Summary
Tecnología HaloTag es una tecnología multifuncional que ha mostrado un importante éxito en el aislamiento de pequeñas y grandes complejos de proteínas a partir de células de mamíferos. Aquí destacamos las ventajas de esta tecnología en comparación con las alternativas existentes y demostrar su utilidad para el estudio de numerosos aspectos de la función de las proteínas dentro de las células eucariotas.
Abstract
La investigación en proteómica se ha disparado en los últimos años con los avances en las capacidades de espectrometría de masas que han llevado a la caracterización de numerosas proteomas, incluidos los de los virus, bacterias y levaduras. En comparación, el análisis del proteoma humano va a la zaga, en parte debido a la gran cantidad de proteínas que deben ser estudiadas, sino también la complejidad de las redes e interacciones estos presentes. Para abordar específicamente los desafíos de la comprensión del proteoma humano, hemos desarrollado la tecnología para el aislamiento de proteínas HaloTag, particularmente fuerte para el aislamiento de complejos multiproteicos y permitiendo la captura más eficiente de las interacciones y / o proteínas débiles o transitorios de baja abundancia. HaloTag es una etiqueta codificada genéticamente la proteína de fusión, diseñado para covalente, específica, y la inmovilización rápida o etiquetado de proteínas con diversos ligandos. Aprovechando estas propiedades, numerosas aplicaciones para células de mamíferos se desarrollaron con el carácterize función de las proteínas y aquí presentamos metodologías que incluyen: proteínas desplegables utilizados para el descubrimiento de nuevas interacciones o ensayos funcionales y localización celular. Nos encontramos ventajas significativas en la velocidad, la especificidad, y la captura covalente de proteínas de fusión a las superficies para el análisis proteómico en comparación con otros enfoques tradicionales no covalentes. Demostramos estos y la amplia utilidad de la tecnología que utiliza dos proteínas epigenéticas importantes como ejemplos, la proteína humana bromodomain BRD4 y HDAC1 histona deacetilasa. Estos ejemplos demuestran el poder de esta tecnología para permitir el descubrimiento de nuevas interacciones y caracterización de la localización celular en eucariotas, que lo haremos juntos una mayor comprensión de la proteómica funcional humanos.
Introduction
La comprensión de la función celular, la respuesta a los estímulos, y los cambios en el desarrollo y / o estados de enfermedad está estrechamente ligada a de-convolución del proteoma largo de estos diferentes estados dinámicos 1,2. Mucho se ha hecho para entender el proteoma de los organismos inferiores, sin embargo, dado el número de proteínas y todas las posibles interacciones, esto ha sido muy difícil hacer frente a la proteoma humano 1,3-7. Los avances en la espectrometría de masas han permitido en gran medida la capacidad de realizar estos estudios, y aquí presentamos un avance adicional y significativa con el desarrollo de la tecnología HaloTag tanto para la captura eficiente de los complejos de proteínas y caracterización funcional de las proteínas humanas a partir de células de mamíferos 8-10. Esta tecnología ha sido demostrado recientemente en varios estudios a ser un factor crítico para el descubrimiento de interacciones importantes, lo que permite para la penetración en la novela función de la proteína y understanding de la enfermedad 11-13.
La proteína de fusión HaloTag fue inicialmente desarrollado para hacer frente a varios desafíos de las etiquetas y los anticuerpos en relación con la captura de proteínas, purificación y etiquetado 8-10 afinidad tradicionales. Dentro de casi todos los métodos para la captura y purificación de proteínas, hay una etapa de interacción no covalente que se utiliza para el enriquecimiento de una proteína particular 14. Durante este paso, la proteína y / o complejos pueden disociarse debido a la difusión, especialmente si el proceso requiere horas en lugar de minutos para completar. Para abordar esta preocupación, la proteína de fusión fue específicamente diseñado para interactuar rápida e irreversiblemente con sus ligandos, que pueden ser o bien partículas, superficies o fluoróforos 9. Por lo tanto, una vez que se une a su ligando, que permanece unido, que es uno de los factores más diferenciador en comparación con otras etiquetas de afinidad. También se ha demostrado aquí, es la capacidadpara hacer frente a diferentes cuestiones biológicas con una única construcción, lo cual es posible por ligandos 9 (Figura 1) alterna. Por ejemplo, para interrogar a las interacciones de proteínas o de la función, ligandos de la superficie se utilizan para la captura de proteínas o complejos (Figura 1). En un experimento separado, la misma proteína de fusión puede ser marcado con fluorescencia para estudiar la localización celular, el tráfico, o rotación de proteínas (Figura 1). Es importante recordar, sin embargo que una vez que un ligando está unido, si se trata de una superficie o un fluoróforo, es irreversible y por lo tanto otros ligandos no puede entonces ser ligado posteriormente en el mismo experimento.
