염 또는 사용중 가능 수행 될 수있다. 이전 작업은 내생 르에서 고분자 복합체의 효율적인 분리를 보여주는 수행 한표현의 매우 낮은 수준에서 작업을 가능하게 표현 8 VELS. 가능하면, 셀룰러 지역화 연구는 또한 적절한 생리 필요한 태그 최적 배치 위치뿐만 아니라 상대적 발현 수준으로 통찰력을 제공 할 수있을 것이다.
융합 단백질은 가장 큰 장점 중 하나로서 복잡한 분리의 속도가, 그 바인딩, 용해에 권장 시간 프레임을 수행하는 것이 매우 중요 프로토콜 및 세척 섹션으로 최대의 성공을 얻으려면 풀다운 실험 준비가되면 과정. 다음 단계 중 하나가 시간을 길게하는 경우 등이 항체 기반의 캡처 방법이 필요합니다,, 복잡한 연결 해제의 위험 또는 8 바인딩 증가 비 특이성이있다. 시간이 세포의 용해 또는 바인딩 중에 단축된다 마찬가지로 경우, 세포가 완전히 용해 또는 효율적으로 각각 캡처 할 수 없습니다. 세척의 수가 DECR 경우완화 또는 수지의 양호한 혼합이 바인딩 또는 세척 동안 발생하지 않으며, 그 후에 비 특정 단백질의 배경 수준은 증가 될 것이다. 또한, 용해의 수단은 수지에 결합 효율에 관련된 매우 중요합니다. , 샘플을 초음파 처리 권장 세제를 제거 SDS 또는 기타 강한 세제를 추가 및 / 또는 단백 분해 효소 억제제 AEBSF을 포함하는 시도는 감소 또는 수지에 융합 단백질 및 그 복합체의 결합의 손실이 발생할 것입니다.
포유 동물 세포와 질량 분석기 (16)에 의해 분석의 배경을 줄이는 문제와 인간 단백체 분석 투쟁 복잡한 격리를위한 기존의 방법. 이 오염 단백질의 저장소가 많은 질량 분석 그룹 (16)에 의해 생성 된 너무 큰했습니다. 질량 분석 풀다운 시료에서 배경의 식별을 방지 아무것도 정의 될 수있다미끼 단백질의 진정한 인터랙. 이와 같이, 배경이 비 특정 단백질 또는 미끼 또한 단백질 또는 미끼 단백질을 침전에 사용 된 항체의 농도가 큰 오염으로부터 발생할 수있다. 많은 작업은 여기에 제시된 풀다운 프로토콜뿐만 아니라 풀다운 프로세스 비특이적 오염 단백질의 수준을 최소화하는 수지 모두를 최적화로 이루어졌다. 이 실버 얼룩 젤과 컨트롤의 질량 분석 분석 (그림 2)에 분명하다. 미끼 단백질 또는 다른 방법 투쟁되는 오염 물질로 동일하게 유해 할 수있는 항체의 높은 수준의 문제를 해결하기 위해, SDS의 용출과 풀다운은 (프로토콜 2.4)을 추천합니다. 때문에 수지에 공유 결합으로,이 과정은 공유 결합 수지에 부착 초기 융합 단백질의 대부분을 남겨 둘 것이다. 미끼의 작은 비율 믿고 질량 분광 분석에서 관찰가수 분해를 통해 발생하는,하지만 다른 약한 또는 과도 상호 작용 (8)의 검출에 문제가되지 않습니다.
서론에서 언급 한 바와 같이, 단백질 체학에서 상당한 발전이 질량 분석 1.7에서 상당한 진보가 활성화되었습니다. 따라서, 풀다운에서 얻어진 단백질의 혼합물을 deconvolute 질량 분광 분석의 선택의 중요한 파라미터를 강조하는 것이 중요하다. 계측은 견고하고 일상적 효율적 <1 μg보다 덜 자주 단백질의 소량을 함유하는 샘플을 분석 할 수 있어야한다. 100-300 NL / 분 범위의 유속으로 50 ~ 75 ㎛의 내부 지름 HPLC 컬럼을 포함하는 나노 스케일 크로마토 그래피는 일반적으로 작은 샘플 크기와의 호환성을 위해 채용되며, 질량 분석 장치의 감도를 최대화하기 위해. 하나의 분석 상태 O를 획득 한 정보를 최대화하려면F 상기 나노 분리와 호환되는 시간 척도, ≥ 10 Hz에서 높은 해상도의 질량 스펙트럼을 획득 할 수있는 예술의 질량 분석기는 일반적으로 사용된다. 이 장비는 감도 아토 몰 수준이 일상적으로 서브 ppm의 전구체 및 제품 이온 질량 오류 허용 오차 데이터를 수집 할 수 있습니다. 이러한 성능 특성은 단백질의 식별 번호의 수율 및 그 동정과 관련된 신뢰를 증가시키는 역할을한다.
새로운 상호 작용의 발견 가능성과 함께 단백질 상호 작용, 모든 하나의 구문을 사용하여 활성 물질의 분리 :이 자료로 우리는 생리 세포 현지화, 적절한 단백질을 보여줍니다. 실제로 대체 기술은 있지만, 그렇지 않은 모든 23,24, 이러한 다양한 측면의 각각에 대해 사용될 수있다. HaloTag 기술, 다기능 방법은 proteom 발전, 이용 될 수있다ICS 연구 및 포유 동물 세포에서 단백질 기능의보다 완전한 이해를 얻을 수있다.
Disclosures
이 기사에 대한 출판 비용은 프로 메가 사에 의해 후원됩니다. Danette L. 다니엘스, 재키 멘데스, 헬렌 Benink, 앤드류 나일 스, 낸시 머피와 Marjeta Urh는 프로 메가 공사, HaloTag 기술과 그 응용의 특허를 할당하여 상업 소유자의 직원입니다. 마이클 포드, 리처드 존스, 라비 Amunugama, 데이비드 알렌은이 원고에 기술 된 질량 분석 서비스를 제공 MSBioworks의 직원입니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 중요한 읽기 닥터 마틴 로젠버그 박사 게리 타 플레이, 박사 키스 우드이 작품의 지원, 박사 제임스 칼리 감사합니다. DLD, JM, HB, NM,, JC, 그리고 MU는 프로 메가 코퍼레이션의 직원입니다. MF, RJ, RA 및 DA는 MS 바이오 웍스 (Bioworks), LLC의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
| HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
| Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
| PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
| HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
| HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
| HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
| HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
| HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
| HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
| ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
| HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
| PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
| 4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
| Ethanol | |||
| Tissue culture vessels and dishes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
| Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
| Microcentrifuge | |||
| Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
| Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
| Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
| Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
References
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).
- Tyers, M., Mann, M.
- Coulombe, B., et al. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Sardiu, M. E., et al. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).
- Domon, B., Aebersold, R.
- Daniels, D. L., et al. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).
- Encell, L. P., et al. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).
- Ohana, R. F., et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).
- Black, J. C., et al. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).
- Deplus, R., et al. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).
- Galbraith, M. D., et al. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).
- Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).
- Rahman, S., et al. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).
- Yang, Z., et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).
- Halley, F., et al. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).
- Mack, G. S.
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).
- Urh, M., Rosenberg, M. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).