Análisis de las tecnologías existentes para mapear las interacciones proteína revela la dificultad de aislar de manera eficiente las interacciones específicas, incluidos los que son más transitoria o están en menor abundancia 1,6,7,14,15. Además, el trabajo reciente realizado por numeroso grupos muestra la preocupación de que dentro de los métodos de aislamiento tradicionales, particularmente en el área de la proteómica humanos, hay un número significativo de contaminantes proteicos que pueden enmascarar las señales de los verdaderos interactores en el análisis de espectrometría de masas 16. Las propiedades desarrolladas para la proteína HaloTag y su dirección resina de co-desarrollado bien estas preocupaciones. En el protocolo para jalones complejos (Figura 1), la unión de los complejos se puede lograr en 15 min, tanto la promoción de captura compleja y reducir los niveles de unión no específica 8. Además, la unión irreversible permite para la captura eficaz de las proteínas de baja abundancia y permite el uso de un número mucho menor de células, reduciendo de nuevo el fondo 8. Una vez que se estableció la captura de los complejos, el protocolo incluye condiciones de lavado suaves para mantener la integridad del complejo. La elución de los complejos capturados se puede realizar por dos métodos y la elección de qué método es dictado por el objetivo de la anal aguas abajolisis. Si el deseo es analizar o descubrir proteínas que interactúan por Western blot o espectrometría de masas, entonces se recomienda para eluir complejos con desnaturalizantes tales como SDS o urea (Figura 1). Esto es particularmente ventajoso para la espectrometría de masas como la proteína originalmente fusionado a HaloTag, denominado la proteína cebo, permanecerá detrás unido a la resina y por lo tanto no va a dominar la población de péptidos detectados en la espectrometría de masas. Esto también significa sin embargo que la proteína cebo probablemente no será visible en el análisis por Western blot, una diferencia significativa en comparación con otras purificaciones de afinidad no covalentes o compañeros de inmunoprecipitaciones. Si el objetivo es para purificar un complejo intacto para ser utilizado para los estudios funcionales, la elución se puede realizar utilizando TEV (Tobacco Etch Virus) de la proteasa, que reconoce su secuencia de escisión cognado codificada entre la proteína de fusión y la proteína cebo (Figura 1). Tstos muestras también podrían ser analizados mediante espectrometría de masas, pero como se muestra más adelante, que contendrán una cantidad significativa de proteína de cebo que pueden impedir la detección de baja abundancia, interactores específicos.
Aquí presentamos los protocolos desplegables y de imagen aplicadas a dos proteínas terapéuticas importantes, la proteína bromodomain BRD4 y una histona deacetilasa, HDAC1 17. Hemos demostrado con estos ejemplos, la interacción con los socios esperados según lo determinado por espectrometría de masas, la actividad enzimática tras el aislamiento complejo de HDAC1, y localización celular adecuada para ambos. Juntos, estos resultados demuestran la naturaleza multifuncional y la fuerza de la tecnología para la caracterización de interacciones de proteínas eucarióticas y función.
Protocol
Nota: El siguiente protocolo se puede utilizar con cualquier fusión HaloTag y en cualquier línea celular de elección de forma estable o transitoriamente transfectadas. Para estos ejemplos, le daremos los protocolos para la transfección transitoria de fusiones HaloTag en células HEK293T o HeLa. Para todos los experimentos, se recomienda el uso del único control de la proteína.
1. Fusión Protein Expression Prueba
- Obtener proteína de fusión construcción:
- Obtener pre-hechos vector de fusión HaloTag o construir usando vectores existentes. Para obtener más información acerca de construcciones disponibles, por favor consulte la Tabla de los reactivos específicos.
- Si hacer cualquier clon, se recomienda para secuenciar verificar el ADN.
- Prueba de expresión de proteína de fusión y de control:
- Para cada muestra, preparar 250 l de 1X tampón de SDS colorante de carga (60 mM de Tris HCl pH 6,8, 0,75 mM de azul de bromofenol, 12,5% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,5% de SDS).
- Para cada proteína de fusióny el control, la placa 0,5 ml de HEK293T o células HeLa en su medio de comunicación adecuado a una densidad de 2-4 x 10 5 células / ml en una placa estándar de 24.
- Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, a continuación, transfectar como se recomienda.
- 24 horas después de la transfección, añadir 0,5 l de 5 mM tetra-metil rodamina (TMR) ligando a los medios de comunicación de cada pocillo y mezclar suavemente la placa.
- Se incuban las células transfectadas que contienen ligando durante 15 min a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Aspirar los medios off que contiene el ligando y lavar cada pocillo de células suavemente con 1 ml de PBS RT.
- Aspirar PBS y realizar un segundo lavado con 1 ml de PBS RT.
- Retire PBS y añadir 200 l de 1X tampón SDS Cargando tinte directamente a las células.
- Pipeta lisado de placa en 1,5 ml tubo Eppendorf.
- Hervir lisado durante 5 min a 95 ° C.
- Eliminar 5-10 l de la reacción y de la carga en gel de SDS-PAGE.
- Utilice un escáner de detección fluorescente(TMR de excitación: 555 nm, emisión: 585 nm) para detectar bandas. Utilice los marcadores de proteínas fluorescentes como estándares.
- Si un escáner de detección fluorescente no está disponible, realizar transferencias de Western utilizando anticuerpos contra cualquiera de la proteína cebo o etiqueta de la proteína de fusión para detectar la expresión de la proteína de fusión.
2. Pulldowns de proteínas
- Preparación de las células transfectadas de forma transitoria:
- Para cada fusión o control preparan un plato de 15 cm con 30 ml de células a 3-4 x 10 5 células / ml o 1 a 1,2 x 10 7 células totales por constructo.
- Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, a continuación, transfectar construir como se recomienda.
- Después de 24 a 48 horas después de la transfección, extraiga el soporte y suavemente lavar la capa de células con 20-25 ml de PBS helado.
- Retire lavado PBS, a continuación, añadir 25-30 ml de 4 ° C enfriada PBS y raspar suavemente las células de la placa.
- Recoger las células en tubos cónicos y centrifuge durante 5-10 minutos a 2000 xg y 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante y colocar sedimento celular a -80 ° C durante un mínimo de 30 minutos o un máximo de 6 meses.
- La equilibración de la resina HaloLink:
- Para cada muestra de fusión o de control, preparar 12 ml de tampón de equilibración de la resina / de lavado (100 mM de Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, y 0,005% de Igepal CA-630) Nota:. Es muy importante para realizar y utilizar la Resina Tampón equilibrador dentro de 12 horas tan diluida IGEPAL CA-630 no es estable o efectiva más allá de este marco de tiempo.
- Agite suavemente o mezclar la resina para obtener una suspensión uniforme.
- Para cada experimento desplegable, dispense 200 l de resina en un 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
- Centrifugar durante 1 min a 800 xg (por ejemplo, 3.000 rpm en una microcentrífuga), a continuación, quitar cuidadosamente y descartar el sobrenadante (etanol) sin perturbar la resina en la parte inferior del tubo.
- Añadir 800 l de resina de equilibración / Wash tampón y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces.
- Se centrifuga durante 2 minutos a 800 xg, a continuación, retire con cuidado y deseche el sobrenadante.
- Repita los pasos 2.2.5 y 2.2.6 de dos veces más para un total de 3 lavados.
- No quite el lavado final o el sobrenadante hasta el momento de añadir los lisados celulares se describen a continuación (Paso 2.3.8) para evitar que la resina se seque.
- Encuadernación y lavado de complejos de fusión:
- Para cada muestra, preparar 500 l de Tampón de Lisis de mamíferos (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% desoxicolato de Na) y 1 ml de tampón 1X TBS (100 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y NaCl 150 mM).
- Descongele los gránulos de las células y resuspender en 300 l de tampón de lisis de mamíferos mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo o brevemente vórtex.
- Añadir 6 l de 50X inhibidor de la proteasa Cocktail (800 mg / ml de benzamidina HCl, 500 mg / ml fenantrolina, 500 mg / ml de aprotinina, 500 mg / ml leupeptina, 500 & #. 181; g / ml de pepstatina A, 50 mM de PMSF) Nota: cócteles que incluyen la proteasa AEBSF no se pueden utilizar ya que estos interfieren con la etiqueta de fusión proteína de unión.
- Añadir 3 l RQ1 DNasa e invertir durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Dounce homogeneizador de vidrio con 2,0 ml de tamaño; . 25-30 golpes en el hielo, o pasar las células a través de una aguja de calibre 25 o 27 5-10 veces para completar la lisis Nota: La sonicación no se recomienda como complejos pueden desmoronarse y el sobrecalentamiento pueden afectar a la actividad de la proteína de fusión de etiquetas.
- Centrifugar a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C para borrar el lisado.
- Transfiera el lisado claro, aproximadamente 300 l volumen total, al nuevo tubo y colocar en hielo.
- Añadir a borrar lisado un adicional de 700 l de tampón 1X TBS y mezclar bien pipeteando arriba y abajo.
- Tome tubos de resina equilibradas preparado en la etapa 2.2.8 y eliminar de lavado final / sobrenadante de resina sin molestar a la resina en la parte inferior del tubo.
- Añadir a cada maser de resina, los 1 ml de lisado diluido.
- Incubar con la mezcla en un mezclador de tubo (o mezclador suave) durante 15 min a 22 ° C. Nota: La sedimentación de la resina durante este tiempo reduce la eficiencia de unión. Si se desea la unión a 4 º C, lo hacen mediante la mezcla durante 1 hora.
- Tubos de resina Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante.
- Añadir 1 ml de tampón de equilibrado Resina / Wash hechas en el Paso 2.2.1 y mezclar bien invirtiendo el tubo de resina con la mano varias veces.
- Tubos de resina Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg y deseche el lavado.
- Repita los pasos 2.3.12 2.3.14 seguidos por tres veces más.
- Añadir 1 ml de tampón de equilibración de la resina / Wash y se incuba a 22 ° C durante 5 minutos con rotación constante.
- Tubos de resina Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg y deseche el lavado.
- Dependiendo de la aplicación final (véase la Introducción para una explicación más detallada), proceda a la Sección ya sea 2.4 o 2.5.
- SDS elución de geles desnaturalizantes, transferencias Western, o espectrometría de masas:
- Resuspender la resina de cada muestra en 50 l de tampón de elución de SDS (1% de SDS y 50 mM de Tris-HCl pH 7,5)
- Agitar los tubos a TA durante 30 min.
- Centrifugar durante 2 min a 800 xg y de transferencia de los eluidos a tubos nuevos para el análisis.
- Por western blot o gel tinción de plata, carga 5-10 l en un gel desnaturalizante SDS.
- Por espectrometría de masas, guardar 40 l de cada muestra a -20 ° C.
- VET proteasa de elución para ensayos funcionales, transferencias Western, o espectrometría de masas:
- Después de quitar el último lavado, resuspender la resina en 50 l ProTEV tampón de disociación y 30 unidades de la enzima de TEV.
- Incubar a 25 ° C con agitación durante 1 hora.
- Centrifugar durante 2 min a 800 x g.
- Transferencia eluato a tubos nuevos.
- Conserve la muestra a 4 ° C para su uso inmediato en ensayos funcionales.
3.Imaging Celular de forma fluorescente etiquetadas proteínas de fusión Usando un citoplasmática y nuclear Permeable Ligando
- Transfectar, etiqueta, y celdas de imagen:
- En un cubreobjetos bien calibrada 8 para cada proteína de fusión o control, placa de 400 l de células HeLa en su soporte adecuado en cada pocillo a una densidad de 1-2 x 10 5 células / ml.
- Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, a continuación, transfectar como se recomienda.
- 18-24 horas después de la transfección, diluir TMR ligando 1:200 en medios celulares apropiadas, a continuación, añadir 100 l de esta solución a cada pocillo y mezclar suavemente.
- Se incuban las células transfectadas que contienen ligando durante 15 min a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Aspirar los medios off contienen ligando y reemplazar con 500 l de medio de comunicación adecuado que carecen de la proteína de fusión ligando etiqueta, que ha sido pre-calentado a 37 ° C.
- Repetir dos veces para un total de tres lavados.
- Ponga las células de nuevo en la incubadora (376; C y 5% de CO 2) durante 30 min.
- Aspirar fuera de los medios de comunicación y reemplazar con 500 l de los medios adecuados, que ha sido pre-calentado a 37 ° C.
- La imagen en el microscopio utilizando parámetros de adquisición apropiados (TMR excitación: 555 nm, emisión: 585 nm).
Representative Results
Al trabajar con cualquier nueva proteína de fusión, es importante primera prueba para la expresión de esa proteína después de la transfección y también validar que se está produciendo una proteína del peso molecular adecuado. Como proteínas de fusión HaloTag pueden ser fluorescentemente y marcado de manera covalente con, ligandos impermeables o permeables, dependiendo de la localización, es posible determinar rápidamente la expresión mediante la aplicación de lisados celulares para electroforesis en gel desnaturalizante seguida de escaneado en un FluorImager. Utilizando el protocolo descrito en la Sección 1.2, la expresión de Halo-BRD4 (189 kD) y el control de solo HaloTag (CTRL) es observado (34 kD, Figura 2A). Como se ha mencionado en el protocolo, la expresión de proteínas de fusión también se puede detectar usando transferencias Western tradicionales con anticuerpos anti-HaloTag, o si están disponibles, los anticuerpos para la proteína cebo. Si es posible, se recomienda utilizar el ligando fluorescente en lugar ya que es más específica, más rápido, más fácil y Tla detección de anticuerpos han, y también cuantitativa 10.
Después de verificar la expresión de la proteína de fusión de larga duración adecuada, jalones de proteínas se pueden realizar. Se muestra en la Figura 2B son los de plata manchada geles de réplicas biológicas de Halo-BRD4 y Ctrl pulldowns eluidas mediante SDS (Protocolo de la sección 2.4) que demuestran una alta reproducibilidad. Los geles con tinción de plata muestran un número significativo de proteínas se encuentran para interactuar con la proteína BRD4 y muy bajo fondo en el control (Figura 2B). Como se mencionó en la introducción, en este proceso de elución, el Halo-BRD4 no se eluye de la resina y cuando se mantenga unido covalentemente. Por lo tanto, no hay una banda significativa en este peso molecular de ser detectado en la tinción de plata (Figura 2B) o western blot (datos no mostrados). Para determinar si estas proteínas son específicas de BRD4, espectrometría de masas cromatografía de líquidos (LC-MS/MS) se realizó en la complex mezcla obtenida después de SDS elución. Se muestra en la figura 2C son recuentos espectrales y normalizada factor de abundancia espectral valores (NSAF) para interactores conocidas de BRD4 18-20 se encuentran en el análisis de espectrometría de masas de Halo-BRD4. La alta abundancia de los componentes de pTEFb 18,20 y también la proteína BRD9 19 confirmar la captura específica de los complejos BRD4. Como se predijo por los geles con tinción de plata (Figura 2B), numerosas otras proteínas también fueron identificados como potenciales interactores de BRD4 que no se observaron en el control (datos no mostrados). Como estos son hasta ahora desconocido, que necesitan para ser verificada independientemente por otras metodologías para confirmar si la proteína es un verdadero interactor, y si es así, si es directa o indirectamente asociados con BRD4.
Complejos aislados también se pueden estudiar para la actividad; se recomienda para eluir complejos usando la proteasa TEV (Protocolo Sección 2.5) para que mantengan functy. En la Figura 3A, un gel de tinción de plata de los complejos desplegables Halo-HDAC1 liberados de la resina usando la proteasa TEV se muestra. Como la proteasa TEV escindirá en una región de unión entre la etiqueta de la proteína de fusión y su compañero de fusión, cantidades significativas de la proteína cebo, en este caso HDAC1, se observó (Figura 3A). Para determinar si esta fracción contenía la actividad de HDAC1, muestras de TEV eluidas se ensayaron en un ensayo de HDAC luminiscente, HDAC-Glo 21. Como se muestra en la Figura 3B, las muestras desplegables HDAC1 mostraron altos niveles de actividad HDAC1 (columna 1), que fue inhibida específicamente por un inhibidor de HDAC conocido, SAHA 22 (columna 2). Como controles para demostrar aún más la especificidad, no se observó inhibición de HDAC con un inhibidor de la familia de las sirtuinas relacionada, EX-527 22 (columna 3) y ninguna señal se detectó usando tampón solo y sin la muestra desplegable HDAC1 añadido (Columna 4).
Un componente significativo de la funcióncol proteómica y complejos de entender, también es comprender la localización de proteínas y / o el tráfico. Como estas construcciones misma fusión pueden ser etiquetados con fluorescencia dentro de las células, que supervisó su localización utilizando la imagen confocal. Siguiendo el protocolo en la Sección 3, las células HeLa transfectadas transitoriamente con Halo-BRD4 (Figura 4A) y Halo-HDAC1 (Figura 4B) fueron marcadas fluorescentemente con el ligando TMR y la imagen. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, tanto localizado en el núcleo como se esperaba 17. Estos datos demuestran que la presencia de la etiqueta no alteró localización celular fisiológica de sus parejas de fusión.
Figura 1. Esquema de pulldown proteínas y aplicaciones de imagen confocal. Utilizando como ingle construir varias aplicaciones para la comprensión de la función de proteínas en células de mamífero son posibles. Para todo, una construcción de fusión Halo es ya sea estable o transitoriamente expresado en células de mamífero adherentes o de suspensión. Para proteínas pulldowns complejas, las células se lisan, complejos son capturadas de forma covalente en la resina, y se eluyeron a través de cualquiera SDS elución (vía izquierda) o TEV división (vía derecha). Se recomienda SDS elución para proceder a análisis de espectrometría de masas, mientras TEV división es óptimo para realizar el análisis funcional. Para la caracterización de la expresión, localización celular, eventos de tráfico, o rotación de proteínas, células vivas que expresan proteínas de fusión se marcaron fluorescentemente y analizados en geles de SDS-PAGE o el uso de imágenes confocal. Ambos ligandos fluorescentes permeables o impermeables celulares están disponibles dependiendo de la localización o la presentación de la proteína de fusión dentro de la célula.
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Figura 2. Expresión Halo-BRD4 proteínas, desplegable, y el análisis de espectrometría de masas. Geles (A) Una SDS PAGE que muestran la expresión de la proteína de Halo-BRD4 de fusión, 189 kD, y Halo etiqueta de la proteína de fusión sola, 34 kD, de control (Ctrl) dentro de un lisado celular HEK293T etiquetados con TMR ligando (Protocolo Sección 2.1). Los geles fueron escaneados con fluorimager para la detección y se utilizó un marcador fluorescente peso molecular. (B) geles de plata mancha de repeticiones biológica para jalones de muestras Halo-BRD4 y Ctrl eluidas con SDS. Tamaños peso molecular se indican para el gel. (C) recuentos espectrales (panel izquierdo) y factores de abundancia espectral normalizada valores (NSAF) (panel derecho) que representan la proteína de peso molecular de las proteínas identificadas en el análisis de espectrometría de masas de réplicas biológicas de Halo- BRD4 y Ctrl. Se muestran las proteínas conocidas para interactuar wITH BRD4, incluyendo componentes de pTEFb (CDK9 y Ciclina T) 18,20, así como BRD9 19. No hay péptidos de estas proteínas se identificaron en el Ctrl.
Figura 3. Halo-HDAC1 aislamiento compleja y análisis de la actividad. (A) geles Plata manchas que muestran el aislamiento de complejos de Halo-HDAC1 y de fondo de las teclas Ctrl después de TEV división (Protocolo de la sección 2.5). La legendaria banda de HDAC1 (55 kDa) y la banda de la proteasa TEV están etiquetados. La HDAC1 libre se genera por TEV división dentro de un enlazador optimizado entre la secuencia de fusión HaloTag y HDAC1 después de la captura en la resina (Figura 1). (B) Gráfico que muestra la actividad de HDAC1 aislamientos complejos muestras en un ensayo de histona desacetilasa luminiscente, HDAC- Glo 21. Columna 1 de la gráfica muestra una alta levels de actividad HDAC contenidas con las muestras desplegables Halo-HDAC1 (HDAC1). Columna 2 revela esta actividad se puede disminuir específicamente por la adición del inhibidor de HDAC, SAHA 22, a las muestras desplegables HDAC1. Como controles, Columna 3 demuestra un inhibidor de la histona específica a la familia sirtuin, pero no las HDAC, EX-527 22, no inhibe la actividad HDAC1 y Columna 4 muestra no se observa actividad utilizando tampón solo.
Figura 4. Halo-BRD4 y Halo-HDAC1 imagen confocal. Vivo de células de imagen confocal de células HeLa transfectadas con Halo-BRD4 (A) o halo-HDAC1 (B) marcado fluorescentemente con TMR ligando. (A) expresión de Halo-BRD4 está restringido al núcleo y (B) expresión de Halo-HDAC1 es predominantemente nuclear. El lado izquierdo de los paneles es el canal de fluorescencia y el lado derecho es una superposición del canal de fluorescencia con el canal de la CID para cada uno. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio confocal equipado con un 37 º C + CO 2 cámara ambiental usando conjuntos de filtros apropiados. Las barras de escala = 20 m.
Discussion
Aquí se presentan dos proteínas de fusión, Halo-Halo-BRD4 y HDAC1, caracterizado en células de mamíferos eucariotas para la expresión de proteínas, el aislamiento y la actividad compleja y localización celular. Al trabajar a través de estos distintos protocolos, hay varios pasos importantes para el éxito de cada experimento. Como es el caso con cualquier proteína de fusión, el nivel de expresión y la colocación de la etiqueta en sí mismo puede ser crítico para el mantenimiento de la fisiología. Por tanto, es importante tener en cuenta que será necesario fusiones C-terminales N-y / o que diseñarse si el conocimiento previo o trabajar con otra etiqueta no se ha demostrado para la proteína particular de la elección. En cuanto a la expresión, si el nivel es demasiado alto, la dilución de ADN puede llevarse a cabo durante la transfección o el uso de vectores con promotores más débiles son posibles para alcanzar el nivel que sea apropiado. Trabajos anteriores han sido realizados mostrando el aislamiento eficiente de complejos macromoleculares en endógena levels de expresión 8, lo que permite trabajar a niveles muy bajos de expresión. Si es posible, los estudios de localización celular también serían capaces de proporcionar información en cuanto a la posición óptima colocación de la etiqueta, así como el nivel de expresión relativa necesaria para la fisiología adecuada.
Una vez que las proteínas de fusión están listos para experimentos desplegables, para obtener el máximo éxito con el protocolo es muy importante seguir los plazos recomendados en la lisis, la unión, y las secciones de lavado, como una de las mayores ventajas es la velocidad del complejo de aislamiento proceso. Si cualquiera de estos pasos se alargan en el tiempo, tal como se requiere para un método de captura basada en anticuerpos, hay un riesgo de disociación complejo o el aumento de la unión no específica 8. Del mismo modo, si los tiempos se acortan durante la lisis celular o de unión, las células pueden no ser completamente lisadas o de manera eficiente capturados respectivamente. Si el número de lavados es decralivió o un buen mezclado de la resina no ocurre durante los lavados o de unión, a continuación, se aumentaron los niveles de fondo de proteínas no específicas. Además, los medios de lisis es muy importante en relación con la eficacia de la unión a la resina. Los intentos de Sonicar las muestras, quitar el detergente recomendado, añadir SDS u otro detergente fuerte, y / o incluir el AEBSF inhibidor de la proteasa se traducirá en una reducción o pérdida de la unión de las proteínas de fusión y sus complejos a la resina.
Los métodos existentes para el aislamiento del complejo a partir de células de mamíferos y lucha análisis proteómicos humanos con el reto de reducir el fondo en el análisis por espectrometría de masas 16. Esto ha sido tan significativo que un depósito de proteínas contaminantes ha sido creado por los numerosos grupos de espectrometría de masas 16. Antecedentes en muestras desplegables espectrometría de masas puede ser definido como cualquier cosa que impide la identificación de losverdaderos interactores de la proteína cebo. Como tal, el fondo puede surgir de proteínas contaminantes no específicos o también grandes concentraciones de proteína cebo o anticuerpos utilizados para precipitar las proteínas de cebo. Un trabajo significativo se hizo en la optimización tanto el protocolo desplegable que aquí se presenta, así como la resina para reducir al mínimo el nivel de las proteínas contaminantes no específicos en el proceso de despliegue. Esto es evidente en los geles con tinción de plata y el análisis de espectrometría de masas del control (Figura 2). Para hacer frente a los altos niveles de proteína cebo o anticuerpos que pueden ser igualmente perjudiciales como contaminantes y con la que otras metodologías de lucha, se recomienda el desplegable con SDS elución (Protocolo de la sección 2.4). Debido a la unión covalente a la resina, este proceso dejará la mayoría de la proteína de fusión de partida unido covalentemente a la resina. Un pequeño porcentaje de cebo se observa en el análisis de espectrometría de masas, que se creea ocurrir a través de la hidrólisis, pero no presentar un problema para la detección de otras interacciones más débiles o transitorios 8.
Como se mencionó en la introducción, los avances significativos en la proteómica se han habilitado por los avances significativos en 1,7 espectrometría de masas. Por lo tanto, es importante resaltar parámetros importantes de la elección de los análisis de espectrometría de masas para deconvolucionar la mezcla de proteínas obtenidas en los jalones. Instrumentación debe ser robusto y capaz de forma rutinaria y eficientemente el análisis de muestras que contienen una pequeña cantidad de proteína, a menudo menos de <1 mg. Cromatografía nanoescala implica 50-75 micras columnas de HPLC de diámetro interno con velocidades de flujo en el rango de 100 a 300 nl / min se emplea típicamente para la compatibilidad con los pequeños tamaños de las muestras y para maximizar la sensibilidad del espectrómetro de masas. Para maximizar la información obtenida en un estado o Análisis solaf los espectrómetros de masas de arte capaces de adquirir espectros de masas de alta resolución en escala de tiempo compatible con separaciones nanoescala antes mencionados, ≥ 10 Hz, se emplean normalmente. Estos instrumentos tienen niveles attomolar de sensibilidad y se pueden adquirir de forma rutinaria datos con precursor ppm sub e iones producto tolerancias de error de masas. Estas características de rendimiento sirven para aumentar el rendimiento de el número de proteínas identificadas y la confianza asociada con las identificaciones.
Con estos datos nos demuestran la localización fisiológica celular, proteínas adecuado: las interacciones proteína junto con el potencial para el descubrimiento de nuevas interacciones, y el aislamiento de complejos activos todo utilizando una única construcción. De hecho tecnologías alternativas se pueden utilizar para cada uno de estos diferentes aspectos, pero probablemente no para todos 23,24. Con la tecnología HaloTag, un enfoque multifuncional puede ser utilizado, avanzando proteomics estudios y obtener una comprensión más completa de la función de proteínas en células de mamífero.
Disclosures
Tasas de publicación de este artículo son patrocinados por Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy y Marjeta Urh son empleados de Promega Corporation, el dueño comercial por la cesión de las patentes de la tecnología HaloTag y sus aplicaciones. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, y David Allen son empleados de MSBioworks, que proporciona servicios de espectrometría de masas que se describen en este manuscrito.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Martin Rosenberg, el Dr. Gary Tarpley, y el Dr. Keith Wood para el apoyo de este trabajo, y el Dr. James Cali para la lectura crítica del manuscrito. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, y MU son empleados de Promega Corporation. MF, RJ, RA, y DA son empleados de MS Bioworks, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
| HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
| Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
| PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
| HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
| HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
| HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
| HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
| HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
| HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
| ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
| HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
| PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
| 4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
| Ethanol | |||
| Tissue culture vessels and dishes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
| Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
| Microcentrifuge | |||
| Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
| Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
| Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
| Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
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